Karnovskio fiksatorius apsaugo nuo artefaktų atsiradimo kaip vakuoliacijos, atsirandančios dėl audinių apdorojimo inkstuose, apdorotuose antisensiniu oligonukleotidu Ⅰ

Santrauka: Antisensinis oligonukleotidas(ASO) terapija buvo nustatyta kaip naujas gydymo būdassunkiai įveikiamos ligos. Įinkstai, gydyti ASO, vakuolės, be bazofilinių granulių, dažnai stebimos proksimaliniuose kanalėliuose. Kai kuriose ataskaitose aprašyta, kad šios vakuolės greičiausiai yra antrinis reiškinys, atsirandantis dėlASO gavybaaudinių apdorojimo metu. Šiame tyrime palyginome inkstų morfologiją po fiksavimo Karnovskio fiksatoriumi arba 4% paraformaldehido fosfato buferiu (PFA) su 10% neutralaus buferinio formaldehido tirpalo (NBF) morfologija. Buvo ištirtos Sprague-Dawley žiurkių patelės, keturis kartus į veną gydomos 50 mg/kg užrakintos nukleorūgšties, turinčios antisensinių oligonukleotidų (LNA-ASO) 1 arba 2 savaites. Mikroskopiškai NBF fiksuotuose inkstuose buvo pastebėtos vakuolės ir bazofilinės granulės proksimaliniuose kanalėliuose. Bazofilinės granulės rodo ASO kaupimąsi. Be to, kai kuriose vakuolėse taip pat buvo silpnų bazofilinių granulių, o tai rodo, kad vakuolės buvo svarbios ASO kaupimuisi. Nors proksimaliniuose kanalėliuose buvo pastebėta vidutinė vakuolizacija, imunohistocheminio dažymo metu dauguma vakuoliuotų epitelių buvo neigiami inkstų pažeidimo molekulei -1. Mėginiuose, kuriems buvo atlikta Karnovskio fiksacija, proksimaliniuose kanalėliuose vakuolių nepastebėta, nors buvo pastebėtos bazofilinės granulės. Mėginiuose, kuriuose buvo fiksuotas PFA, proksimaliniuose kanalėliuose buvo pastebėtos vakuolės ir bazofilinės granulės, panašiai kaip mėginiuose, kuriems buvo fiksuota NBF. Apskritai, mūsų išvados parodė, kad naudojant įprastą NBF fiksaciją galima pervertinti vakuoliaciją dėl audinių apdorojimo artefaktų. Karnovskio fiksatorius laikomas naudinga alternatyva norint atskirti dirbtines vakuoles nuo tikrojo nefrotoksiškumo. (DOI: 10.1293/tox.{11}}; J Toxicol Pathol 2021; 34: 367–371)

Raktiniai žodžiai:antisensinis oligonukleotidas, artefaktas,Karnovskio fiksatorius, vakuoliacija, bazofilinė granulė, inkstai

Cistanche papildas inkstų funkcijos palaikymo papildas PhGs75% Ech 30% Act 12%

Pastaruoju metu antisense oligonukleotidų (ASO) terapija buvo sukurta kaip naujas būdas gydyti sunkiai gydomas ligas1, 2. ASO yra trumpi, sintetiniai, vienagrandžiai oligodeoksinukleotidai, kurie jungiasi prie ribonukleino rūgšties ir slopina genų ekspresiją3.

Toksikologiniu požiūriu ASO sukeltas toksiškumas skirstomas į nuo hibridizacijos priklausomą toksiškumą, kuris yra susijęs su ASO seka, ir nuo hibridizacijos nepriklausomą toksiškumą, kuris yra susijęs su chemine modifikacija. Nuo hibridizacijos nepriklausomą toksiškumą sukelia trys pagrindiniai mechanizmai: 1) ASO kaupimasis, 2) priešuždegiminis poveikis ir 3) aptamerinis surišimo poveikis4. ASO kaupimasis pirmiausia stebimas kepenyse ir inkstuose, o per didelis kaupimasis sukelia šių organų disfunkciją5. Priešuždegiminį poveikį sukelia įgimtos imuninės sistemos stimuliavimas jungiantis prie Toll panašių receptorių graužikams ir beždžionėms arba suaktyvinant alternatyvų komplemento kelią, slopinant H faktorių ASO beždžionėms6. Aptamerinis surišimo efektas skatina trombocitų aktyvaciją ir agregaciją/trombocitopeniją, kad prisijungtų prie trombocitams būdingų receptorių7. Be to, aptamerinis prisijungimas prie intracelulinių baltymų hepatocituose laikomas viena iš hepatotoksiškumo priežasčių8–10. Norėdami nustatyti šį toksiškumą, mokslininkai sukūrė keletą neklinikinių tyrimų; tarp jų histopatologinis tyrimas yra vienas jautriausių ASO kaupimosi nustatymo tyrimų.

Histopatologiškai ASO kaupimasis dažniausiai stebimas kaip bazofilinės granulės Kupfferio ląstelių citoplazmoje kepenyse arba proksimaliniuose inkstų kanalėliuose. Ryškus bazofilinių granulių kaupimasis koreliuoja su padidėjusiu degeneracinių pokyčių dažniu ar sunkumu, dažniausiai stebimu kaip inkstų proksimalinio kanalėlių epitelio vakuolizacija arba degeneracija/nekrozė4. Vien bazofilinės granulės nėra laikomos toksikologiškai reikšmingomis11; todėl bazofilinių granulių kaupimosi diferencijavimas nuo degeneracinių pokyčių yra svarbus vertinant su ASO susijusį toksiškumą.

Vakuolėse, kurios dažnai stebimos ASO gydomų cynomolgus beždžionių inkstų proksimaliniuose kanalėliuose, yra bazofilinės medžiagos ir jų bendras pasiskirstymas ląstelėse yra toks pat kaip bazofilinės granulės11, 12. Keli pranešimai rodo, kad fiksavimo procesas gali turėti įtakos ASO kaupimosi fagolizosominiame skyriuje atsiradimas5, 11. Be to, Henry ir kt. ir Engelhardt aprašė, kad vakuolės proksimaliniuose kanalėliuose greičiausiai yra antrinis reiškinys, atsirandantis dėl ASO ekstrahavimo apdorojimo metu, nes vakuolių nėra paraformaldehido/glutaraldehido perfuzijos fiksuotuose inkstuose5, 11. Vakuolės proksimaliniuose kanalėliuose beždžionių gydytų cynomolgus Spėjama, kad su mipomersenu gali atsirasti fiksavimo proceso metu13.

Taigi, nors kai kuriais atvejais vakuolizacija dėl gydymo ASO gali būti artefaktas, ši hipotezė nebuvo aiškiai įrodyta ir jokiose ataskaitose nenustatytas tinkamas fiksavimo metodas toksikologiniam įvertinimui. Atitinkamai, šiame tyrime palyginome inkstų morfologiją po fiksavimo Karnovskio fiksatoriumi arba 4% paraformaldehido fosfato buferiu (PFA) su 10% neutralaus buferinio formaldehido tirpalo (NBF) morfologija. Be to, mes pademonstravome Karnovskio fiksatoriaus, kaip alternatyvaus fiksatoriaus, naudingumą siekiant užkirsti kelią artefaktų atsiradimui.

Keturių savaičių Sprague-Dawley žiurkių patelės buvo įsigytos iš Charles River Laboratories Japan Inc. (Kanagawa, Japonija) ir aklimatizuotos prie laboratorinių sąlygų. Gyvūnai buvo laikomi kontroliuojamomis sąlygomis (12-valandų šviesos/tamsos ciklas, temperatūra 23 ± 2 laipsniai, santykinė oro drėgmė 50 ± 25 %) ir jiems buvo leista laisvai valgyti standartinę komercinę dietą (autoklavuotas CR-LPF; Oriental Yeast Co., Ltd., Tokijas, Japonija) ir vandentiekio vandenį. Dvidešimt gyvūnų buvo suskirstyti į šias keturias grupes (po penkis gyvūnus): 1-savaitę gydytų fiziologiniu tirpalu grupė (kontrolinė- 1W), 2-savaitė fiziologiniu tirpalu gydyta grupė (kontrolinė {14}}W), 1-savaitė užrakinta nukleorūgštis, turinti antisensinio oligonukleotido (LNA-ASO) apdorota grupė (ASO-1W), ir 2-savaitė LNA ASO apdorota grupė (ASO-2W). Pradėjus vartoti 50 mg/kg LNA-ASO, gyvūnai buvo 5 savaičių amžiaus. LNA-ASO buvo švirkščiamas į veną iš viso keturis kartus pagal šį režimą: 1, 4, 8 ir 11 dienomis ASO-2W grupėje; ir 1, 2, 3 ir 4 dienos ASO-1W grupėje. Kontrolinės-1W ir ASO-1W grupių gyvūnai buvo numarinti 7 dieną. Kontrolinės-2W ir ASO-2W grupių gyvūnai buvo numarinti dieną. 14. Kiekvienos galutinio skrodimo metu buvo paimti kraujo mėginiai klinikinei patologijai nustatyti iš pilvo tuščiosios venos, taikant giliąją anesteziją izofluranu. Po kraujo mėginių paėmimo visos žiurkės buvo eutanazuotos nuleidus kraują, nedelsiant perpjaunant pilvo aortą. Makroskopiškai ištirtas išorinis kūno paviršius, krūtinės ir pilvo ertmės, vidaus organai, pašalinti kairieji inkstai ir apdoroti mikroskopiniam tyrimui. Visos procedūros buvo atliktos pagal Mitsubishi Tanabe Pharma Corporation eksperimentinių gyvūnų šėrimo ir laikymo bei eksperimentų su gyvūnais taisykles.

Serumo mėginiai buvo paimti centrifuguojant kraujo mėginius 4 laipsnių kampu. Serumo biocheminė analizė buvo atlikta naudojant TBA-2000FR instrumentą (Canon Medical Systems Corporation, Tochigi, Japonija), siekiant įvertinti karbamido azoto (BUN) ir kreatinino (CRE) kiekį kraujyje.

Inkstai buvo fiksuoti naudojant tris fiksuojančius tirpalus taip: Padalijus inkstą skersai į tris segmentus, vidurinė dalis, įskaitant inkstų dubenį, buvo fiksuota 10% NBF 5 dienas; kaukolės dalis buvo fiksuota Karnovskio fiksatoriumi (Muto Pure Chemicals Co., Ltd., Tokijas, Japonija); uodegos dalis buvo fiksuota 4% PFA 17 valandų 4 laipsnių temperatūroje, o po to 24 valandoms dedama į 10% NBF. Kiekvienas fiksuotas mėginys buvo dehidratuotas ir įterptas į parafiną. Audinių sekcijos buvo paruoštos dažymui hematoksilinu ir eozinu (H&E). Imunohistocheminis dažymas buvo atliktas naudojant antikūnus, nukreiptus į inkstų pažeidimo molekulę-1 (KIM-1; R&D Systems Inc., Mineapolis, MN, JAV; praskiedimas 1:300) ir su lizosomomis susijusį membranos baltymą 2 (LAMP{{) 13}}, Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA, JAV) po antigeno paėmimo (citratinis buferis, pH 6,0, kaitinamas 10 min. arba kaitinamas slėgyje 20 min.); Kaip antrinis antikūnas buvo naudojamas Histofine Simple Stain Rat MAX PO (Nichirei Biosciences Inc., Tokijas, Japonija).

Pagalbinė Wecistanche tarnyba:

El. paštas:wallence.suen@wecistanche.com

WhatsApp / Tel.:+86 15292862950

Įsigykite daugiau specifikacijų:

https://www.xjcistanche.com/cistanche-parduotuvė