Kv1.3 slopinimas susilpnina neurouždegimą, sutrikdydamas mikroglijos kalcio signalus

SANTRAUKA

Per pastaruosius 5 metus buvo įrodyta, kad kalio kanalo KV1.3 inhibitoriai sumažino neurouždegimą graužikų modeliuose, sergant išeminiu insultu, Alzheimerio liga, Parkinsono liga ir trauminiu smegenų pažeidimu. Sisteminiu lygmeniu šie naudingi veiksmai yra susiję su mikroglijų aktyvacijos sumažėjimu ir priešuždegiminių citokinų bei azoto oksido gamybos slopinimu.

Tačiau KV1.3 blokatorių slopinamojo poveikio priešuždegiminėms mikroglijų funkcijoms molekuliniai mechanizmai nebuvo žinomi, kol mūsų grupė neseniai neįrodė, kad KV1.3 kanalai ne tik reguliuoja membranos potencialą, kaip būtų galima tikėtis iš įtampos priklausomo kalio kanalo. , bet taip pat atlieka lemiamą vaidmenį leidžiant mikroglijoms atsispirti depoliarizacijai, kurią sukelia pavojaus signalas ATP, taip reguliuojant kalcio antplūdį per P2X4 receptorius. Čia apžvelgiame KV1.3 vaidmenį mikroglijos signalizacijoje ir parodome, kad, kaip ir jų vaidmuo T ląstelėse, KV1.3 kanalai taip pat reguliavo parduotuvėje valdomą kalcio antplūdį mikroglijoje.

Kalio kanalas KV1.3 yra jonų kanalas, plačiai ekspresuojamas imuninėse ląstelėse, kuris atlieka svarbų vaidmenį reguliuojant ląstelių membranų potencialą, ląstelių migraciją ir imuninių ląstelių funkciją. Naujausi tyrimai rodo, kad junginiai, slopinantys kalio kanalą KV1.3, gali padėti sustiprinti organizmo imunitetą.

Imuninės sistemos reguliavimas yra svarbi geros sveikatos palaikymo dalis. Tačiau daugelis ligų, tokių kaip autoimuninės ligos, vėžys ir infekcinės ligos, sukelia imuninės sistemos sutrikimą. Todėl mokslininkai ieško būdų, kaip stiprinti imunitetą. Naujausi tyrimai rodo, kad kalio kanalo KV1.3 inhibitoriai gali būti perspektyvus pasirinkimas.

Imuninėse ląstelėse kalio kanalas KV1.3 reguliuoja membranos potencialą, taip paveikdamas ląstelių funkciją. Tyrimo metu nustatyta, kad slopinant kalio kanalą KV1.3, buvo galima sumažinti T ląstelių migraciją ir toliau neleisti joms atakuoti sveikų ląstelių, taip apsaugodama imuninę sistemą nuo nereikalingo sunaikinimo.

Be to, kai kuriais eksperimentais nustatyta, kad kalio kanalo KV1.3 slopinimas taip pat gali skatinti kitus imuninės sistemos aspektus. Pavyzdžiui, tyrimais įrodyta, kad slopinant šį kanalą galima pagerinti imuninių ląstelių kokybę ir kiekį, taip padidinant organizmo atsparumą patogenams ir kitoms išorinėms grėsmėms. Todėl kalio kanalo KV1.3 slopinimas gali būti veiksmingas būdas stiprinti imunitetą.

Apibendrinant, dabartinis tyrimas rodo, kad kalio kanalo KV1.3 slopinimas gali būti perspektyvus būdas pagerinti imuninės sistemos funkciją ir padidinti bendrą organizmo imunitetą. Tačiau nors šios išvados yra daug žadančios, reikia atlikti tolesnius tyrimus, siekiant nustatyti šio metodo saugą ir pagrįstumą. Šiuo požiūriu turime stiprinti savo imunitetą. Cistanche gali žymiai pagerinti imunitetą. Mėsos pelenuose yra įvairių biologiškai aktyvių ingredientų, tokių kaip polisacharidai, du grybai ir Huang Li, kurie gali stimuliuoti imuninę sistemą. įvairių tipų ląsteles, didindamos jų imuninį aktyvumą.

Spustelėkite cistanche naudą sveikatai

Įvadas

Nuo įtampos priklausomas kalio kanalas KV1.3 iš pradžių buvo aprašytas T ląstelėse [1], o vėliau buvo naudojamas kaip T-ląstelių sukeliamų autoimuninių ligų, tokių kaip išsėtinė sklerozė, reumatoidinis artritas ir psoriazė, gydymo tikslas [2–4]. Visai neseniai KV1.3 tapo patraukliu farmakologiniu taikiniu, mažinančiu vadinamąjį „neuro uždegimą“, moduliuojant mikroglijos aktyvaciją. Mes ir kiti įrodėme, kad tiek pelių, tiek žiurkių išeminio insulto modeliuose KV1.3 blokatoriai sumažina infarkto plotą ir pagerina neurologinį deficitą [5,6]. Transgeniniuose Alzheimerio ligos pelių modeliuose KV1.3 blokada sumažino smegenų amiloido apkrovą, padidino hipokampo neuronų plastiškumą ir pagerino elgesio trūkumus [7].

Panašiai keliuose Parkinsono ligos gyvūnų modeliuose mažos molekulės KV1.3 blokatorius PAP-1 slopino dopaminerginių neuronų degeneraciją ir pagerino elgesio rezultatus [8]. Įrodyta, kad KV1.3 slopinimas arba genetinė delecija pagerina baltosios medžiagos patologiją po trauminio smegenų pažeidimo [9], pooperacinio pažinimo nuosmukio [10] ir radiacijos sukelto smegenų pažeidimo [11]. Visuose šiuose neurologinių ligų gyvūnų modeliuose buvo pastebėta padidėjusi KV1.3 ekspresija ant su patologija susijusių mikroglijų, o gydymas KV1.3 blokatoriais sumažino mikroglijų aktyvaciją ir sumažino uždegiminių citokinų kiekį gyvūnų smegenyse.

Atrodo, kad su liga susijusi padidėjusi KV1.3 ekspresija pasireiškia žmonėms, nes stipri KV 1.3 ekspresija taip pat buvo aptikta pomirtinėse žmogaus smegenyse mikroglijose infarkto vietose po išeminio insulto [5,12], mikroglijose, supančiose amiloidines plokšteles sergant Alzheimerio liga. 7, 13], o sergant Parkinsono liga – mikroglijų prefrontalinėje žievėje ir juodąją medžiagą [8]. Apibendrinant, šie padrąsinantys atradimai žmonių ir gyvūnų modeliuose tvirtai rodo, kad mikroglijos KV1.3 kanalai yra terapinis taikinys, skirtas sumažinti žalingą uždegiminį atsaką smegenyse. Bet kaip veikia KV1.3 blokatoriai? Kaip blokuojant nuo įtampos priklausomą kalio kanalą mikroglijose ir, greičiausiai, taip pat į smegenis įsiskverbiančius monocitų kilmės makrofagus, sumažėja uždegiminių citokinų gamyba ir uždegimo sukeliami audinių pažeidimai?

KV1.3 blokatorių poveikis mikroglijos funkcijai

Įrodyta, kad išaugintos naujagimių pelių ir žiurkių mikroglijos, taip pat ūmiai išskirtos mikroglijos iš pelių smegenų arba iš žiurkės smegenų audinių atspausdintos mikroglijos išreiškia KV1.3 sroves, naudojant visos ląstelės pleistrą, kurios žymiai padidėja po stimuliacijos in vitro arba in vivo intracerebroventrikulinė injekcija su TLR-4 ligandu lipopolisacharidu (LPS) [14–18]. Stimuliavimas su gramneigiamu ląstelės sienelės komponentu LPS plačiai naudojamas norint sukelti „klasikiškai“ aktyvuotą „M1-panašų“ mikroglijos būseną, imituojančią bendrą uždegimą, susijusį su bakterine infekcija [19,20]. Neuroimunologijos srityje LPS stimuliuojama mikroglija idealiu atveju turėtų būti vadinama M(LPS) mikroglija, remiantis stimulu, naudojamu poliarizacijai sukelti, kad būtų išvengta M1/M2 terminijos, kuri laikoma pernelyg supaprastinta [21], tačiau plačiai naudojama dėl savo gydomųjų savybių. patrauklumą.

Po stimuliacijos LPS galima pastebėti padidėjusią KV1.3 ekspresiją mRNR ir baltymų lygiu Western blot metodu, imunohistochemija ir padidėjusį srovės tankį, išmatuotą visos ląstelės patch-clamp [15–18]. Panašus, bet šiek tiek ne toks intensyvus Kv1.3 ekspresijos padidėjimas atsiranda, kai kultivuotos naujagimių mikroglijos yra stimuliuojamos oligomeriniu amiloidiniu (AO) arba -sinukleinu [7,8] – dviem baltymais, kurie yra netinkamai susilankstę ir agreguojami sergant Alzheimerio ar Parkinsono liga, ir kurie dažnai naudojami kuriant su atitinkama liga susijusių mikroglijų atsakų in vitro modelį.

Šių tipų in vitro sistemose KV1.3 slopinimas arba genetinė delecija sumažina daugelio uždegiminių mediatorių ekspresiją ir gamybą, išmatuotą praėjus 24- arba 48- valandoms po mikroglijos aktyvacijos. Maždaug prieš 20 metų Lyanne Schlichter laboratorija pranešė, kad KV1.3 inhibitoriai slopina forbolio esterio stimuliuojamą kvėpavimo sprogimą [22] ir NO gamybą kultivuotose naujagimių žiurkių mikroglijose, taip sumažinant mikroglijų sukeliamą neuronų žūtį transwell kultūros sistemoje [16].

Naujausiame mūsų laboratorijos tyrime [17], kuriame buvo lyginamas KV1.3 ir KCa3.1 blokatorių poveikis su plačiai naudojamu mikroglijos inhibitoriumi minociklinu diferencijuotai poliarizuotoms naujagimių pelių mikroglijoms, pastebėjome, kad Kv1.3 slopinimas sumažino ekspresiją ir gamybą. priešuždegiminių citokinų IL-1 ir TNF- 24 ir 28 valandas ir užkirto kelią su uždegimu susijusių fermentų ciklooksigenazės2 (COX-2) ir indukuojamos azoto oksido sintazės (iNOS) reguliavimui. Pastarasis poveikis tikriausiai buvo atsakingas už sumažėjusią NO gamybą, pastebėtą mikroglijose, gydomose KV1.3 inhibitoriais, praėjus 24 ir 48 valandoms po LPS stimuliacijos. Panašiai kaip ir ankstesniame darbe, mes taip pat pastebėjome, kad KV1.3 inhibitoriai apsaugo nuo mikroglijų sukeliamo neuronų žudymo organotipinėse hipokampo pjūvių kultūrose praėjus 3 dienoms po to, kai mikroglijos buvo aktyvuotos per 1-valandą hipoksijos / glikemijos, kad būtų imituojamas išeminis insultas [5] arba gydant oligomeriniu amiloidu, kad būtų imituojamas mikroglijos aktyvavimas sergant AD [7].

Nustatyta, kad KV1.3 inhibitorius PAP-1 ne tik sumažina AO sukeltą mikroglijų aktyvaciją – reiškinį, kuris gali būti aiškiai parodytas dažant mikroglijas CD11b arba Iba-1 ir įvertinus fluorescencijos intensyvumą O sukeltas mikroglijų sukeltas ilgalaikio potencijos (LPT) pažeidimas hipokampo pjūviuose ir sumažinti A O sukeltą IL-1, TNF ir NO gamybą auginamose pelių mikroglijose [7], labai panašus su tuo, kas buvo nustatyta KV1.3 inhibitoriams su LPS stimuliuojama mikroglia [17,18]. Eksperimentuose, kuriuose išaugintos naujagimių pelių mikroglijos iš laukinio tipo ir KV1.3-/- pelių buvo stimuliuojamos agregatiniu-sinukleinu (SynAgg), kuris aktyvuoja mikrogliją, prisijungdamas prie modelio atpažinimo receptorių TLR2 ir CD36 [23], abu farmakologiniai KV1. 3 slopinimas PAP-1 ir genetinis kanalo ištrynimas sumažino IL-1, IL-6, IL-12 ir TNF gamybą ir neleido NLRP3 uždegiminio baltymo reguliuoti 24 m. valandos po mikroglijos stimuliacijos [8]. Ir atvirkščiai, per KV 1.3 ekspresija mikroglijų ląstelių linijoje padidino SynAgginduced IL-1, TNF-, IL-6 ir IL-12 ekspresiją arba sekreciją praėjus 24 valandoms po stimuliacijos [8].

Įvairūs kitų grupių tyrimai patvirtino, kad KV1.3 blokatoriai sumažina priešuždegimines mikroglijos funkcijas, kai naudojami panašūs dirgikliai arba dirgikliai, susiję su kitomis uždegiminėmis patologijomis. Pavyzdžiui, kultivuotose žiurkių mikroglijose, aktyvuotose ŽIV Tat baltymu arba glikoproteinu 120 (gp120), kad būtų imituojamas su ŽIV{5}}susijęs neurokognityvinis sutrikimas, nustatyta, kad KV1.3 slopinimas arba numušimas naudojant siRNR sumažina IL-1 , TNF- ir NO gamyba bei slopinamas neurotoksiškumas [24,25]. Naudojant išeminio insulto ir deguonies / gliukozės trūkumo iš kultivuotų mikroglijų modelį Ma ir kt. pranešė, kad KV1.3 slopinimas pakeitė mikroglijos fenotipą iš priešuždegiminio M1-panašaus į M2-panašų atsaką ir sumažino NLRP3 uždegiminį aktyvavimą [5,6], panašiai kaip aukščiau aprašytuose tyrimuose. Parkinsono ligos modeliuose [8].

Naudojant šviežiai išskirtas CD11b plius ląsteles, kurias sudaro ir CNS infiltruojantys makrofagai, ir smegenyse gyvenančios mikroglijos iš pelių, kurios buvo sistemiškai gydomos LPS, esant ir nesant KV1.3 blokuojančio peptido ShK-223, smegenų, Rangaraju. ir kt. patvirtino, kad KV 1.3 slopinimas sumažina uždegiminių citokinų, tokių kaip IL-1, ekspresiją, bet parodė, kad KV1.3 slopinimas taip pat sumažino TAP1 ekspresiją ir neleido padidinti EHD1 reguliacijos CD11b ir CD45 mažos mikroglijos, matuojant srauto citometrija [26]. Tiek TAP1, tiek EDH1 yra baltymai, dalyvaujantys MHC I klasės surinkime ir judėjime į ląstelės paviršių. Todėl autoriai toliau ištyrė gydymo ShK-223 poveikį MHC klasės-1 ekspresijai ūmiai izoliuotoje mikroglijoje ir, remdamiesi sumažėjusia MHC ekspresija, iškėlė hipotezę, kad LPS sukeltas antigenų pateikimo gebėjimas padidėti. mikroglijos yra nuo KV 1.{22}}priklausomi procesai, o tai rodo, kad KV1.3 slopinimas gali sumažinti antigeno pateikimą CD8 ir citotoksinėms T ląstelėms.

Atliekant vėlesnę svertinę koekspresijos tinklo analizę, taikomą mikroglijos transkriptominiams duomenų rinkiniams iš neurouždegiminių ir neurodegeneracinių ligų pelių modelių, ta pati grupė nustatė KV1.3 kaip priešuždegiminio geno parašo dalį, kuri taip pat apėmė Tlr2, Ptgs2, Il12b, Il1b, CD44, NFκB, Stat1 ir RelA [27]. KV1.3 blokada naudojant ShK-223 gali pakeisti šį priešuždegiminį požymį į tokį, kuris padidintų priešuždegiminių genų ekspresiją su liga susijusioje mikroglijoje. Šiame kontekste įdomu tai, kad kituose tyrimuose buvo pranešta, kad Kv1.3 inhibitoriai dar labiau padidina išaugintų mikroglijų, stimuliuojamų priešuždegiminiais citokinais IL-4 ir IL-10, migraciją [28]. ir nepaveikti mikroglialinės mikrogranulių fagocitozės [26] ar net padidinti amiloido fagocitozę [7].

Apskritai, yra daug įrodymų, kad mikroglijos ekspresuoja KV1.3 ir kad KV1.3 blokatoriai slopina priešuždegimines, neurotoksines mikroglijos funkcijas ir netgi gali pakeisti mikrogliją link labiau neuroprotekcinio fenotipo. Čia daugiausia dėmesio skyrėme duomenims, gautiems naudojant kultivuotas mikroglijos ar griežinėlių kultūras, apibendrinimą, nes šiose redukcionistinėse sistemose neabejotina, kad išmušimas, numušimas arba farmakologinė blokada veikia tiesiogiai slopindami mikroglijos KV1.3 kanalus, o ne netiesiogiai paveikdami. KV1.3 kanalai T ląstelėse, B ląstelėse, dendritinėse ląstelėse arba monocituose, kurie visi ekspresuoja KV1.3 [29], todėl gali prisidėti prie KV1.3 blokatorių poveikio in vivo arba KV1.3-/- radinių. pelėms. Tačiau čia norėtume atkreipti dėmesį į tai, kad be daugybės tyrimų, rodančių KV1.3 ekspresiją graužikų ir žmonių mikroglijose imunohistochemijos metodu, Kettenmann laboratorija ir mūsų grupė ne kartą parodė, kad padidėjusi KV1.3 raiška ant aktyvuotos mikroglijos yra ne tik audinių kultūros reiškinys ir kad Kv1.3 srovės gali būti registruojamos iš mikroglijų ūmių pjūvių [30, 31] ir iš ūmiai izoliuotų mikroglijų iš 5xFAD pelių smegenų [7] arba iš infarkto srities po vidurinės smegenų arterijos okliuzijos [5, 12], išeminio insulto modelis.

Signalizacijos keliai, paveikti KV1.3 slopinimo arba Kv1.3 ekspresijos moduliavimo

Tyrimai, tiriantys signalizacijos kelius (1 pav.), kuriuos veikia KV1.3 blokatoriai, kad po 24 ar 48 valandų būtų pasiektas teigiamas priešuždegiminių mikroglijų funkcijų sumažėjimas, davė šiek tiek prieštaringų rezultatų, o tai rodo, kad KV1.3 blokatorių poveikis priklauso. dėl stimulo ir galbūt rūšies. Nors Fordyce ir kt. pranešė, kad KV1.3 blokatoriai neturi įtakos p38MAPK fosforilinimui LPS gydytų naujagimių žiurkių mikroglijose [16], keli kiti tyrimai, naudojant pelių mikroglijas, nustatė, kad KV1.3 blokatoriai stipriai sumažina p38MAPK fosforilinimą ir NF-κB aktyvavimą po stimuliacijos LPS, AO, SynAgg arba ŽIV-1 glikoproteinas 120 [7,8,24]. Taip pat įrodyta, kad mikroglijų ląstelių linijoje BV2 KV1.3 reguliuoja STAT1 S727 fosforilinimą [26]. Įdomu tai, kad ar KV1.3 blokatoriai slopina NFAT translokaciją, vienas geriausiai ištirtų KV1.3 blokatorių poveikių T ląstelėse [2,32,33] iki šiol nebuvo ištirtas mikroglijose.

Atrodo, kad KV1.3 ekspresijos padidėjimas po mikroglijų stimuliavimo LPS, AO arba SynAgg apima daugelį tų pačių signalizacijos kaskadų, kurios yra paveiktos KV1.3 slopinimo, o KV1.3 blokatoriai paprastai užkerta kelią Kv1.3 ekspresijos padidėjimui. KV1.3 promotoriuje yra daug NF-κB ir SP1 surišimo vietų ir NF-κB arba p38MAPK inhibitoriai nepriklausomai sumažina SynAgg stimuliuojamą Kv1.3 reguliavimą mikroglijoje [8], parodydami, kad tiek p38MAPK, tiek klasikiniai NF-κB keliai tarpininkauja KV1.3 transkripcijos reguliavimui (1 pav.). Src šeimos kinazė Fyn veikia prieš NF-κB transkripcijos faktorių, reguliuodama savo komponento p65 [34] branduolio translokaciją ir fosforilindama PKC izoformą PKCδ. Sarkar ir kt. pranešė, kad Fyn nokautas sumažina tiek LPS, tiek SynAgg sukeltą KV1.3 srovės tankio padidėjimą kultivuotose mikroglijose – poveikį, kurį galima imituoti apdorojant mikrogliją Fyn inhibitoriumi saracatinibu arba PKCδ trūkumu, o tai rodo, kad Fyn / PKCδ kinazės signalizacija kaskada dalyvauja tarpininkaujant KV1.3 reguliavimui, reaguojant į uždegiminius dirgiklius [8]. Kaip parodyta Duolink proximity ligation tyrime, Fyn tiesiogiai sąveikauja su Kv1.3 ir fosforilina Y135 kanalą, kad padidintų jo aktyvumą.

Kv1.3 reguliuoja membranos potencialą ir priešinasi depoliarizacijai

Nepaisant aukščiau aprašyto gerai dokumentuoto KV1.3 blokatorių gerinamojo poveikio neurouždegimui in vivo ir mikroglijų signalizacijos kaskadoms bei uždegiminių mediatorių ekspresijai ir sekrecijai in vitro, pagrindiniai molekuliniai mechanizmai, kaip KV1.3 blokatoriai veikia mikroglijos funkcijas, buvo ilgai neaiškūs. Daugelis tyrėjų, įskaitant mūsų laboratoriją, tiesiog manė, kad KV1.3 atlieka tą pačią funkciją mikroglijose, kurią jis atlieka T ląstelėse, ty reguliuoja membranos potencialą ir kalcio antplūdį [29, 32, 33].

T ląstelėse KV1.3 slopinimas sukelia membranos depoliarizaciją ir sumažina kalcio antplūdį per kalcio išsiskyrimą suaktyvintus kalcio kanalus (CRAC) po T ląstelių receptorių stimuliacijos [33, 35, 36]. Kalcio patekimas per CRAC kanalus yra labai svarbus defosforilinimui ir vėlesniam nuo kalcio / kalmodulino priklausomo transkripcijos faktoriaus NFAT [29], kuris sukelia citokino IL-2 transkripciją [29, 33], perkėlimui į branduolį. IL-2 išsiskiria iš aktyvuotų T ląstelių sintezės metu ir stimuliuoja T ląstelių klonų plėtrą autokrininiu ir parakrininiu būdu. Slopindami kompensuojamąjį kalio nutekėjimą, kuris yra būtinas palaikyti kalcio antplūdį per CRAC kanalus, KV1.3 blokatoriai sutrikdo T ląstelių aktyvaciją, užkerta kelią NFAT defosforilinimui ir branduolio translokacijai [32], dėl to sumažėja T ląstelių proliferacija ir uždegiminių citokinų gamyba bei sekrecija po 48 valandų. [5,33,35,36].

Tačiau jis niekada nebuvo išbandytas mikroglijose, kurios, skirtingai nei T ląstelės, taip pat išreiškia vidinį lygintuvą Kir2.1 [17,37,38] ir dviejų porų kalio kanalą THIK-1 (K2P 13.1) [39], ar KV1.3 blokatoriai turėtų tokį patį molekulinį poveikį, ar KV1.3 vaidmenį perimtų šie kiti kalio kanalai. Neseniai atliktame tyrime mūsų grupė atitinkamai sprendė šį klausimą, pirmiausia iš naujo išnagrinėdama esminę KV1.3 reikšmę palaikant ramybės membranos potencialą ir atsispiriant depoliarizacijai [40]. Kaip ir tikėtasi, per didelė KV1.3 ekspresija CHO ląstelėse sumažino paprastai labai depoliarizuotą šių ląstelių ramybės membranos potencialą nuo –20 mV iki –50 mV, o KV1.3 slopinimas ShK-223 depoliarizuota mikroglija, kuri iš prigimties palaiko labiau hiperpoliarizuotas ramybės membranos potencialas, kuris mūsų rankose vidutiniškai buvo apie –90 mV nediferencijuotose mikroglijose, daugiausia ekspresuojančiose Kir2.1, ir apie –65 mV LPS stimuliuojamose mikroglijose, išreiškiančiose didesnį KV1.3 ir mažesnį Kir2.1 srovės tankį [40].

Nors KV1.3 neabejotinai prisideda prie ramybės membranos potencialo reguliavimo mikroglijoje (2 pav.), manome, kad jo svarbesnis vaidmuo ir priežastis, kodėl Kv1.3 ekspresija padidėja aktyvintoje mikroglijoje, yra kanalo gebėjimas kompensuoti ekstremalias ir užsitęsusias problemas. membranos depoliarizacija, kuri gali neigiamai paveikti mikroglijos sveikatą ir fiziologiją, kaip parodė dabartiniai injekcijos eksperimentai. Nors srovės 25 pA injekcijos nepajėgia depoliarizuoti KV 1.3, ekspresuojančios daugiau nei –30 mV mikroglijos, jei nėra blokatorių, mikroglijos, iš anksto apdorotos KV 1.3 blokatoriais, depoliarizuojasi iki plius 50 mV potencialo, reaguodamos į tas pačias 25 pA srovės injekcijas [40] , o tai rodo, kad KV1.3 gali „užspausti“ membranos potencialą arti kanalo aktyvavimo slenksčio potencialo, kad būtų išvengta per didelės membranos depoliarizacijos (2 pav.).

Mikroglijos fiziologijos situacija yra svarbi, kai mikroglijos yra veikiamos tarpląstelinio ATP, pavojaus signalo, kuris gali pasiekti aukštą mikromolių koncentraciją dėl citozolinio ATP išsiskyrimo iš pažeistų neuronų arba ATP turinčių sinaptinių pūslelių [41], kurios aktyvuoja P2X receptorių kanalus ir sukelia intensyvias depoliarizacijas [42]. Mūsų pačių rankose dabartiniai gnybtų eksperimentai, atlikti su nediferencijuotomis ir LPS stimuliuotomis mikroglijomis, parodė, kad ūminis 100 μM ATP poveikis, kuris iš P2X receptorių, išreikštų mikroglijoje, pirmiausia aktyvuoja P2X4, sukelia ryškesnes nediferencijuotų mikroglijų depoliarizacijas, nepaisant jų daugiau. hiperpoliarizuotas ramybės membranos potencialas nei KV1.3 aukšto LPS stimuliuojamose mikroglijose, kurios nedepoliarizavosi virš –40 mV. KV1.3 blokatoriai susilpnino šį gebėjimą atsispirti ATP sukeltai depoliarizacijai ir mikroglijų depoliarizacijai esant jiems [40].

KV1.3 moduliuoja P2X4 receptorių sukeltą kalcio antplūdį mikroglijoje

Kalcio vaizdavimo eksperimentai atskleidė, kad šis KV1.3 kanalų gebėjimas atsispirti ATP sukeltai P2X4- sąlygojamai depoliarizacijai padidina Ca2 ir patekimą į mikrogliją per P2X4 receptorius, stimuliuojamus 100 μM ATP [40]. Pavyzdžiui, mes pastebėjome, kad KV1.3 blokatoriai ShK-223 ir PAP-1 sumažino ATP sukeltą Ca2 plius antplūdį per P2X4 receptorius LPS diferencijuotose mikroglijose, kurios išreiškia didelį KV1.3 srovės tankį, daug daugiau. stipriau nei nestimuliuotose mikroglijose, nors LPS stimuliacija sumažina P2X4 receptorių ekspresiją auginamose mikroglijose. Priešingai, KV1.3 blokada neturėjo įtakos ATP sukeltam kalcio pereinamiesiems procesams IL-4 stimuliuojamose mikroglijose, kurios išreiškia labai žemą KV1.3 lygį. Įdomu tai, kad nors LPS taip pat padidina KV1.3 ir sumažina P2X4 ekspresiją ant mikroglijų in vivo, tiek KV1.3, tiek P2X4 ekspresija lygiagrečiai didėja išeminio insulto atveju, kaip parodė mūsų laboratorija, tirianti ūmiai izoliuotas mikroglijas iš infarkto patyrusio pelių smegenų pusrutulio. patyrę išeminį insultą ir kitos grupės graužikų ir žmogaus mikroglijų imunohistochemijos arba qPCR metodu [5,12,43–46]. Tai rodo, kad po išeminio insulto KV1.3 gali stipriau nei in vitro reguliuoti sudėtingesnį purinerginį mikroglialinį kalcio signalą, kurį inicijuoja pavojaus signalas ATP. ATP ir kitos neuronų liekanos infarkto pažeistoje smegenų srityje suaktyvina mikrogliją, kuri vėliau per 24–72 valandas nuolat gamina ir išskiria daugiau uždegiminių mediatorių ir taip pažeidžia bei žudo daugiau neuronų, esančių pusiasalyje, sukeldama uždegiminį infarkto išsiplėtimą.

Padidėjusi KV1.3 ekspresija, kuri per 2–5 dienas stebima ant infarkto ribos esančios mikroglijos [5], tikriausiai leidžia aktyvuotai mikroglijai palaikyti stipresnius kalcio signalus per padidėjusį P2X4 receptorių skaičių ir taip gaminti daugiau uždegiminių mediatorių, pažeidžiančių daugiau neuronų. ir aktyvuoja daugiau mikroglijų. Ši hipotezė atitiktų išvadą, kad KV1.3 blokatorius PAP-1 sumažino mikroglijų aktyvaciją ir IL-1 bei IFN- koncentraciją smegenyse, todėl infarkto plotai sumažėjo maždaug 40 procentų ir pagerėjo neurologinis deficitas. balai tiek pelių, tiek žiurkių išeminio insulto modeliuose [5]. Depoliarizuodami mikrogliją Kv1.3 blokatoriai sumažina kalcio antplūdį per P2X4 receptorius, kuriuos sukelia iš pažeistų neuronų išsiskiriantis ATP, ir taip slopina tolesnį nuo kalcio priklausomą NLRP3 uždegimo, NF-κB ir kitų transkripcijos faktorių aktyvavimą, dėl kurio sumažėja uždegiminio mediatoriaus gamyba (1 pav.) ir sumažinta patologija.

Kokius kitus kalcio antplūdžio kelius mikroglijose reguliuoja KV1.3?

Nors KV1.3 blokada aiškiai sumažino ATP sukeltą kalcio antplūdį per P2X4 receptorius [40] ir todėl yra svarbus šio kalcio antplūdžio mikroglijose reguliatorius (2 pav.), tai nėra vienintelis KV1.3 arba nuo ATP priklausomas kalcio signalas. procesas mikroglijoje. Be P2X receptorių kanalų, mikroglijos taip pat išreiškia metabotropinius P2Y purinerginius receptorius, kurie po aktyvinimo ATP arba UTP gali paskatinti kalcio išsiskyrimą iš vidinių atsargų [47] ir suaktyvinti sandėliuose valdomą Ca2 plius patekimą (SOCE), kai išeikvotos santykinai mažos tarpląstelinės kalcio atsargos. mikroglijoje [38]. Todėl tikrai įmanoma, kad papildomas SOCE prisidėjo prie mūsų nufotografuotų ATP sukeltų Ca2 plius signalų ir kad kai kurie KV1.3 blokatorių efektai buvo tarpininkauti papildomai sumažinus SOCE.

Tai labai tikėtina hipotezė, nes „klasikinis“ molekulinis KV1.3 blokatorių mechanizmas T ląstelėse yra SOCE sumažinimas per CRAC kanalus po T ląstelių receptorių aktyvacijos ir vėliau sumažintas transkripcijos faktoriaus aktyvavimas bei citokinų gamyba ir išsiskyrimas [29,33, 36,48]. Ne kartą buvo pranešta, kad žiurkių ir pelių mikroglijos pasižymi srovėmis, pasižyminčiomis CRAC srovėms būdingomis biofizinėmis savybėmis [49, 50], ir išreiškiančios CRAC kanalų, Orai ir STIM molekulinius komponentus [51, 52]. Be to, yra įrodymų, kad genetinė Orai1, STIM1 ir STIM2 ištrynimas sumažina CRAC srovę ir (arba) SOCE ir slopina migraciją bei fagocitozę auginamose pelės mikroglijose [52], o mažos molekulės CRAC kanalų blokatorius CM-EX-137 neseniai buvo pranešta, kad jis sumažina mikroglijos aktyvaciją ir pažeidimo dydį trauminio smegenų pažeidimo pelės modelyje [53].

KV1.3 kanalų blokada susilpnina parduotuvėje valdomą kalcio patekimą į LPS stimuliuojamą mikrogliją

Kaip tolesnis eksperimentas su ankstesniu straipsniu apie KV1.3 vaidmenį reguliuojant P2X4 sukeltą kalcio antplūdį, mes čia konkrečiai uždavėme klausimą, ar KV1.3 blokatorius ShK-223 taip pat sumažins SOCE LPS diferencijuotoje mikroglijoje. , ta pati stimuliavimo sąlyga, kai stebėjome didžiausią KV1.3 srovės tankį ir didžiausią KV1.3 slopinimo poveikį ATP sukeltai kalcio signalizacijai [40]. Naudodami ratiometrinį kalcio indikatorių Fura-2 laisvo intracelulinio kalcio koncentracijos ([Ca2 plius ]i) pokyčiams sekti, nustatėme, kad LPS diferencijuotos mikroglijos ramybės citozolinio kalcio koncentracija [Ca2 plius ] I svyravo nuo 60 nM ir 370 nM, vidutiniškai 150 ± 8,8 nM (n=50; 3a, c, g pav.), o tai atitinka ankstesnę ataskaitą [54]. Norint sukelti SOCE, ląstelės viduje esančios kalcio atsargos pirmiausia buvo išeikvotos tapsigarginu (Tg), endoplazminio tinklo Ca2 ir -ATPazės blokatoriumi, kuris buvo naudojamas vonios tirpale, kuriame nėra Ca2 plius.

Removal of extracellular calcium produced a roughly 25 nM decrease in [Ca2+] I (Figure 3a) indicating the presence of a calcium influx at rest. Subsequent application of Tg (1 μM) elicited small amplitude (>25 nM) asinchroninis [Ca2 plius ] I padidėjimas dėl pasyvios kalcio mobilizacijos iš parduotuvių. Pakartotinis kalcio pridėjimas į vonios tirpalą sukėlė greitą [Ca2 plius] I padidėjimą virš ramybės lygio, kurį sukėlė SOCE. SOCE sukeltų [Ca2 plius ] I pereinamųjų reiškinių ("piko SOCE") dydis, išmatuotas kaip skirtumas tarp [Ca2 plius ] I lygio vonios tirpale be Ca2 plius ir maksimalaus [Ca2 plius ] I padidėjimo po pakartotinio kalcio pridėjimo reikšmingai tarp atskirų ląstelių, kurių didžiausias SOCE pasiskirstymas rodo maksimalų 120 nM, o uodega iki 1800 nM (1b pav.). Šį SOCE stiprumo nevienalytiškumą greičiausiai sukelia ramybės membranos potencialo pokyčiai, kurie yra kalcio patekimo į SOCE varomoji jėga. Nustatyta, kad LPS diferencijuotų mikroglijų ramybės membranos potencialas svyruoja nuo –90 mV iki –40 mV atskirose ląstelėse [40, 55] ir todėl gali lemti pastebėtus SOCE skirtumus.

Ankstesniame tyrime buvo pranešta, kad ramybės [Ca2 plius] I padidėjimas buvo susijęs su sumažėjusiu išorinių dirgiklių, tokių kaip P2Y receptorių agonistas UTP arba komplemento faktorius 5a, gebėjimas sukelti [Ca2 plius] I pereinamuosius reiškinius LPS aktyvuotose mikroglijose [54]. Kadangi mūsų tyrime ir ramybės [Ca2 plius]i lygiai, ir didžiausios SOCE vertės skyrėsi atskirose ląstelėse, ištyrėme, ar ramybės [Ca2 plius]i svyravimai gali lemti didžiausių SOCE verčių nevienalytiškumą. Nubraižant didžiausias SOCE vertes, palyginti su ramybės [Ca2 plius ] I, atskleidė teigiamą koreliaciją tarp didžiausio SOCE ir ramybės [Ca2 plius ] I (3c pav.). Kai suskirstėme duomenis į dvi grupes, kurių ribinė vertė 600 nM didžiausiai SOCE, ryšys tarp ramybės [Ca2 plius] I ir didžiausio SOCE kiekvienoje grupėje buvo stipresnis nei visoje populiacijoje, o tai rodo, kad yra bent dvi ląstelės. populiacijos, kurios skiriasi tiek SOCE dydžiu, tiek koreliacijos stiprumu tarp ramybės būsenos [Ca2 plus ] I ir didžiausio SOCE. Taigi LPS apdorotų ląstelių populiacijoje ramybės [Ca2 plius]i padidėjimas nėra priežastiniu ryšiu susijęs su sumažėjusiu aktyvuotų mikroglijų gebėjimu reaguoti į išorinius dirgiklius su [Ca 2 plius] I trumpalaikiu, kaip buvo pasiūlyta anksčiau. pateikė Hoffman ir kt. Mūsų duomenys rodo, kad bendra įtaka, pvz., membranos potencialo lygis, kurį valdo įvairūs kanalai, įskaitant KV1.3, Kir2.1 ir THIK-1, gali lemti teigiamą koreliaciją tarp ramybės [Ca2 plius] I ir didžiausias SOCE, pastebėtas mūsų tyrime. Pavyzdžiui, hiperpoliarizuojančių kanalų per didelė ekspresija arba funkcinis reguliavimas gali hiperpoliarizuoti membraną ir padidinti varomąją jėgą kalcio patekimui per konstituciškai aktyvius kalciui pralaidžius kanalus, pvz., metaboliškai aktyvuojamus trumpalaikio receptorių potencialo (TRP) kanalus, ir parduotuvėse valdomus kanalus, suaktyvintus po atsargų išeikvojimo. pvz., CRAC kanalai.

Pre-incubation of cells with the KV1.3 inhibitor ShK-223 did not significantly affect resting [Ca2+] I (Figure 3d,g), but eliminated peak SOCE responses larger than 300 nM and shifted the maximum of the distribution of peak SOCE values from 130 nM (Figure 3b, control) to 70 nM (Figure 3e, ShK223). The difference between the values of peak SOCE in control cells and cells preincubated with ShK-223 was significant (Figure 3h). The relationship between resting [Ca2+] I and peak SOCE still displayed a mild positive correlation (figure 3f). Taken together, our data indicate that similarly to T lymphocytes, blockade of KV1.3 channels significantly reduces SOCE in LPS differentiated microglia. The extent of the inhibition varied among cells with a greater effect on cells expressing large magnitude (>300 nM) SOCE. Ląstelių, turinčių aukštą ir žemą SOCE piką, specifines charakteristikas dar reikia nustatyti.

Esant fiziologinėms sąlygoms, SOCE vėliau gali būti suaktyvintas, kad būtų išeikvotas atsargos, kai suaktyvinami su G baltymu susieti P2Y receptoriai, ir prisideda prie bendro [Ca2 plius] I padidėjimo aktyvuojant P2Y ir P2X receptorius, kuriuos sukelia įprasti purinerginiai agonistai, tokie kaip ATP. SOCE dydis labai skiriasi tarp LPS diferencijuotų ląstelių, o tai gali būti unikalaus parduotuvėje valdomų kanalų ir kanalų, kontroliuojančių membranos potencialą, pvz., KV1.3, diferencinės išraiškos derinio funkcija. ShK-223 sumažėjęs didžiausias SOCE kiekis rodo, kad KV1.3 kanalai yra stiprūs SOCE reguliatoriai ir atskleidžia papildomą mechanizmą, pagal kurį KV1.3 blokatoriai susilpnina kalcio signalus ir vėlesnius funkcinius atsakus (pvz., citokinų gamybą) po nuo kalcio priklausomos transkripcijos faktoriaus aktyvacija mikroglijoje.

Išvados

Nors neabejotinai sudėtinga išsiaiškinti indėlio poveikį periferinės imuninės sistemos ląstelėms, ypač atminties T ląstelėms ir monocitų kilmės makrofagams, turinčius teigiamą KV1.3 blokatorių poveikį CNS uždegimui, aišku, kad KV1.3 vaidina svarbų vaidmenį reguliuojant membranos potencialą, užkertant kelią depoliarizacijai ir kontroliuojant kalcio signalizacijos įvykius, kurie vėliau sukelia mikroglijos aktyvaciją ir uždegiminio mediatoriaus gamybą. Mes norėtume pasiūlyti, kad terapiniu požiūriu tikriausiai pageidautina slopinti KV1.3 keliuose imuninės sistemos ląstelių tipuose. Tačiau intelektualiai būtų labai patenkinta ir naudinga kuriant terapiją išsiaiškinti, koks yra pagrindinis KV1.3 inhibitorių taikinys į ląsteles ir ar vaistai turi būti prasiskverbę į smegenis, kad būtų pasiektas optimalus CNS ligų gydymo poveikis. Idealiu atveju šie klausimai turėtų būti sprendžiami farmakologiškai, tiriant mažas į smegenis prasiskverbias molekules kartu su periferiškai ribotais peptidiniais KV1.3 inhibitoriais arba anti-KV1.3 antikūnais [58,59] Alzheimerio ir Parkinsono ligų gyvūnų modeliuose. Be to, būtų labai informatyvu palyginti sąlyginės KV1.3 ištrynimo poveikį mikroglijose, iš monocitų gautuose makrofaguose ir skirtinguose T ląstelių pogrupiuose su gydymo vaistais poveikiu, kad būtų galima išsamiau suprasti KV1.3 vaidmenį neurouždegime. ir KV1.3 inhibitorių ląstelinis taikinys. Tačiau mes manome, kad ląstelių lygiu pagrindinis KV1.3 vaidmuo visada bus tas, kuris pirmą kartą buvo aprašytas T ląstelėse, būtent membranos potencialo ir kalcio antplūdžio reguliavimas ir vėlesnis nuo kalcio priklausomų transkripcijos faktorių aktyvinimas. Tikriausiai kartais nepakankamai pabrėžiama, kad KV1.3 biofizinės savybės, pvz., pusiau aktyvinimo įtampa ir santykinai lėtas inaktyvavimas [60, 61], puikiai „kvalifikuoja“ kanalą priešintis membranos depoliarizacijai ir taip įgalina KV1. .3 ne tik reguliuoti SOCE, kaip buvo aprašyta prieš 30 metų T ląstelėse, bet ir P2X receptorių sukeltą kalcio antplūdį.

Atskleidimo pareiškimas

Autoriai nepranešė apie galimą interesų konfliktą.

Finansavimas

Šis darbas buvo paremtas Nacionalinio neurologinių ligų ir insulto instituto apdovanojimu NS100294 (HW) ir UC Davis medicinos mokyklos mokslinių tyrimų partnerystės dotacija (AFF).

Nuorodos

[1] DeCoursey TE, Chandy KG, Gupta S ir kt. Įtampa valdomi K plius kanalai žmogaus T limfocituose: vaidmuo mitogenezėje? Gamta. 1984;307(5950):465–468.

[2] Beeton C, Wulff H, Standifer NE ir kt. Kv1.3 kanalai yra T ląstelių sukeltų autoimuninių ligų terapinis taikinys. Proc Natl Acad Sci USA. 2006;103 (46):17414–17419.

[3] Tarcha EJ, Chi V, Munoz-Elias EJ ir kt. Patvarūs farmakologiniai atsakai iš peptido ShK-186, specifinio Kv1.3 kanalo inhibitoriaus, slopinančio autoimuninės ligos T ląstelių mediatorius. J Pharmacol Exp Ther. 2012;342(3):642–653.

[4] Chandy KG, Norton RS. Kv1.3 kanalų peptidų blokatoriai T ląstelėse kaip vaistai autoimuninėms ligoms gydyti. Curr Opin Chem Biol. 2017;38:97–107.

[5] Chen YJ, Nguyen HM, Maezawa I ir kt. Kalio kanalo Kv1.3 slopinimas sumažina infarktą ir uždegimą sergant išeminiu insultu. Ann Clin Transl Neurol. 2018;5(2):147–161.

[6] Ma DC, Zhang NN, Zhang YN ir kt. Kv1.3 kanalo blokada palengvina smegenų išemijos / reperfuzijos pažeidimą, pakeisdama M1 / ​​M2 fenotipus ir pakenkdama NLRP3 uždegimo aktyvacijai mikroglijoje. Exp Neurol. 2020; 332: 113399.

[7] Maezawa I, Nguyen HM, Di Lucente J ir kt. Kv1.3 slopinimas kaip galimas į mikrogliją nukreiptas Alzheimerio ligos gydymas: ikiklinikinis koncepcijos įrodymas. Smegenys. 2018;141(2):596–612.

[8] Sarkar S, Nguyen HM, Malovic E ir kt. Kv1.3 moduliuoja neurouždegimą ir neurodegeneraciją sergant Parkinsono liga. J Clin Invest. 2020; 130 (8): 4195–4212.

[9] Reeves TM, Trimmer PA, Colley BS ir kt. Nukreipimas į Kv1.3 kanalus, siekiant sumažinti baltosios medžiagos patologiją po trauminio smegenų pažeidimo. Exp Neurol. 2016;283(PtA):188–203.

[10] Lai IK, Valdearcos M, Morioka K ir kt. Kv1.3 kalio kanalų blokavimas apsaugo nuo pooperacinio neurouždegimo ir pažinimo nuosmukio, nepakenkiant pelių žaizdų gijimui. Br J Anaesth. 2020; 125 (3): 298–307.

[11] Peng Y, Lu K, Li Z ir kt. Kv1.3 kanalų blokada pagerina radiacijos sukeltą smegenų pažeidimą. Neuro Oncol. 2014;16(4):528–539.

[12] Chen YJ, Nguyen HM, Maezawa I ir kt. Kalio kanalas KCa3.1 yra neurouždegimo, susijusio su išemija / reperfuzijos insultu, farmakologinis tikslas. J Cereb Blood Flow Metab. 2016;36 (12): 2146–2161.

[13] Rangaraju S, Gearing M, Jin LW ir kt. Kalio kanalą Kv1.3 labai išreiškia mikroglia sergant žmogaus Alzheimerio liga. J Alzheimerio liga. 2015;44 (3): 797–808.

[14] Norenberg W, Gebicke-Haerter PJ, Illes P. Uždegiminiai dirgikliai sukelia naują K plius išorinę srovę auginamose žiurkių mikroglijose. Neurosci Lett. 1992; 147 (2): 171–174.

[15] Kotecha SA, Schlichter LC. Kv1.5 į Kv1.3 perjungimas endogeninėje hipokampo mikroglijoje ir vaidmuo proliferacijoje. J Neurosci. 1999;19(24):10680–10693. [16] Fordyce CB, Jagasia R, Zhu X ir kt. Microglia Kv1.3 kanalai prisideda prie jų gebėjimo naikinti neuronus. J Neurosci. 2005;25(31):7139–7149.

[17] Nguyen HM, Grossinger EM, Horiuchi M ir kt. Diferencinė Kv1.3, KCa3.1 ir Kir2.1 išraiška „klasikiškai“ ir „alternatyviai“ aktyvuotose mikroglijose. Glia. 2017;65(1):106–121.

For more information:1950477648nn@gmail.com