LIMIT yra imunogeninė LncRNR vėžio imuniteto ir imunoterapijos srityje

Abstraktus

MHC-I pristato naviko antigenus CD8+ T ląstelėms ir sukelia priešnavikinį imunitetą. Žmonės gali turėti 30, 000-60,000 ilgio nekoduojančių RNR (lncRNR). Tačiau vis dar menkai suprantama, ar lncRNR gali turėti įtakos naviko imunitetui. Čia mes nustatome LncRNR, galinčią sukelti MHC-I ir naviko imunogeniškumą (LIMIT) žmonėms ir pelėms. Mes nustatėme, kad IFN stimuliuojamas LIMIT, LIMIT cis aktyvintas guanilatą surišančio baltymo (GBP) genų klasteris, o GBP sutrikdė ryšį tarp HSP90 ir šilumos šoko faktoriaus-1 (HSF1), todėl HSF1 aktyvuota ir MHC-I transkripcija. mašinos, bet ne PD-L1. RNR valdomas LIMIT CRISPR aktyvinimas padidino GBP ir MHC-I bei sustiprino naviko imunogeniškumą ir kontrolinio taško terapiją.

Nutildžius LIMIT, GBP ir (arba) HSF1, sumažėjo MHC-I, susilpnėjo priešnavikinis imunitetas ir sumažėjo imunoterapijos veiksmingumas. Kliniškai LIMIT, GBPs ir HSF1-signalizacijos nuorašai ir baltymai koreliavo su MHC-I, naviką infiltruojančiomis T ląstelėmis ir kontrolinio taško blokados atsaku vėžiu sergantiems pacientams. Iš viso parodome, kad LIMIT yra anksčiau nežinoma vėžio imunogeninė lncRNR, o LIMIT-GBP-HSF1 ašis gali būti taikoma vėžio imunoterapijai.

Raktažodžiai 

Ilga nekoduojanti RNR; LIMIT; MHC-I; IFN; GBP; HSF1; HSP90; PD-L1; PD-1; T ląstelių imunitetas; vėžio imunoterapija

Įvadas

Kontrolinio taško blokada atskleidžia CD{0}} T ląstelių sukeltą imuninę galią prieš vėžį1. Pagrindinis histokompatibilumo kompleksas-I (MHC-I) vaidina pagrindinį vaidmenį CD8+ T ląstelių paleidime ir aktyvavime2. Tačiau vėžio ląstelėse MHC-I dažnai yra sumažintas, todėl naviko imuninis vengimas ir atsparumas imunoterapijai 3, 4. Svarbu suprasti, kaip atkurti naviko MHC-I ekspresiją ir atgaivinti priešnavikinį imuninį atsaką5. LncRNR sparčiai atsiranda kartu su giliosios RNR sekos nustatymo pažanga, apimančiomis daug daugiau lokusų žmogaus genome nei baltymus koduojantys genai6. LncRNR reguliuoja baltymus koduojančius genus keliais lygiais7-9 ir atlieka pagrindinį vaidmenį genomo įspaudime10, ląstelių diferenciacijoje11 ir vėžio progresavime12. Tačiau specifinių lncRNR tapatybė, veikimo būdas, funkcija ir klinikinė reikšmė vėžio imunitetui ir imunoterapijai lieka nežinoma. Čia mes nustatome LIMIT kaip anksčiau nežinomą vėžio imunogeninę lncRNR. LIMIT veikia MHC-I mašinas ir priešnavikinį imunitetą. Mes nustatėme, kad LIMIT lokaliai taikosi į GBP, taip sudarydamas LIMIT-GBP-HSF1-MHC molekulinę kaskadą, kad pakeistų priešnavikinį imunitetą ir naviko imunoterapijos veiksmingumą. Mūsų darbas ne tik atskleidžia anksčiau nežinomą imunogeninės lncRNR LIMIT biologiją, bet ir rodo, kad LIMIT-GBP-HSF1 ašis gali būti taikoma vėžio imunoterapijai.

LIMIT yra imunogeninė lncRNR

cistanche tubulosa - stiprina imuninę sistemą

Norėdami ištirti nežinomus reguliuojančius genus naviko imunitete, remiantis naviko CD{0}} T ląstelių infiltracija, žmogaus melanomą (TCGA, SKCM) suskirstėme į karšto ir šalto naviko tipus ir išanalizavome imunogeninių genų koreliacijas. Be CD8A, IFN ir MHC-I (HLA-ABC) nuorašų, mes nustatėme, kad lncRNR kandidatas buvo praturtintas karštu naviku, tarp 3926 lncRNR kandidatų, pažymėtų GENCODE13 (1a pav.; 1 papildoma lentelė). Remdamiesi funkciniais toliau pateiktų eksperimentų tyrimais, šį lncRNR kandidatą priskyrėme LIMIT: lncRNR indukuojantis MHC-I ir naviko imunogeniškumas (LIMIT). Žmogaus melanomos duomenų rinkinyje LIMIT lygiai teigiamai koreliavo su IFN , MHC-I ir CD8 lygiais (1b-d pav.). Atsižvelgiant į tai, genų rinkinio praturtinimo analizė (GSEA) atskleidė, kad LIMIT ekspresija koreliuoja su IFN atsako genais, antigeno pateikimu per MHC-I ir imuninės sistemos aktyvavimu (1e-h pav.). Be to, LIMIT lygiai koreliavo su padidėjusiu kontrolinio taško imunoterapijos atsako dažniu 14-17 (1i pav.) ir buvo susiję su melanoma sergančių pacientų išgyvenimu (1j pav.). Be to, LIMIT ekspresija koreliavo su IFN , MHC-I ir CD8 įvairiuose vėžio tipuose (Išplėstiniai duomenys 1a-l pav.). Taigi LIMIT yra potenciali imunogeninė lncRNR.

Patvirtinome, ar LIMIT yra lncRNR. Northern blot tyrimas parodė, kad LIMIT žmogaus A375 melanomos ląstelėse buvo maždaug 2 kb ilgio (1k pav.). Pritaikėme greitą cDNR galų amplifikaciją (RACE) ir apibūdinome LIMIT cDNR galus tiek žmogaus (A375), tiek pelės (B16) melanomos ląstelėse (1l pav., m). Tada mes klonavome visą LIMIT ilgį tiek žmonėms, tiek pelėms ir suderinome jį su atitinkamomis genomo sekomis (išplėstiniai duomenys 2a, b pav.). Žmogaus LIMIT buvo 1 chromosomoje su 1967 nukleotidais ir 6 egzonais (išplėstiniai duomenys 2a pav.), o pelės riba buvo 3 chromosomoje su 1634 nukleotidais ir 7 egzonais (išplėstiniai duomenys 2b pav.). LIMIT nebuvo tinkamos „Kozak“ sekos. Kai mes paruošėme RNR iš branduolinių ir citoplazminių A375 ląstelių frakcijų, LIMIT daugiausia buvo aptikta branduolinėje frakcijoje (1n pav.). Taigi LIMIT neturi baltymų kodavimo potencialo. Bendrai LIMIT atitinka visus kriterijus, kad būtų galima apibrėžti kaip lncRNR. Pažymėtina, kad LIMIT lokuse, lncRNR kandidatas, GBP1 (GBP1P1) pseudogenas buvo rastas sergant kepenų ląstelių karcinoma (HCC)18. Tačiau LIMIT buvo mažai panašus į GBP1P1 arba GBP1 (išplėstiniai duomenys 2c pav., 2 papildoma lentelė). Taigi LIMIT nėra GBP1P1. Didelė koreliacija tarp LIMIT ir IFN reaguojančio geno parašo (1e pav.) rodo, kad IFN gali stimuliuoti LIMIT ekspresiją. Iš tiesų, gydymas IFN sukėlė LIMIT ekspresiją, kaip parodyta Northern blotting (1k pav.) ir RNR sek A375, HT29, Meijuso ir A549 ląstelėse (1o pav.). Tačiau gydymas kitais citokinais, tokiais kaip IFN ir TNF, nesukėlė LIMIT ekspresijos (1k pav.). Be to, IFN nesugebėjo sukelti LIMIT STAT1 išmušimo (KO) A375 ląstelėse (1p pav.). Taigi LIMIT yra anksčiau nežinoma IFN reaguojanti lncRNR tiek žmogaus, tiek pelės ląstelėse.

LIMIT padidina MHC-I raišką

cistanche papildo privalumai – kaip stiprinti imuninę sistemą

Spustelėkite čia norėdami pamatyti Cistanche Enhance Immunity produktus

【Klauskite daugiau】 El. paštas:cindy.xue@wecistanche.com / Whats App: 0086 18599088692 / Wechat: 18599088692

Norėdami ištirti LIMIT funkciją naviko ląstelėse, pirmiausia numušėme LIMIT mažomis plaukų segtuko RNR (shLIMIT). Naudojome „Blast“ įrankį, kad pasirinktume LIMIT shRNR, kurios neturi netinkamų kandidatų (papildomos lentelės 3-6). ShLIMIT nebuvo nukreiptas į GBP koduojančius genus (išplėstiniai duomenys 3a pav.). A375 ląstelėse shLIMIT slopino LIMIT ekspresiją (2a pav.), bet nepaveikė STAT1 fosforilinimo (2b pav.), reaguojant į IFN, o tai rodo, kad LIMIT neturėjo įtakos pasaulinei IFN geno signalizacijai. MHC-I ir PD-L1 yra IFN tiksliniai genai19-21. ShLIMIT sumažino MHC-I ekspresiją (2c pav.), bet ne PD-L1 (išplėstiniai duomenys 3b pav.), reaguojant į IFN stimuliaciją. Remiantis šiais žmogaus duomenimis, pelių melanomos ląstelės YUMM1.7 arba gaubtinės žarnos vėžio ląstelės CT26 nutildymo riba sumažino MHC-I ekspresiją reaguojant į IFN (2d-g pav.). A375 ląstelėse shLIMIT paveikė ne tik MHC-I ekspresiją (HLA-ABC, HLA-E ir HLA-F), bet ir MHC-II ekspresiją (HLA-DRA ir HLA-DMA); tuo tarpu LIMIT nepakeitė kitos IFN signalizacijos genų ekspresijos (Išplėstiniai duomenys 3c pav.). Taigi LIMIT dalyvauja reguliuojant IFN sukeltą MHC-I ir MHC-II ekspresiją, nekeičiant pasaulinio IFN signalizacijos kelio.

LIMIT yra pertrauktas genas su dideliais intronais, genome užimantis apie 17 kb. Mums nepavyko išmušti LIMIT lokuso su suporuotomis sgRNR ir Cas9. Atsižvelgiant į tai, kad LIMIT promotoriuje yra 5 numatomos STAT1 / IRF1 surišimo vietos, mes sukūrėme 4 suporuotas sgRNR, kad pašalintume šias surišimo vietas LIMIT promotoriuje (Išplėsti duomenys 3d pav.). Mes sukūrėme A375 ląsteles su LIMIT promotoriaus delecija visuose 4 sgRNR deriniuose. Mes nustatėme, kad IFN nebegali sukelti LIMIT ir MHC-I ekspresijos naviko ląstelėse su LIMIT promotoriaus delecija, palyginti su laukinio tipo ląstelėmis (2h pav., i). Be to, mes panaudojome RNR valdomą CRISPR aktyvinimo sistemą, kad suaktyvintume Limit ekspresiją naviko ląstelėse22. Sukūrėme 4 pagalbines RNR, nukreiptas į Limit (sgLimit) promotoriaus sritį, ir kartu ekspresuojamas su dCas9-VPR, trišaliu transkripcijos aktyvatoriumi, sujungtu su Cas9, kuriame nėra nukleazės, į B16 ląsteles (išplėstiniai duomenys 4a pav.). Visi 4 sgLimit sustiprino Limit išraišką, taip pat MHC-I (išplėstiniai duomenys 4b, c pav.). Kai B16 ląsteles transfekavome sujungtomis sgLimit ir netikslinėmis sgRNR (sgNT), sgLimit sukėlė Limit ir MHC-I ekspresiją, bet ne PD-L1 (2j pav., k). Taigi, Limit selektyviai taikosi į MHC-I, bet ne į PD-L1. Apskritai, funkcijos praradimo ir padidėjimo eksperimentai rodo, kad LIMIT gali pakeisti 1.5-3 karto MHC-I ekspresiją daugelyje pelių ir žmonių vėžio ląstelių. Toliau ištyrėme, ar LIMIT pakeista MHC-I ekspresija turi įtakos TAA specifiniam CD8+ T ląstelių sukeliamam naviko žudymui in vitro. Šiuo tikslu pirmiausia genetiškai numušėme B2M su specifinėmis shRNR ovalbuminą (OVA){46}}, ekspresuojančiose B16 ląstelėse. shRNA-B2M sumažino OVA-H2Kb ekspresiją 1{51}}kartu (išplėstiniai duomenys, 4d pav.). Kai B16-OVA ląstelės, turinčios shFluc ir shB2M, buvo inkubuojamos su OT-I ląstelėmis, pastebėjome OT-I tarpininkaujamų shB2M-B16-OVA ląstelių žudymo sumažėjimą, palyginti su shFluc-B{{63 }}OVA ląstelės (Išplėstiniai duomenys 4e-g pav.). Duomenys rodo, kad LIMIT kontroliuojami 1.{67}}karto MHC-I raiškos pokyčiai gali turėti funkciškai reikšmingų įtakos TAA specifinei CTL veiklai. Norėdami tai patvirtinti, B16-OVA ląstelėse, ekspresuojančiose šelaką ir shB2M, suaktyvinome LIMIT. Kaip ir tikėtasi, LIMIT aktyvinimas CRISPR sukėlė minimalią MHC-I ekspresiją shB2M ląstelėse, palyginti su kontrolinėmis ląstelėmis (2l pav.). Atitinkamai, OT-I ląstelės sąlygojo minimalų auglio žudymą shB2M-OVA-B16 ląstelėse, palyginti su kontrolinėmis ląstelėmis (2m pav., n). Duomenys rodo, kad LIMIT sukelta MHC-I ekspresija yra svarbi TAA specifinei T ląstelių aktyvacijai ir funkcijai. Antigenus pateikiančios ląstelės (APC), įskaitant makrofagus ir dendritines ląsteles (DC), ekspresuoja MHC-I, pateikia antigenus TAA specifinėms T ląstelėms ir aktyvina jas. Išplėtėme savo tyrimus nuo naviko ląstelių iki APC. IFN stipriai stimuliavo Limit ekspresiją kaulų čiulpų kilmės DC ir makrofaguose (Išplėstiniai duomenys Fig. 4h, i). Mes transfekavome makrofagus su 5'FAM pažymėta siRNR taikymo riba (siLIMIT). Numušus LIMIT, MHC-I ekspresija buvo mažesnė kaip atsakas į IFN stimuliaciją, palyginti su kontroline medžiaga (Išplėstiniai duomenys 4j, k pav.). Taigi LIMIT yra į IFN reaguojanti lncRNR ir gali skatinti MHC-I ekspresiją tiek naviko ląstelėse, tiek APC.

LIMIT stiprina priešnavikinį imunitetą

Cistanche tubulosa-Antitumor pranašumai

Nepakankama MHC-I ekspresija sukelia naviko imuninį vengimą ir atsparumą imunoterapijai3. Kad suprastume Limito vaidmenį priešnavikiniame imuniniame atsake in vivo, kontrolines (shFluc) ir ribas slopinančias (shLimit) YUMM1.7 naviko ląsteles pasėjome į NOD scid c deficitą (NSG, imunodeficitas) ir laukinio tipo C57BL/6. (imuninės kompetentingos) pelės. Palyginti su kontroliniais navikais, shLimit YUMM1.7 navikai NSG pelėse išaugo panašiai (3a pav.), o laukinių tipų pelėms progresavo greičiau (3b pav.). Be to, mes inokuliavome shLimit CT26 navikus į laukinio tipo BALB / c peles. Vėlgi, nutildymo riba padidino CT26 naviko augimą imuninei sistemai atspariame modelyje (3c pav.). Duomenys rodo, kad slopinimo riba gali susilpninti priešnavikinį imunitetą ir palengvinti naviko augimą priklausomai nuo imuninės sistemos. Tai patvirtindami, nustatėme CD3+, IFN + ir TNF + T ląstelių sumažėjimą shLimit YUMM1.7 navikuose (3d pav., e). Kartu nutildant Limit susilpnėja priešnavikinis imunitetas. Norėdami nustatyti MHC-I ir MHC-I ekspresiją: SIINFEKL in vivo, sukūrėme YUMM1.7 ląsteles, stabiliai ekspresuojančias OVA (YUMM1.{33}}OVA) ir transdukuotas shRNR, nukreipiančia Limit arba Fluc. Po gydymo IFN aptikome sumažėjusią OVA-H2Kb paviršiaus ekspresiją shLimit-YUMM1.7 ląstelėse (išplėstiniai duomenys 5a pav.). Į C57BL/6 peles pasėjome shLimit YUMM1.{41}}OVA ląsteles ir shFluc-YUMM1.{44}}OVA ląsteles. Tada mes išpjaustėme naviko audinius ir nustatėme H2Db ir OVA-H2Kb ekspresiją naviko ląstelėse. Stebėjome H2Db ir OVA-H2Kb sumažėjimą shLimit-YUMM1.{55}}OVA ląstelėse, palyginti su kontrolinėmis ląstelėmis (išplėstiniai duomenys, 5b-f pav.). Duomenys rodo, kad Limit gali turėti įtakos MHC-I ir MHC-I: antigeno ekspresijai in vivo. Mes papildomai inokuliavome kontrolines (sgNT) ir Limit-aktyvinančias (sgLimit) B16 ląsteles į laukinio tipo C57 / BL6 peles. Kaip ir tikėtasi, sgLimit (ribos aktyvinimas) smarkiai sumažino naviko augimą (3f pav.). Tai lydėjo padidėjęs naviką infiltruojančių T ląstelių skaičius ir aktyvacija (3g pav., h). B16 melanoma yra santykinai nejautrus naviko modelis PD-L1 blokadai23. Atsižvelgiant į tai, PD-L1 blokada nesugebėjo kontroliuoti sgNT B16 naviko augimo pelėse. Įdomu tai, kad apribokite B16 naviko aktyvaciją su sgLimit jautrintu naviko atsaku į PD-L1 blokadą, kaip rodo sumažėjęs naviko progresavimas (3i pav.). Apskritai Limit stiprina naviko imunitetą ir jautrina naviko imunoterapijos atsaką.

LIMIT cis aktyvina GBP, kad padidintų MHC-I ir naviko imunitetą

Toliau ištyrėme, kaip LIMIT veikia MHC-I ir naviko imunitetą. LncRNR gali lokaliai reguliuoti gretimų genų ekspresiją24. LIMIT yra arti genų klasterio, guanilatą surišančių baltymų (GBP), tiek žmogaus, tiek pelės genomuose (išplėstiniai duomenys, 2a, b pav.). Mes paklausėme, ar LIMIT gali reguliuoti GBP išraišką. Nutildymas LIMIT sumažino pirmtakų ir subrendusių GBP mRNR (4a pav.) ir GBP1-5 baltymų (4b pav.) kiekį žmogaus A375 ląstelėse, reaguojant į gydymą IFN. Duomenys rodo, kad LIMIT gali skatinti GBP transkripciją cis. Šiai galimybei palaikyti, nutildymas Limit taip pat sumažino Gbp2 ekspresiją pelės YUMM1.7 ir CT26 ląstelėse (Išplėstiniai duomenys 6a, b pav.). Be to, CRISPR aktyvinimas Limit sukėlė Gbp2 ekspresiją B16 ląstelėse (4c pav.). Norėdami patikrinti, ar LIMIT gali transreguliuoti GBP, mes privertėme LIMIT cDNR ekspresiją į A375 ląsteles. Mes nustatėme, kad GBP1 ir keli imuniniai veiksniai (įskaitant IRF1, HLA-ABC ir PD-L1) nepakito dėl LIMIT per didelės ekspresijos (išplėstiniai duomenys 6c pav.). Taigi LIMIT yra cis veikianti lncRNR, galinti sukelti GBP ekspresiją. Tarp Gbp šeimos narių Gbp2 yra vyraujantis Gbp šeimos narys pelių ląstelėse (išplėstiniai duomenys 6d pav.). Norėdami patikrinti, ar LIMIT gali reguliuoti MHC-I per GBP, sukūrėme stabilias YUMM1.7 ląsteles, kuriose yra šelakas, shLimit, shGbp2 arba shLimit plius shGbp2. Mes nustatėme, kad reaguodami į IFN stimuliaciją, shLimit ir shGbp2 lėmė panašų Gbp2 ir MHC-I ekspresijos sumažėjimą; vienu metu nutildant Limit ir Gbp2 nepavyko papildomai pakeisti Gbp2 ir MHC-I ekspresijos (4d pav., e). Be to, susimąstėme, ar per didelė GBP ekspresija gali išgelbėti MHC-I sumažintą MHC-I ekspresiją, kai apriboja naviko ląsteles. Mes privertėme GBP1 ekspresiją shLIMIT A375 ląstelėse (GBP1OE) ir apdorojome šias ląsteles IFN. Mes pastebėjome, kad shLIMIT sumažino MHC-I ekspresiją kontrolinėse ląstelėse, bet ne GBP1OE ląstelėse (išplėstiniai duomenys 6e pav.). PD-L1 ir IRF1 ekspresijai įtakos neturėjo nei shLIMIT, nei GBP1OE (išplėstiniai duomenys 6e, f pav.). Taigi Limit gali reguliuoti MHC-I ekspresiją priklausomai nuo GBP. Po to YUMM1.7 ląsteles pasėjome į C57BL/6 peles su Limit ir (arba) Gbp{56}}nutildymu. Nutildymo riba ir GBP nutildymas panašiai lėmė greitesnį naviko augimą, palyginti su kontroline grupe, o tuo pačiu metu nutildant LIMIT ir GBP, auglio progresavimui daugiau įtakos neturėjo (4f pav.). Be to, mes nustatėme į naviką infiltruojančių T ląstelių skaičiaus sumažėjimą ir aktyvaciją shLimit navikuose, shGbp2 navikuose ir shLimit plius shGbp2 navikuose (4g pav. ir išplėstiniai duomenys 6g pav.). Kartu LIMIT padidina MHC-I ekspresiją ir naviko imunitetą priklausomai nuo GBP. GBP yra į IFN reaguojantys genai fibroblastuose25 ir makrofaguose26 šeimininko gynybos nuo patogenų kontekste. Tačiau GBP vaidmuo imunitetui nuo vėžio nežinomas. Atsižvelgiant į tai, kad GBP nutildymas sumažino MHC-I ekspresiją ir CD8+ T ląstelių aktyvaciją (4g pav. ir išplėstiniai duomenys 6g pav.), iškėlėme hipotezę, kad GBP gali turėti įtakos vėžio imunoterapijos veiksmingumui. Norėdami patikrinti šią hipotezę, mes nutildėme Gbp2 MC38 ląstelėse, naviko modelyje, jautriame imunoterapijai23. Kaip ir tikėtasi, Gbp2 nutildymas MC38 ląstelėse sumažino MHC-I ekspresiją po gydymo IFN (4h pav.) ir iš esmės panaikino PD-L1 blokados veiksmingumą (4i pav.). Tai, kartu su anksčiau minėtais duomenimis, rodo, kad LIMIT ir GBP dalyvauja kontroliuojant vėžio imunoterapijos veiksmingumą. Siekiant paremti šią galimybę, klinikinių duomenų analizė atskleidė, kad melanoma sergančių pacientų aukštas GBP ekspresijos lygis koreliuoja su LIMIT, MHC-I ekspresija ir imunoterapijos atsaku (išplėstiniai duomenys, 6h-j pav.). Be to, GBP ekspresijos lygiai buvo teigiamai susiję su paciento išgyvenimu (išplėstiniai duomenys 6k pav.). Norėdami patvirtinti, ar GBP yra į IFN reaguojantys genai vėžio ląstelėse, mes stimuliavome A375 ląsteles IFN ir kitais citokinais. GBP sukėlė IFN, bet minimaliai paveikė kiti imuniniai citokinai (4j pav.). Tada mes panaudojome CRISPR-Cas9 sistemą, kad nukreiptume bendras sekas tarp GBP1-5, ir sukūrėme GBP1-5 išmušimo (KO) A375 langelius (4k pav.). Pastebėjome, kad GBP KO A375 ląstelėse IFN blogai stimuliuoja MHC-I genų mechanizmų transkriptus (4l pav.) ir paviršiaus HLA-ABC baltymus (4m pav.). Todėl LIMIT cis aktyvuoja GBP, kad sustiprintų MHC-I mašinas ir naviko imunitetą.

GBP suaktyvina HSF1, kad paskatintų MHC-I ir naviko imunitetą

Norėdami parodyti, kaip GBP gali reguliuoti MHC-I ekspresiją ir naviko imunitetą, mes privertėme GBP ekspresiją A375 ląstelėse. Įdomu tai, kad per didelė GBP ekspresija padidino žmogaus MHC-I ekspresiją – kaip rodo qRT-PGR (5a pav.), membranos paviršiaus dažymas (5b pav.) ir Western blotting (5c pav.). Duomenys rodo, kad GBP gali suaktyvinti MHC-I transkripcijos lygiu. Nuosekliai per didelė Gbp2 ekspresija padidino pelės MHC-I ekspresiją YUMM1.7 ir B16 ląstelėse (5d pav.). Norėdami nustatyti transkripcijos faktorių (-ius), reguliuojantį MHC-I per GBP, reaguodami į IFN, atlikome bioinformatikos prognozę naudodami PROMO27. A375 ląstelėse radome 8 transkripcijos faktorius, kuriuos pakeitė IFN, kurie gali būti nukreipti į HLA-ABC, HSPA5, CALR ir TAP1. Be keleto gerai žinomų veiksnių, HSF1 aktyvumą labai paskatino IFN (išplėstiniai duomenys 7a pav.). Apdorojant ChIP-seq duomenų rinkinius ENCODE28, mes nustatėme, kad ir STAT1, ir HSF1 buvo praturtinti su MHC-I susijusių genų, turinčių skirtingus surišimo modelius, promotoriais (išplėstiniai duomenys 7b pav.). Mes atlikome ChIP tyrimą su anti-HSF1 antikūnu IFN stimuliuojamose A375 ląstelėse. HSF1 buvo praturtintas HLA-ABC, HSPA5, CALR ir TAP1 promotoriais, bet ne HPRT1, neigiama kontrolė (5e pav.). Rezultatai rodo, kad HSF1 yra MHC-I transkripcijos faktorius. HSF1 paprastai aktyvuojamas nutraukus proteostazę29. Norėdami patikrinti, ar HSF1 aktyvinimas sustiprins MHC-I ekspresiją, A375 ląsteles apdorojome stresorių sąrašu30: karščio šokas, oksidacinis stresas (Luperox), transliacijos inhibitoriai (puromicinas), proteasoma (MG-132) ir palydovas (17-AAG). Įdomu tai, kad šie stresoriai visuotinai stimuliavo MHC-I ekspresiją, o HSF1 inhibitorius KRIBB11 sumažino šį poveikį (5f pav. ir išplėstiniai duomenys 7c pav.). Taigi HSF1 aktyvinimas paprastai sukelia MHC-I ekspresiją. Toliau suabejojome, ar GBP gali suaktyvinti HSF1. Priverstinė GBP ekspresija sukėlė HSF1 reporterio HSE-Luc luciferazės aktyvumą (5g pav.), taip pat HSF1 fosforilinimą (5h pav.). Tai rodo, kad GBP gali suaktyvinti HSF1. IFN nepavyko sukelti HSPA5 ekspresijos GBP-KO A375 ląstelėse (5i pav.). Taigi, IFN aktyvuoja HSF1, sukeldamas GBP ekspresiją. Be to, gydymas KRIBB11, HSF1 inhibitoriumi, panaikino MHC-I reguliavimą, kurį sąlygojo GBP1 per didelė ekspresija (5j pav.). Taigi GBP stimuliuoja MHC-I ekspresiją priklausomai nuo HSF{78}}. Norėdami sustiprinti mechaninį ryšį tarp GBP ir HSF1, MC38 ląstelėse nutildėme Gbp2 ir (arba) Hsf1 (5k pav.). Gydant IFN, vien tik Gbp2 arba Hsf1 nutildymas sumažino MHC-I ekspresiją, tačiau kartu nutildant Gbp2 ir Hsf1 nepavyko papildomai moduliuoti MHC-I ekspresijos (5l pav.). Norėdami parodyti GBP ir HSF1 sąveikos funkcinę svarbą naviko imunitetui, į C57BL / 6 peles pasėjome MC38 naviko ląsteles, ekspresuojančias šelaką, shGbp2, shHSF1 arba shGbp2 ir shHSF1. Palyginti su shFluc kontrolėmis, Gbp2 ir Hsf1 nutildymas palyginus paspartino naviko augimą (5m pav.) ir sumažino naviką infiltruojančių T ląstelių skaičių bei aktyvavimą (5n pav. ir išplėstiniai duomenys 7d pav.). Be to, vienu metu nutildant Gbp2 ir Hsf1 nepavyko toliau paveikti naviko augimo ir naviko infiltruojančių T ląstelių (5m pav., n ir išplėstiniai duomenys 7d pav.). Iš viso GBP stimuliuoja MHC-I ekspresiją ir priešnavikinį imunitetą, aktyvindami HSF1.

LIMIT-GBP-HSF1 ašis skatina MHC-I ir naviko imunitetą

cistanche nauda vyrams - stiprina imuninę sistemą

Toliau ištyrėme, kaip GBP suaktyvina HSF1, kad pakeistų MHC-I ekspresiją ir naviko imunitetą. Įprastomis sąlygomis monomerinis HSF1 yra susijęs su chaperonais, pvz., HSP9031, ir jų slopinamas. Jų sąveikos nutraukimas leidžia trimerizuoti ir kauptis HSF1 branduolyje, todėl jo tiksliniai genai suaktyvėja transkripcijos būdu32. Iškėlėme hipotezę, kad GBP gali sutrikdyti ryšį tarp HSP90 ir HSF1, dėl ko suaktyvėja HSF1. Norėdami išbandyti šią galimybę, A375 ląsteles apdorojome IFN ir atlikome Co-IP su HSP90 antikūnu. Mes nustatėme, kad IFN sukeltos endogeninės GBP buvo susijusios su HSP90 (6a pav.). Be to, mes transfekavome A375 ląsteles su egzogeniniu Flag-GBP1 ir atlikome Co-IP eksperimentą su Flag-antikūnu. HSP90 buvo aptiktas IP produkte iš Flag-GBP1 transfekuotų ląstelių, bet ne vektoriumi transfekuotų kontrolinių ląstelių (6b pav.). Imunofluorescencinis dažymas parodė, kad GBP ir HSP90 daugiausia buvo lokalizuoti citoplazmoje (6c pav.). Kai 293T ląsteles transfekavome didėjančiomis GBP1 plazmidžių dozėmis, HSP90-susijęs HSF1 sumažėjo priklausomai nuo dozės (6d pav.). Duomenys rodo, kad GBP sąveikavo su HSP90 ir ši sąveika sutrikdė ryšį tarp HSF1 ir HSP90. HSP90 yra daugelio baltymų lankstymo ir stabilumo chaperonas, mes suabejojome, ar GBP gali pakeisti HSP90 chaperono aktyvumą. Nors HSP90 inhibitorius slopino HSP90 kliento baltymų (tokių kaip RAF1, BCL2 ir CDK433) ekspresiją, per didelis GBP ekspresija to padaryti nepavyko (6e pav.). Taigi GBP sąveikauja su HSP90 ir išleidžia su HSP{46}}susijusią HSF1, bet nekeičia HSP90 aktyvumo. Tada mes tiesiogiai ištyrėme HSF1 vaidmenį MHC-I ekspresijoje. A375 ląsteles apdorojome IFN, dalyvaujant HSF1 inhibitoriui KRIBB11. Kaip ir tikėtasi, gydymas KRIBB11 sumažino su MHC-I susijusių genų, įskaitant HLA-ABC, TAP1, HSPA5 ir CALR, bet ne IRF1, IFN stimuliuojamos mRNR ekspresiją (6f pav.). Įdomu tai, kad KRIBB11 sumažino IFN sukeltą MHC-I ekspresiją, tačiau turėjo minimalų poveikį PD-L1 ekspresijai (6g pav.). Taigi, HSF1 gali reguliuoti IFN sukeltą MHC-I ekspresiją nekeisdamas pasaulinės IFN signalizacijos. Norėdami ištirti, ar HSF{72}}reguliuojamas MHC-I veikia, B16-OVA kultivavome su OT-I ląstelėmis, dalyvaujant KRIBB11 ir IFN. KRIBB11 slopino IFN sukeltą OVA surišto MHC-I ekspresiją (išplėstiniai duomenys 8a pav.). Atsižvelgiant į tai, KRIBB11 taip pat slopino OT-I ląstelių sukeltą citotoksinį poveikį B16-OVA (išplėstiniai duomenys, 8b pav.). Norėdami išplėsti savo stebėjimus į papildomus navikus, nutildėme Hsf1 su shHsf1 YUMM1.7 ir CT26 ląstelėse. Nutildžius Hsf1, sumažėjo MHC-I ekspresija YUMM1.7 (6h, i pav.) ir CT26 ląstelėse (išplėstiniai duomenys, 8c pav.), reaguojant į IFN stimuliaciją. YUMM1.7 ląstelėse HSF1 nutildymas nepaveikė Gbp2 ekspresijos, reaguojant į IFN (6h pav.), o tai rodo, kad Gbp2 nėra HSF1 tikslinis genas. ShHsf1 YUMM1.7 ląstelėse KRIBB11 nepavyko nuslopinti IFN stimuliuojamos MHC-I ekspresijos (išplėstiniai duomenys 8d pav.). Duomenys rodo, kad HSF1 sustiprino MHC-I ekspresiją, reaguodamas į IFN, o Hsf1 yra mechaninis KRIBB11 taikinys MHC-I reguliuoti. Atsižvelgiant į tai, kad HSF1 paveikė MHC-I ekspresiją, iškėlėme hipotezę, kad HSF1 reguliuoja priešnavikinį imunitetą in vivo . Norėdami patikrinti šią hipotezę, į NSG ir C57BL / 6 peles pasėjome kontrolines ir shHsf1 YUMM1.7 naviko ląsteles. Pastebėjome, kad HSF1 nutildymas iš dalies sulėtino YUMM1.7 naviko progresavimą NSG pelėse (6j pav.), o tai patvirtina, kad Hsf1 padėjo palaikyti baltymų homeostazę ir naviko progresavimą imuninės sistemos stokos modelyje. Tačiau Hsf1 nutildymas labai pagreitino YUMM1.7 naviko augimą laukinio tipo C57BL/6 pelėse (6k pav.). Duomenys rodo, kad Hsf1 gali stebėtinai skatinti stiprų priešnavikinį imunitetą imuninei sistemai atspariame modelyje. Tai patvirtindami nustatėme į naviką infiltruojančių CD3+, Ki67+, IFN + ir TNF + T ląstelių procentų sumažėjimą (6l pav. ir išplėstiniai duomenys, 8e pav.) shHsf1 YUMM1.7 navikai, palyginti su shFluc maišymo kontrolėmis. Be to, mes inokuliavome shHsf1 CT26 ląsteles į laukinio tipo BALB / c peles. Vėlgi, Hsf1 nutildymas padidino CT26 naviko augimą (išplėstiniai duomenys 8f pav.). Kartu sumažėjo į naviką infiltruojančių CD3+, Ki67+, IFN + ir TNF + T ląstelių procentas (išplėstiniai duomenys, 8g, h pav.). Iš viso duomenys rodo, kad GBP-HSF1 ašis skatina MHC-I ekspresiją ir priešnavikinį imunitetą. Norėdami mechaniškai sujungti Hsf1 ir LIMIT, A375 ląstelėse nutildėme LIMIT. Nutildymas LIMIT sumažino HSF1 transkripcijos aktyvumą reaguojant į IFN , kaip nustatyta luciferazės reporterio tyrimu (HSE-luc) (6m pav.). Duomenys rodo, kad LIMIT prisideda prie HSF1 aktyvinimo reaguojant į IFN. Norėdami patikrinti galimą HSF1 įsitraukimą į LIMIT sukeltą MHC-I indukciją, mes stimuliavome LIMIT per CRISPR aktyvavimą B16 ląstelėse, dalyvaujant KRIBB11. Pastebėjome, kad MHC-I padidintą reguliavimą, sukeltą LIMIT aktyvacijos, panaikino HSF1 inhibitorius (6n pav.). Duomenys rodo, kad LIMIT padidina MHC-I raišką priklausomai nuo HSF{184}}. Galiausiai išanalizavome ryšį tarp LIMIT, GBP ir HSF1 MHC-I ekspresijos, naviko imuniteto ir imunoterapijos pacientams, sergantiems vėžiu, kontekste. Klinikinė analizė parodė, kad HSF{187}}signalizuojantys genai koreliavo su MHC-I ekspresija, CD8+ T ląstelių infiltracija ir paciento išgyvenimu (išplėstiniai duomenys, 9a-c pav.). Imuninės kontrolės taško blokados tyrime pacientams, sergantiems bazalioma34, vienos ląstelės RNR sekos analizė atskleidė 2 navikų grupes; viena navikų grupė buvo jautresnė anti-PD{197}} gydymui, kaip rodo labai sumažėjusi navikų populiacija (išplėstiniai duomenys, 9d pav.). Įdomu tai, kad šis imuniniam kontroliniam taškui jautrus navikų klasteris išreiškė didesnį HSF{199}}signalizuojančių genų lygį, taip pat MHC-I genų mechanizmą (išplėstiniai duomenys, 9e pav.). Be to, atliekant imuninės kontrolės taško blokados tyrimą, kuriame dalyvavo pacientai, sergantys melanoma35, proteominė analizė parodė, kad baltymų ekspresija GBP, HSF1 signalizuojančių genų ir MHC-I buvo didesnė tarp klinikinio atsako nei nereaguojančių (išplėstiniai duomenys 9f pav.). Be to, pastebėjome teigiamą koreliaciją tarp GBP1 ir HSF{208}}signalizuojančių genų sergant žmogaus vėžiu (išplėstiniai duomenys, 9g pav.). Duomenys patvirtina, kad LIMIT-GBP-HSF1 ašis gali suaktyvinti MHC-I ekspresiją ir teikti pirmenybę priešnavikiniam imunitetui (Išplėstiniai duomenys 10 pav.).

Diskusija

Kinijos žolė cistanche augalas-Antitumor

Žmonės turi 30,000-60,000 lncRNR. Tačiau daugumos šių galimų lncRNR tapatybės ir biologinės funkcijos tebėra menkai suprantamos. Vėžio biologijos srityje lncRNR buvo daugiausia tiriamos imuninės sistemos nepakankamumo modeliu, todėl imuninės sistemos kontekste liko žinių apie lncRNR. Pranešama, kad keletas lncRNR turi įtakos imuninių ląstelių funkcijai36,37, vėžio progresavimui ir chemoterapijos veiksmingumui38,39. Tačiau ar specifinės lncRNR yra susijusios su priešnavikiniu imunitetu ir imunoterapijos atsaku, lieka neatsakyta. Šiame tyrime nustatėme, kad LIMIT yra anksčiau neapibūdinta į IFN reaguojanti lncRNR tiek žmogaus, tiek pelės ląstelėse. LIMIT gali sukelti MHC-I ir MHC-II ekspresiją, skatindamas T ląstelių sukeltą naviko imuninį atsaką ir padidindamas imunoterapijos veiksmingumą. Taigi LIMIT yra anksčiau nežinoma naviko imunogeninė lncRNR. IFN signalizacijos kelias vaidina pagrindinį vaidmenį nustatant terapinį atsaką į vėžio imunoterapiją40 naudojant kelis mechanizmus19, 20, 41, 42. Genetinės IFN signalizacijos genų mutacijos prisideda prie atsparumo kontrolinio taško blokadai pacientams, sergantiems vėžiu43-48. Tačiau IFN signalizacija gali sukelti slopinančią PD-L1 ekspresiją49. Taigi idealu nustatyti ir nukreipti pagrindinį IFN signalizuojantį geną, kuris selektyviai tarpininkauja priešnavikiniam imunitetui, o ne naviko imuniniam vengimui. Remdamiesi šia mintimi, parodome, kad LIMIT tarpininkauja MHC-I ir MHC-II reguliavimui, tačiau neturi įtakos PD-L1 ekspresijai, reaguojant į IFN . Taigi LIMIT gali būti unikalioje vietoje, kad būtų imunogeninis vėžio imunoterapijos taikinys. Buvo pasiūlytos kelios strategijos, skirtos terapiškai nukreipti į patogenines lncRNR50. Tačiau, kaip padidinti naudingų lncRNR lygį, išlieka sudėtinga. Kadangi cis veikiančios lncRNR veikia lokaliai, priverstinė šių lncRNR ekspresija gali nesugebėti tiksliai nustatyti vietos51. Nors trans-veikiančios lncRNR gali veikti per specifines antrines struktūras, per didelė šių lncRNR ekspresija gali nesugebėti sukurti jų natūralių struktūrų, nes trūksta tinkamų RNR chaperonų52. Naudodami RNR valdomą CRISPR aktyvinimo strategiją22, ikiklinikiniuose modeliuose tiesiogiai aktyvavome LIMIT ekspresiją naviko ląstelėse. RNR valdomas CRISPR LIMIT aktyvinimas gali paskatinti naviko MHC-I ekspresiją ir sustiprinti kontrolinio taško blokados terapiją. Atsižvelgiant į tai, kad žmogaus navikuose dažnai prarandami MHC-I ir IFN genų parašai, siūlome, kad naudingų lncRNR, tokių kaip LIMIT, CRISPR aktyvinimas gali išgelbėti naviko MHC-I ekspresiją ir būti galimas terapinis metodas. Ieškodami mechanizmo, kuriuo LIMIT veikia naviko imunitetą, išsiaiškinome, kad LIMIT nukreipia GBP cis būdu. GBP vaidina įgimtą imunitetą26,53,54. Pelėms, neturinčioms visos Gbps grupės, pasireiškia prastas anti-Toxoplasma gondii atsakas55. Tačiau prieš mūsų darbą mechaninis ryšys tarp LIMIT ir GBP ir biologinė GBP funkcija naviko imunitete ir imunoterapijoje nebuvo nustatyta. Išsiaiškinome, kad GBP reikia IFN sukelto naviko MHC-I ekspresijai, CD8+ T ląstelių naikinimo efektyvumui ir veiksmingai kontrolinio punkto terapijai. Duomenys rodo, kad GBP yra potencialūs tiksliniai genai, didinantys naviko imunogeniškumą. Netikėtai išsiaiškinome, kad GBP aktyvuoja HSF1, kad paskatintų MHC-I ir su MHC-I susijusią genų ekspresiją. HSF1 aktyvacija, kurią sukelia HSP90 inhibitoriai, koreliuoja su naviko kontrole imunokompetentinguose modeliuose. Tačiau, nepaisant daugelio klinikinių tyrimų su HSP90 inhibitoriais, iki šiol nė vienas iš įvertintų HSP90 inhibitorių nebuvo patvirtintas FDA vėžio gydymui. Šis nuviliantis faktas padidina galimybę, kad HSP90 inhibitoriai gali pakenkti naviko imunitetui. Šių HSP90 inhibitorių toksiškumas gali paskatinti kelių HSP90 kliento baltymų, tokių kaip RAF1 ir BCL2, sunaikinimą, kurie gali būti labai svarbūs efektorinių T ląstelių proliferacijai ir išgyvenimui59, 60. Atsižvelgiant į tai, kad GBP sąveikauja su HSP90 ir išskiria HSP{63}}apgautą HSF1, bet nekeičia HSP90 aktyvumo, mūsų duomenys rodo, kad taikymas į GBP gali būti anksčiau neįvertinta ir saugi strategija aktyvuoti HSF1 vėžio imunoterapijai. Apibendrinant, mes nustatome LIMIT kaip anksčiau nežinomą vėžio imunogeninę lncRNR. Mūsų darbas rodo, kad nukreipimas į LIMIT-GBP-HSF1 signalizacijos ašį gali išgelbėti MHC-I ekspresiją ir funkciją, pateikdamas daug žadantį vėžio imunoterapinį metodą.

Metodai

Eksperimentai su gyvūnais

Šešių – aštuonių savaičių patelė NSG (NOD.Cg-Prkdc scid Il2rg tm1Wjl/SzJ, Stock# 005557), C57BL/6 (C57BL/6J, Stock# 000664), BALB/c (BALB) /cJ, Stock# 000651) ir OT-1 (C57BL/6-Tg(TcraTcrb)1100Mjb/J, Stock# 003831) pelės buvo gautos iš Džeksono laboratorijos. Visos pelės buvo laikomos sąlygomis, kuriose nėra patogenų. Gyvūnų kambaryje yra kontroliuojama temperatūra (18-23 laipsnis), drėgmė (40-60%) ir 12 šviesos / 12 tamsos ciklas. YUMM1.7 (1 × 105), CT26 (1 × 105), MC38 (2,5 × 106) ir B16 (1 × 105) ląstelės buvo sušvirkštos po oda į dešinįjį pelių šoną. Gydant anti-PD-L1 MC38 modelyje, 5 mg/kg anti-PD-L1 (InVivoMAb, 10F.9G2) ir kontrolinio antikūno (InVivoMAb, LTF-2) buvo į pilvaplėvės ertmę suleidžiama 6, 9 dienomis, ir 12 po naviko inokuliacijos. Gydant anti-PD-L1 B16 modelyje, 5 mg/kg anti-PD-L1 (InVivoMAb, 10F.9G2) ir kontrolinio antikūno (InVivoMAb, LTF-2) buvo į pilvaplėvės ertmę 0, 3 dienomis, 6, 9, 12 ir 15 po naviko inokuliacijos. Naviko skersmuo buvo matuojamas naudojant suportus. Naviko tūris buvo apskaičiuotas pagal ilgis × plotis × plotis / 2. Tyrimai su gyvūnais buvo atlikti patvirtinus Mičigano universiteto Instituciniam gyvūnų priežiūros ir naudojimo komitetui (PRO00008278). Tyrimas atitinka visas susijusias etikos taisykles, susijusias su gyvūnų tyrimais. Nė viename iš eksperimentų ksenografinio naviko dydis neviršijo 2 cm jokiais matmenimis ir nė vienam gyvūnui nebuvo stipraus pilvo išsipūtimo (didesnis arba lygus 10% pradinio kūno svorio padidėjimo). Imties dydis buvo pasirinktas remiantis preliminariais duomenimis. Po naviko inokuliacijos pelės buvo atsitiktinai suskirstytos į skirtingas grupes gydymui.

Reagentai

KRIBB11 ir 17-AAG buvo įsigyti iš „Cayman Chemical“. MG-132, Puromicinas ir Luperox buvo iš Sigma-Aldrich. Rekombinantinis žmogaus IFN (285-IF), IFN (8499-IF), TNF (210-TA), IL-1 (201-LB), IL{{ 9}} (206-IL) ir pelės IFN (485-MI) buvo iš MTEP.

Plazmidės

Norint sukurti HSE-LUC, DNR sekos, atitinkančios šilumos šoko elementus (HSE), buvo susintetintos, atkaitintos ir surištos į PGL3-bazinę (Promega) plazmidę. FLAG-HSF1 buvo dovana iš Stuart Calderwood (Addgene #32537). Žmogaus GBP1, GBP2, GBP5 ir pelės Gbp2 priverstinei ekspresijai atitinkamos koduojančios sekos buvo amplifikuotos iš cDNR, gautos iš IFN iš anksto apdorotų A375 ląstelių arba B16 ląstelių, ir vėliau įterptos į PCI-Flag plazmidę. PCI-Flag plazmidė buvo paruošta į PCI-neo (Promega) plazmidę tarp NheI ir XhoI įterpiant šią Kozak seką ir Flag žymą bei 5 × Glicino seką. Norint numušti žmogaus LIMIT ir pelės LIMIT, buvo sukurtos shRNR ir įterptos į PLKO.1 plazmidę (Addgene #10879). ShRNR, nukreipta į ugnies luciferazę (shFluc), buvo neigiama kontrolė. Norint nukreipti į CRISPR aktyvinimo ribos promotoriaus sritį, sgRNR (sgLimit) buvo sukurtos ir įterptos į phU6- sgRNR plazmidę (Addgene #53188). Netikslinė sgRNR (sgNT) buvo neigiama kontrolė. Norint ištrinti STAT1 / IRF1 surišimo vietas LIMIT promotoriuje, buvo sukurtos suporuotos sgRNR (psgLIMIT) ir įterptos į PX459 plazmidę (Addgene #48139). Norėdami numušti pelės Hsf1 ir Gbp2, buvo sukurtos shRNR ir įterptos į PLKO.1 plazmidę (Addgene #10879). Norint išmušti GBP{28}}, sgRNR buvo sukurta ir įterpta į PX459 plazmidę (Addgene Nr. 48139). Tikslinės sekos išvardytos 7 papildomoje lentelėje. Pradmenų sekos išvardytos 8 papildomoje lentelėje.

Ląstelių kultūros

Žmogaus melanomos ląstelių linija A375 (CRL-1619), pelių melanomos ląstelių linijos, B16-F0 (CRL-6322) ir YUMM1.7 (CRL-3362) ), pelių gaubtinės žarnos vėžio ląstelių linija CT26 (CRL-2638) ir 293T (CRL-3216) buvo įsigytos iš Amerikos tipo kultūrų kolekcijos (ATCC). Pelės gaubtinės žarnos vėžio ląstelių linija MC38 anksčiau buvo naudojama Zou laboratorijoje 23, 48. B16- OVA ląstelės buvo nustatytos, kaip buvo pranešta anksčiau42. Šio tyrimo metu buvo sukurtos A375 STAT1 KO, A375 GBP1-5 KO ir A375 LIMIT promotoriaus ištrynimo ląstelių linijos. Visos ląstelių linijos buvo reguliariai tikrinamos dėl užteršimo mikoplazma ir patvirtinta, kad mikoplazma yra neigiama. Ląstelės buvo kultivuojamos RMPI terpėje (Gibco #11875), papildytoje 10% FBS, išskyrus A375 ir 293T ląsteles, pastarosios 2 linijos buvo kultivuojamos DMEM (Gibco #11965), papildytu 10% FBS. Visos ląstelės buvo palaikomos 37 laipsnių temperatūroje ir 5% CO2. Dėl šilumos šoko ląstelės buvo dedamos į inkubatorių 43 laipsnių temperatūroje ir 5% CO2 2 valandoms. Kad būtų sukurtos numuštos ląstelių linijos, lentivirusinės dalelės buvo pagamintos transfekuojant PLKO.1 shRNR plazmidę su psPAX2 (Addgene #12260) ir pMD2.G (Addgene #12259) (4:3:1) į 293T ląsteles, o vėliau perkeltos į naviko ląsteles. ląstelės su polibrenu (Sigma-Aldrich, 8 ug/ml) per naktį. Praėjus 48 valandoms po transfekcijos, ląstelės buvo atrinktos puromicinu (1-2 ug/ml) dar 2 savaites. Norint nustatyti išmušamąsias ląstelių linijas, PX459- sgRNR plazmidės buvo transfekuotos į naviko ląsteles 2 dienas ir atrenkamos puromicinu (1-2 ug/ml) dar 2 dienas. Tada ląstelės buvo nuosekliai praskiestos ir pasėtos į 96 šulinėlių plokšteles. Po 2-3 savaičių pavienių ląstelių kolonijos buvo atskirtos ir iš naujo pasodintos į 6 šulinėlių plokšteles. Ląstelėms susiliejus, pusė ląstelių buvo surinktos ir patvirtintos išmušimo (KO) efektyvumui naudojant Western blot metodą. Norint pritaikyti CRISPR aktyvinimo sistemą pelės limitui suaktyvinti, phU6-sgRNR buvo transfekuotos kartu su SP-dCas9-VPR (Addgene #63798) į B16 ląsteles. Visos transfekcijos buvo atliktos su lipofectamine 2000 (Thermofisher) santykiu 1 ug plazmidės: 2 ul transfekcijos regento. Transfekcijos dozė buvo nustatyta titruojant.

Liuciferazės aktyvumo tyrimas

A375 ląstelės buvo transfekuotos HSE-LUC ir PRL-SV40P (Addgene #27163) 24 valandas, kartu su PCI-neo (vektoriumi) arba GBP1, GBP2 48 valandas. A375 shFluc arba A375 shLIMIT ląstelės buvo transfekuotos HSE-LUC ir PRL-SV40P (Addgene # 27163) 24 valandas, o po to dar 48 valandas apdorotos IFN. Liuciferazės aktyvumas ugniagesių luciferazei (HSE-LUC) ir renilės luciferazei (PRL-SV40P) buvo išmatuotas naudojant dvigubo liuciferazės reporterio tyrimo sistemą (Promega). Santykinis ugniagesių luciferazės aktyvumas buvo normalizuotas su renilės luciferazės aktyvumu.

Paviršiaus dažymas ir srauto citometrijos analizė (FACS)

Ląstelės buvo tripsinizuojamos ir plaunamos MACS buferiu (PBS, 2% FBS, 1 mM EDTA). Paviršiaus dažymas atliktas į ląstelių suspensiją 50 ul MACS buferyje pridedant šiuos antikūnus: anti-HLA-ABC (G46-2.6, BD Biosciences), anti-H2-Db (KH95, BD Biosciences), anti-H2-Dd (34-2-12, BD Biosciences), anti-OVA-H2-Kb (eBio25-D1.16, eBioscience) ir anti-PD-L1 (MIH1, BD Biosciences). Po 30 minučių inkubacijos ląstelės buvo plaunamos MACS buferiu ir analizuojamos BD Fortessa srauto citometru.

Kiekybinė PGR (qPCR) analizė

Bendra RNR buvo išskirta iš ląstelių gryninant kolonėlę (Direct-zol RNA Miniprep Kit, Zymo Research) apdorojant DNaze. cDNR buvo susintetinta naudojant „RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit“ („Thermo Fisher Scientific“) su atsitiktiniais heksameriniais pradmenimis. Kiekybinė PGR (qPCR) buvo atlikta su cDNR naudojant Fast SYBR Green Master Mix (Thermo Fisher Scientific) StepOnePlus Real-Time PGR sistemoje (Thermo Fisher Scientific). Genų ekspresija buvo kiekybiškai įvertinta naudojant pradmenis, išvardytus 8 papildomoje lentelėje. MRNR ekspresijos pakitimai buvo apskaičiuoti taikant ΔΔCt metodą, naudojant ACTB kaip endogeninę kontrolę. Rezultatai išreiškiami kaip lenkimo pokytis, normalizuojant pagal kontrolę.

Northern bloting

Northern blot analizė buvo atlikta naudojant 10 ug bendros RNR, paruoštos iš IFN, IFN ir TNF iš anksto apdorotų A375 ląstelių. RNR buvo išspręstos denatūruojančio agarozės gelio elektroforezės būdu (Ambion) ir perkeltos į Hybond-XL membranas (GE Healthcare). LIMIT buvo aptiktas naudojant digoksinu pažymėtus DNR zondus su DIG Northern Starter Kit (Roche). Zondo sekos, nukreiptos į LIMIT, yra išvardytos 7 papildomoje lentelėje.

Greitas cDNR galų amplifikavimas (RACE)

RACE buvo atlikta siekiant nustatyti žmogaus LIMIT arba pelės ribos cDNR galus su SMARTer RACE cDNA amplifikacijos rinkiniu (Clontech). RACE pradmenys išvardyti 8 papildomoje lentelėje.

Klonas viso ilgio LIMIT

Gavus cDNR galo sekas, viso ilgio LIMIT buvo amplifikuotas PCR ir įterptas į PCI-neo plazmidę tarp XhoI ir NotI. Žmogaus LIMIT ir pelės limito klonų pradmenys yra išvardyti 8 papildomoje lentelėje.

Ląstelių frakcionavimas RT-PGR

IFN iš anksto apdorotos A375 ląstelės buvo surinktos iš 15 cm plokštelių grandymo būdu ir vieną kartą plaunamos šaltu PBS. Ląstelės buvo granuliuotos centrifuguojant 700 g 5 minutes ir lizuojamos hipotoniniu lizės buferiu (10 mM Tris (pH 7,5), 10 mM NaCl, 3 mM MgCl2, 0,3 % (tūris/tūris) NP{{ 12}}, 10 % (tūrio/tūrio) glicerolio) citoplazminei frakcijai surinkti. Citoplazminė RNR buvo gauta nusodinant etanoliu per naktį -20 laipsnių temperatūroje, po to pakartotinai ekstrahuojant naudojant TRIZOL reagentą. Likusi branduolinė granulė tris kartus plaunama hipotoniniu lizės buferiu, po to ekstrahuojama TRIZOL reagentu pagal gamintojo instrukcijas. RNR, išskirtos iš branduolinių arba citoplazminių frakcijų, buvo atvirkštinės transkribuotos ir RT-PCR, siekiant LIMIT, su nurodytais pradmenimis. Nesujungtas arba subrendęs ACTB buvo naudojamas kaip branduolinės arba citoplazminės RNR kontrolė. ACTB pradmenys yra išvardyti 8 papildomoje lentelėje.

Western blotingas

Ląstelės buvo plaunamos šaltu PBS ir lizuojamos 1 × RIPA lizės buferyje (Pierce) su 1 × proteazės inhibitoriumi (Pierce). Lizatai buvo inkubuojami ant ledo 10 minučių ir nuvalomi centrifuguojant 15, 000g 15 minučių. Baltymų koncentracija buvo kiekybiškai įvertinta naudojant BCA baltymų tyrimo rinkinį (Thermo Fisher). Trisdešimt mikrogramų baltymų buvo sumaišyti su mėginio buferiu (Thermo Fisher) su -ME ir denatūruoti 95 laipsnių temperatūroje 5 minutes. Mėginys buvo atskirtas SDS-PAGE ir perkeltas į nitroceliuliozės membraną (Bio-Rad). Membranos buvo užblokuotos 5% m/v neriebiu sausu pienu ir inkubuojamos su pirminiais antikūnais per naktį 4 laipsnių temperatūroje ir su HRP konjuguotais antriniais antikūnais (CST) 1 valandą kambario temperatūroje. Signalas buvo aptiktas naudojant Clarity ir Clarity Max Western ECL Blotting Substrates (Bio-Rad) ir užfiksuotas naudojant ChemiDoc Imaging System (Bio-Rad). Antikūnai buvo tokie: anti-žmogaus GBP1-5 (Santa Cruz, 166960, 1:500), anti-HSF1 (CST, 12972, 1:1, 000), anti-Phospho HSF1 (Abcam). , 76076, 1: 1000), anti-GBP1 (Proteintech, 15303, 1: 1,000), anti-Gbp2 (Proteintech, 11854, 1: 1,000) , anti-HSP90 (CST, 4877, 1:1,000), anti-HSPA5 (CST, 3177, 1:1,000), anti-STAT1 (CST, 9172, 1:1) ,000), anti-Phospho-STAT1 (CST, 9167, 1:1000), anti-RAF1 (CST, 9422, 1: 1000), anti-BCL2 (CST, 2870, 1) : 1000), anti-CDK4 (CST, 12790, 1: 1000) ir anti-GAPDH (Proteintech, 60004, 1: 5 000). Atliekant žmogaus MHC-I Western blot metodą, visi ląstelių lizatai buvo denatūruoti mėginio buferyje be -ME (neredukuojantis), kad būtų išlaikyti disulfidiniai tilteliai ir baltymų konformacija, kurią reikia aptikti anti-HLA-ABC antikūnu (W6/32). , Novus Biologicals, 64775, 1: 1 000).

Bendras imunoprecipitacija (Co-IP)

Ląstelės buvo surinktos naudojant IP lizės buferį (Pierce, 87787) ir proteazės inhibitorių. Baltymų koncentracija buvo nustatyta naudojant BCA baltymų tyrimo rinkinį. 200-500 ug baltymų mėginių buvo pridėta prie 1-3 ug pirminių antikūnų anti-HSP90 (Proteintech, 13171) arba anti-HSF1 (CST, 12972) ir inkubuojami švelniai siūbuojant 4 laipsnių temperatūroje per naktį. Tada mėginiai buvo toliau inkubuojami su 20 ul Protein A/G PLUS-Agarose (Santa Cruz, sc{12}}) 2 valandas 4 laipsnių temperatūroje; ir centrifuguojamas 7500 × g 30 sekundžių 4 laipsnių kampu. Ląstelių granulės buvo plaunamos 4 kartus su IP lizės buferiu, pakartotinai suspenduotos 40 ul 2 × mėginio buferio su -ME ir kaitinamos 5 minutes 95 laipsnių temperatūroje. Denatūruotų baltymų mėginiai buvo analizuojami Western blot metodu. Flag IP atveju ląstelių lizatai buvo inkubuojami su 20 ul EZview Red ANTI-FLAG M2 affinity gelio (Sigma Aldrich) ir plaunami, denatūruojami ir analizuojami, kaip aprašyta aukščiau.

Imunofluorescencinis dažymas

A375 ląstelės, pritvirtintos ant dengiamųjų stiklelių, buvo apdorotos IFN 24 valandas. Po 2 kartų plovimo PBS, ląstelės buvo fiksuotos 4% PFA 15 minučių ir 2 kartus plaunamos PBS po 5 minutes. Tada ląstelės 10 minučių buvo pralaidžios 0,5% triton x-100 PBS ir 2 kartus plaunamos PBS po 5 minutes. Antigenai buvo blokuojami 10% normaliu ožkos serumu PBS 30 minučių. Tada buvo pridėta pirminių antikūnų 1:50 praskiedimų pelės anti-žmogaus GBP 1-5 antikūno (Santa Cruz, 166960) arba triušio antikūno prieš žmogaus HSP90 (CST, 4877) ir inkubuojami 4 laipsnių temperatūroje per naktį. Po to ląstelės buvo plaunamos ir inkubuojamos su Qdot 605 pažymėto antrinio ožkos anti-pelės antikūno (Thermo Fisher, Q11002) arba AF{29}}žymėto antrinio ožkos anti-triušio antikūno (Thermo Fisher, A11034) santykiu 1:500. o tada montuojamas ant stiklinių stiklelių su ProLong Gold reagentu, kuriame yra DAPI. Konfokaliniai fluorescenciniai vaizdai buvo renkami naudojant 63X alyvos imersinį objektyvą (Leica SP5 Inverted 2-Photon FLIM confocal).

Chromatino imunoprecipitacija (ChIP)

ChIP buvo atlikta su kryžminiu ryšiu susietu chromatinu iš IFN apdorotų A375 ląstelių ir arba HSF1 antikūnu (CST, 12972) arba normaliu triušio IgG (CST, 2729), naudojant Simple ChIP Plus fermentinį chromatino IP rinkinį (magnetinės granulės) (CST, 9005). Praturtinta DNR buvo kiekybiškai įvertinta realiuoju laiku PGR, naudojant pradmenis, išvardytus 8 papildomoje lentelėje. Imuninės DNR kiekis kiekviename mėginyje buvo parodytas kaip signalas, palyginti su bendru įvesto chromatino kiekiu, kuris yra lygus 1.

OT-I ląstelių išskyrimas ir auginimas kartu su OVA+ naviko ląstelėmis

C57BL/6-Tg(TcraTcrb)1100Mjb/J (OT-I) pelės (JAX atsargos Nr. 003831) buvo įsigytos iš The Jackson Laboratory. Blužnis buvo homogenizuotas ir pavienės ląstelės buvo suspenduotos 2 ml raudonųjų kraujo kūnelių lizės buferio (Sigma-Aldrich) 1 minutę. Splenocitai buvo susmulkinti, nuplauti ir resuspenduoti 2 × 106 ląstelių viename ml RPMI auginimo terpėje, kurioje yra 1 ug/ml OVA{11}} peptido, 5 ug/ml pelių rekombinantinio IL-2 ir 40 μM { {15}} merkaptoetanolio. Ląstelės buvo inkubuojamos 37 laipsnių temperatūroje 5 dienas. Norint sukurti bendrą OT-I ir OVA+ naviko ląstelių kultūrą, splenocitai buvo surinkti po 5-dienos aktyvacijos. OT-I ląstelės buvo išgrynintos naudojant EasySep pelės CD8+ T ląstelių izoliavimo rinkinį (Stemcell). B16-OVA ląstelės buvo pasėtos per naktį. Tada OT-I ląstelės buvo pridėtos į kultūrą skirtingais santykiais. Visos ląstelės buvo surinktos tripsinizuojant ir analizuojamos srauto citometrija (FACS).

Kaulų čiulpų kilmės dendritinės ląstelės (BMDC) ir makrofagai (BMDM)

Kaulų čiulpai buvo išskirti iš C57BL/6 pelių šlaunikaulio ir kultivuoti pilnoje RPMI1640 terpėje su 20 ng/ml GM-CSF (R&D). Ląstelės buvo inkubuojamos 37 laipsnių temperatūroje ir 5% CO2. 3 dieną buvo pridėta papildoma 10 ml terpės su 20 ng/ml GM-CSF. 7 dieną kultūros supernatante neprilipusios ir laisvai prilipusios ląstelės buvo paimtos švelniai plaunant PBS ir buvo laikomos BMDC. Prilipusios ląstelės buvo laikomos BMDM.

Intratumorinis imuninių ląstelių profiliavimas

Norint kiekybiškai įvertinti intratumorines T ląsteles ir T ląstelių efektoriaus citokinų ekspresiją, iš šviežių naviko audinių buvo paruoštos vienos ląstelės suspensijos, fiziškai praleidžiant per 100 μm ląstelių koštuvus. Imuninės ląstelės buvo praturtintos centrifuguojant tankio gradientu. Citokinų dažymui intratumorinės imuninės ląstelės buvo inkubuojamos RPMI auginimo terpėje, kurioje buvo PMA (5 ng/ml), jonomicino (500 ng/ml), brefeldin A (1:1, 000) ir Monessen (1:1). ,000) 37 laipsnių temperatūroje 4 valandas. 2-3 ul anti-CD45 (30-F11, BD Biosciences), anti-CD90 (53-2.1, BD Biosciences), anti-CD3 (145-2C11, BD) Biosciences), anti-CD4 (RM4-5, BD Biosciences) ir anti-CD8 (53-6.7, BD Biosciences) antikūnai buvo pridėti 20 minučių paviršiaus dažymui. Tada ląstelės buvo plaunamos ir per naktį resuspenduojamos 1 ml šviežiai paruošto Fix / Perm tirpalo (BD Biosciences) 4 laipsnių temperatūroje. Nuplovus Perm/Wash buferiu (BD Biosciences), ląstelės buvo nudažytos 2-3ul anti-Ki67 (B56, BD Biosciences), anti-TNF (MP6-XT22, BD Biosciences), ir anti-IFN (XMG1.2, BD Biosciences) 30 minučių, išplauti ir fiksuoti 4% formaldehidu (Sigma Aldrich). Visi mėginiai buvo nuskaityti LSR Fortessa citometru ir analizuojami naudojant FACS DIVA programinę įrangą v. 8.0 (BD Biosciences).

Parašo balo skaičiavimas

Naudojome normalizuotą genų ekspresiją, kad nustatytų šiuos parašus: CD8+ T ląstelių infiltracija (CD8A, CD8B, PRF1 ir GZMB), MHC-I ekspresija (HLA-A, HLA-B ir HLA-C) , ir HSF1 signalizacija (HSPA1A, HSPA1B, HSPA5 ir HSP90B1).

Statistinė analizė

Ląstelių eksperimentams, jei nenurodyta kitaip, kiekviename atskirame eksperimente buvo atlikti trys biologiniai egzemplioriai. Tyrimams su gyvūnais buvo naudojami ne mažiau kaip 5 pakartojimai kiekvienoje grupėje. Gyvūnai buvo atsitiktinai suskirstyti į skirtingas grupes po naviko ląstelių inokuliacijos. Eksperimentų ir rezultatų vertinimo metu tyrėjai nebuvo akli paskirstymui. Duomenys rodomi kaip vidutinės vertės su standartiniu išvedimu. Statistinė analizė atlikta naudojant GraphPad Prism8 programinę įrangą (GraphPad Software, Inc.). Dvipusis 2-pusis t testas buvo naudojamas lyginant gydymo grupes su kontrolinėmis grupėmis; Išgyvenamumo funkcija buvo įvertinta Kaplan-Meier metodais, o statistiniams skirtumams apskaičiuoti naudotas log-rank testas.

Duomenų prieinamumas

RNA-seq duomenys (GSE99299) ir apdoroti vienos ląstelės duomenys (GSE123814) buvo gauti iš Gene Expression Omnibus (GEO). MS proteomikos duomenys (PXD006003) buvo gauti iš PRIDE saugyklos. TCGA vėžio duomenų rinkiniai buvo gauti iš UCSC Xena (//xena.ucsc.edu/). RNR-seq duomenis ir klinikinę informaciją ICB klinikiniams tyrimams pateikė atitinkami autoriai. Visus neapdorotus duomenis, patvirtinančius šio tyrimo išvadas, galima gauti iš atitinkamo autoriaus paprašius. Šiame darbe pateikti šaltiniai.

Kodo prieinamumas

Visos šiame tyrime naudotos analizės buvo atliktos pagal Prism Graphpad 8 versijos vadovus.{1}} ir internetinę svetainę http://xena.ucsc.edu/. Šio tyrimo metu nebuvo sukurtas naujas kodas ar algoritmai.

Išplėstiniai duomenys

Išplėstiniai duomenys 1 pav.:

LIMIT koreliuoja su efektoriniais imuniniais genais įvairiuose vėžio tipuose.

Išplėstiniai duomenys 2 pav.:

Žmogaus LIMIT ir pelės limito genetiniai lokusai ir sekos.

Išplėstiniai duomenys 3 pav. LIMIT padidina MHC-1 išraišką

Išplėstiniai duomenys 5 pav.:

LIMIT padidina antigenu pakrautą MHC-1 ekspresiją in vivo.

Išplėstiniai duomenys 6 pav.:

LIMIT cis aktyvina GBP, kad padidintų MHC{1}} ir naviko imunitetą.

Išplėstiniai duomenys 7 pav.:

GBP suaktyvina HSF1, kad paskatintų MHC-I ekspresiją.

Išplėstiniai duomenys 8 pav.:

HSF1 skatina MHC-I ekspresiją ir naviko imunitetą.

Išplėstiniai duomenys 9 pav.:

HSF1 signalizacijos genai koreliavo su MHC-I ir naviko imunitetu.

Išplėstiniai duomenys 10 pav. Schema, rodanti, kaip LIMIT-GBP-HSF1 ašis veikia MHC-I ir naviko imunitetą

Papildoma medžiaga

Norėdami gauti papildomos medžiagos, žr. žiniatinklio versiją PubMed Central.

Padėkos

Dėkojame Zou laboratorijos nariams už jų intelektualų indėlį. Šis darbas buvo iš dalies paremtas JAV NIH/NCI R01 dotacijų (CA217648, CA123088, CA099985, CA193136, CA152470) (WZ) ir (CA216919, CA213566, CA120458 per NIH ir universitetą) Mičigano Rogelio vėžio centro dotacijos (CA46592).

Nuorodos

1. Zou W, Wolchok JD ir Chen L PD-L1 (B7-H1) ir PD-1 kelio blokada vėžio gydymui: mechanizmai, atsako biomarkeriai ir deriniai. Sci Transl Med 8, 328rv324, doi:10.1126/ scitranslmed.aad7118 (2016).

2. Schumacher TN & Schreiber RD Neoantigenai vėžio imunoterapijoje. Science 348, 69–74, doi: 10.1126/science.aaa4971 (2015). [Pubmed: 25838375]

3. Garcia-Lora A, Algarra I ir Garrido F MHC I klasės antigenai, imuninė priežiūra ir naviko imuninis pabėgimas. J Cell Physiol 195, 346–355, doi: 10.1002/jcp.10290 (2003). [Pubmed: 12704644]

4. Festenstein H & Garrido F MHC antigenai ir piktybiniai navikai. Nature 322, 502–503, doi: 10.1038/322502a0 (1986). [Pubmed: 3461283]

5. Garrido F, Aptsiauri N, Doorduijn EM, Garcia Lora AM ir van Hall T Skubus poreikis susigrąžinti I klasės MHC sergant vėžiu veiksmingai imunoterapijai. Curr Opin Immunol 39, 44–51, doi: 10.1016 / j.coi.2015.12.007 (2016). [PubMed: 26796069]

6. Hon CC ir kt. Žmogaus ilgų nekoduojančių RNR su tiksliais 5' galais atlasas. Nature 543, 199–204, doi: 10.1038/nature21374 (2017). [Pubmed: 28241135]

7. Mercer TR, Dinger ME & Mattick JS Ilgos nekoduojančios RNR: funkcijų įžvalgos. Nat Rev Genet 10, 155–159, doi: 10.1038/nrg2521 (2009). [Pubmed: 19188922]

8. Ponting CP, Oliver PL & Reik W Ilgų nekoduojančių RNR evoliucija ir funkcijos. Cell 136, 629–641, doi:10.1016/j.cell.2009.02.006 (2009). [Pubmed: 19239885]

9. Wilusz JE, Sunwoo H & Spector DL ​​Ilgos nekoduojančios RNR: funkcinės staigmenos iš RNR pasaulio. Genes Dev 23, 1494–1504, doi: 10.1101/gad.1800909 (2009). [Išleista: 19571179]

10. Kung JT, Colognori D & Lee JT Ilgos nekoduojančios RNR: praeitis, dabartis ir ateitis. Genetics 193, 651–669, doi: 10.1534/genetics.112.146704 (2013). [PubMed: 23463798]

11. Flynn RA & Chang HY Ilgos nekoduojančios RNR ląstelės likimo programavimo ir perprogramavimo metu. Cell Stem Cell 14, 752–761, doi:10.1016/j.stem.2014.05.014 (2014). [Pubmed: 24905165]

12. Huarte M. Kylantis lncRNR vaidmuo sergant vėžiu. Nat Med 21, 1253–1261, doi: 10.1038/nm.3981 (2015). [PubMed: 26540387]

13. Frankish A ir kt. Žmogaus ir pelės genomų GENCODE nuorodos anotacija. Nucleic Acids Res 47, D766–D773, doi: 10.1093/nar/gky955 (2019). [Pubmed: 30357393]

14. Riaz N ir kt. Naviko ir mikroaplinkos evoliucija imunoterapijos su nivolumabu metu. Cell 171, 934–949 e916, doi:10.1016/j.cell.2017.09.028 (2017). [PubMed: 29033130]

15. Hugo W ir kt. Genominiai ir transkriptominiai atsako į anti-PD-1 terapiją metastazavusios melanomos atveju. Cell 168, 542, doi:10.1016/j.cell.2017.01.010 (2017).

16. Van Allen EM ir kt. Genominės koreliacijos atsako į CTLA-4 blokadą sergant metastazavusia melanoma. Science 350, 207–211, doi: 10.1126/science.aad0095 (2015). [PubMed: 26359337]

17. Nathanson T ir kt. Somatinės mutacijos ir neoepitopo homologija melanomose, gydomose CTLA-4 blokada. Cancer Immunol Res 5, 84–91, doi: 10.1158/2326-6066.CIR-16-0019 (2017). [Pubmed: 27956380]

18. Sui J ir kt. Sisteminga naujojo su lncRNR susijusio parašo, kaip prognostinio kepenų ląstelių karcinomos biomarkerio, analizė. Cancer Med, doi: 10.1002/cam4.1541 (2018).

19. Kaplan DH ir kt. Nuo gama interferono priklausomos naviko stebėjimo sistemos demonstravimas imunokompetentingose ​​pelėse. Proc Natl Acad Sci USA 95, 7556–7561, doi: 10.1073/pnas.95.13.7556 (1998). [Pubmed: 9636188]

20. Fruh K & Yang Y antigeno pateikimas pagal MHC I klasę ir jo reguliavimas gama interferonu. Curr Opin Immunol 11, 76-81 (1999). [PubMed: 10047537]

21. Dong H ir kt. Su naviku susijęs B7-H1 skatina T ląstelių apoptozę: galimas imuninės sistemos vengimo mechanizmas. Nat Med 8, 793–800, doi: 10.1038/nm730 (2002). [Pubmed: 12091876]

22. Perez-Pinera P ir kt. RNR valdomas genų aktyvinimas CRISPR-Cas{4}}pagrįstais transkripcijos faktoriais. Nat Methods 10, 973–976, doi: 10.1038/nmeth.2600 (2013). [PubMed: 23892895]

23. Lin H ir kt. PD-L1 šeimininko ekspresija lemia PD-L1 kelio blokados sukeltos naviko regresijos efektyvumą. J Clin Invest 128, 1708, doi: 10.1172/JCI120803 (2018). [Pubmed: 29608143]

24. Sun Q, Hao Q & Prasanth KV Branduolinės ilgos nekoduojančios RNR: pagrindiniai genų ekspresijos reguliatoriai. Trends Genet 34, 142–157, doi: 10.1016/j.tig.2017.11.005 (2018). [Pubmed: 29249332]

25. Cheng YS, Colonno RJ & Yin FH Fibroblastų baltymų su guanilato surišimo aktyvumu interferonas. J Biol Chem 258, 7746-7750 (1983). [PubMed: 6305951]

26. Kim BH ir kt. Interferono sukelti guanilatą surišantys baltymai uždegimo aktyvavime ir šeimininko gynyboje. Nat Immunol 17, 481–489, doi: 10.1038/ni.3440 (2016). [PubMed: 27092805]

27. Messeguer X ir kt. PROMO: žinomų transkripcijos reguliavimo elementų aptikimas naudojant pagal rūšis pritaikytas paieškas. Bioinformatics 18, 333–334, doi: 10.1093/bioinformatics/18.2.333 (2002). [Pubmed: 11847087]

28. Konsorciumas, EP Integruota žmogaus genomo DNR elementų enciklopedija. Nature 489, 57–74, doi: 10.1038/nature11247 (2012). [PubMed: 22955616]

29. Dai C & Sampson SB HSF1: Proteostazės sergėtojas sergant vėžiu. Trends Cell Biol 26, 17–28, doi: 10.1016/j.tcb.2015.10.011 (2016). [PubMed: 26597576]

30. West JD, Wang Y & Morano KA Mažos molekulės šilumos šoko reakcijos aktyvatoriai: cheminės savybės, molekuliniai taikiniai ir terapinis pažadas. Chem Res Toxicol 25, 2036–2053, doi: 10.1021/tx300264x (2012). [PubMed: 22799889]

31. Zou J, Guo Y, Guettouche T, Smith DF & Voellmy R Šiluminio šoko transkripcijos faktoriaus HSF1 aktyvacijos slopinimas HSP90 (HSP90 kompleksas), kuris sudaro stresui jautrų kompleksą su HSF1. Cell 94, 471-480 (1998). [Pubmed: 9727490]

32. Dayalan Naidu S & Dinkova-Kostova AT Žinduolių šilumos šoko faktoriaus 1 reguliavimas. FEBS J 284, 1606–1627, doi:10.1111/febs.13999 (2017). [Pubmed: 28052564]

33. Whitesell L & Lindquist SL HSP90 ir vėžio priežiūra. Nat Rev Cancer 5, 761–772, doi: 10.1038/nrc1716 (2005). [Pubmed: 16175177]

34. Yost KE ir kt. Navikui specifinių T ląstelių kloninis pakeitimas po PD-1 blokados. Nat Med 25, 1251–1259, doi: 10.1038/s41591-019-0522-3 (2019). [Pubmed: 31359002]

35. Harel M ir kt. Melanomos atsako į imunoterapiją proteomika atskleidžia mitochondrijų priklausomybę. Cell 179, 236–250 e218, doi:10.1016/j.cell.2019.08.012 (2019). [Pubmed: 31495571]

36. Heward JA & Lindsay MA Ilgos nekoduojančios RNR reguliuojant imuninį atsaką. Trends Immunol 35, 408–419, doi: 10.1016/j.it.2014.07.005 (2014). [Pubmed: 25113636]

37. Flores-Concha M & Onate AA Ilgos nekoduojančios RNR imuninio atsako ir lavinto imuniteto reguliavime. Front Genet 11, 718, doi: 10.3389/fgene.2020.00718 (2020). [Pubmed: 32793280]

38. Schmitt AM ir Chang HY Ilgos nekoduojančios RNR vėžio keliuose. Cancer Cell 29, 452–463, doi: 10.1016/j.ccell.2016.03.010 (2016). [PubMed: 27070700]

39. Sun TT ir kt. LncRNA GClnc1 skatina skrandžio kancerogenezę ir gali veikti kaip modulinis WDR5 ir KAT2A kompleksų karkasas, siekiant nurodyti histono modifikacijos modelį. Cancer Discov 6, 784–801, doi: 10.1158/2159-8290.CD-15-0921 (2016). [Pubmed: 27147598]

40. Sharma P, Hu-Lieskovan S, Wargo JA & Ribas A Primary, Adaptive and Acquired Resistance to Cancer Imunotherapy. Cell 168, 707–723, doi:10.1016/j.cell.2017.01.017 (2017). [Pubmed: 28187290]

41. Peng D ir kt. Epigenetinis TH1-tipo chemokinų nutildymas formuoja naviko imunitetą ir imunoterapiją. Nature 527, 249–253, doi: 10.1038/nature15520 (2015). [PubMed: 26503055]

42. Wang W ir kt. CD8 (+) T ląstelės reguliuoja naviko ferroptozę vėžio imunoterapijos metu. Nature 569, 270–274, doi: 10.1038/s41586-019-1170-y (2019). [Pubmed: 31043744]

43. Gao J ir kt. IFN-gama kelio genų praradimas navikinėse ląstelėse kaip atsparumo anti-CTLA-4 terapijai mechanizmas. Cell 167, 397–404 e399, doi:10.1016/j.cell.2016.08.069 (2016). [Pubmed: 27667683]

44. Zaretsky JM ir kt. Mutacijos, susijusios su įgytu atsparumu PD-1 blokada sergant melanoma. N Engl J Med 375, 819–829, doi: 10.1056 / NEJMoa1604958 (2016). [Pubmed: 27433843]

45. Manguso RT ir kt. In vivo CRISPR patikra identifikuoja Ptpn2 kaip vėžio imunoterapijos tikslą. Nature 547, 413–418, doi: 10.1038/nature23270 (2017). [Pubmed: 28723893]

46. ​​Shin DS ir kt. Pirminis atsparumas PD-1 blokadai, tarpininkaujant JAK1/2 mutacijų. Cancer Discov 7, 188–201, doi: 10.1158/2159-8290.CD-16-1223 (2017). [PubMed: 27903500]

47. Sucker A ir kt. Įgytas atsparumas IFNgama pablogina priešnavikinį imunitetą ir sukelia T ląstelėms atsparių melanomos pažeidimų. Nat Commun 8, 15440, doi: 10.1038/ncomms15440 (2017). [Pubmed: 28561041]

48. Li J ir kt. Epigenetinės vairuotojo mutacijos ARID1A formuoja vėžio imuninį fenotipą ir imunoterapiją. J Clin Invest, doi: 10.1172 / JCI134402 (2020).

49. Benci JL ir kt. Naviko interferono signalizacija reguliuoja daugiageninį atsparumo imuninės kontrolės taško blokadai programą. Cell 167, 1540–1554 e1512, doi:10.1016/j.cell.2016.11.022 (2016). [Pubmed: 27912061]

50. Arun G, Diermeier SD ir Spector DL ​​Ilgų nekoduojančių RNR terapinis taikymas vėžiui gydyti. Trends Mol Med 24, 257–277, doi:10.1016/j.molmed.2018.01.001 (2018). [Pubmed: 29449148]

51. Gil N & Ulitsky I Genų ekspresijos reguliavimas cis-veikiančiomis ilgomis nekoduojančiomis RNR. Nat Rev Genet 21, 102–117, doi: 10.1038/s41576-019-0184-5 (2020). [Pubmed: 31729473]

52. Jones AN & Sattler M LncRNR struktūrinės biologijos iššūkiai ir perspektyvos – Xist lncRNR A pakartojimų pavyzdys. J Mol Cell Biol 11, 845–859, doi: 10.1093/jmcb/mjz086 (2019). [Pubmed: 31336384]

53. Shenoy AR ir kt. GBP5 skatina NLRP3 uždegimo susidarymą ir žinduolių imunitetą. Science 336, 481–485, doi: 10.1126/science.1217141 (2012). [Pubmed: 22461501]

54. Tretina K, Park ES, Maminska A & MacMicking JD. Interferono sukelti guanilatą surišantys baltymai: šeimininko apsaugos sveikatos ir ligų sergėtojai. J Exp Med 216, 482–500, doi: 10.1084/ jem.20182031 (2019). [PubMed: 30755454]

55. Yamamoto M ir kt. Gama interferono indukuojamų p65 GTPazių grupė vaidina lemiamą vaidmenį šeimininko gynyboje nuo Toxoplasma gondii. Imunitetas 37, 302–313, doi:10.1016/ j.immuni.2012.06.009 (2012). [PubMed: 22795875]

56. Mbofung RM ir kt. HSP90 slopinimas sustiprina vėžio imunoterapiją, padidindamas interferono atsako genus. Nat Commun 8, 451, doi: 10.1038/s41467-017-00449-z (2017). [PubMed: 28878208]

57. Proia DA & Kaufmann GF tikslinis šilumos šoko baltymas 90 (HSP90) kaip papildoma vėžio terapijos imuninės kontrolės taško blokados strategija. Cancer Immunol Res 3, 583–589, doi: 10.1158/2326-6066.CIR-15-0057 (2015). [PubMed: 25948551]

58. Yuno A ir kt. Hsp90 inhibitorių klinikinis įvertinimas ir biomarkerių profiliavimas. Methods Mol Biol 1709, 423–441, doi: 10.1007/978-1-4939-7477-1_29 (2018). [Pubmed: 29177675]

59. Charo J ir kt. Per didelė Bcl-2 ekspresija padidina navikui būdingų T ląstelių išgyvenimą. Cancer Res 65, 2001–2008, doi: 10.1158/0008-5472.CAN-04-2006 (2005). [Pubmed: 15753400]

60. Owaki H ir kt. Raf-1 reikalingas T ląstelių IL2 gamybai. EMBO J 12, 4367–4373 (1993). [PubMed: 8223446]