Lipidomika atskleidžia cisplatinos sukeltus inkstų lipidų pokyčius ūminio inkstų pažeidimo metu ir jų susilpnėjimą cilastatinu
Feb 21, 2022
Santrauka: Nefrotoksiškumas yra pagrindinė cisplatina pagrįstos chemoterapijos komplikacija, sukelianti ūminęinkstų pažeidimasmaždaug 30 procentų pacientų, kuriems nėra klinikinio naudojimo prevencinės intervencijos ar gydymo. Neseniai pradėjus klinikinius tyrimus, įrodyta, kad cilastatinas turi nefroprotekcinį poveikį gydant cisplatina in vitro ir in vivo modeliuose. Gilesnis supratimas apie cisplatinos sukeltą molekulinį lygįinkstų pažeidimasir galimų apsauginių medžiagų poveikis gali būti esminis veiksnys kuriant sėkmingą nefroprotekcinį gydymą ir nustatant naujusinkstų pažeidimasirnefroprotekcija. Tikslinis lipidomikos metodas, naudojant LC-MS/MS, buvo naudojamas kiekybiniam 108 lipidų rūšių (su fosfolipidų, sfingolipidų ir laisvo bei esterifikuoto cholesterolio) kiekiui nustatyti.inkstasžiurkių, gydytų cisplatina ir (arba) cilastatinu, žievės ir medulla ekstraktai. Nustatyta, kad po gydymo cisplatina žievėje ir smegenyse pakito atitinkamai iki 56 ir 63 lipidų rūšys. Bendras gydymas cilastatinu sumažino daugelį šių lipidų pokyčių, visiškai arba iš dalies, palyginti su kontroliniu lygiu. Daugiamatė analizė atskleidė, kad lipidų rūšys gali būti naudojamos diskriminacijaiinkstų pažeidimasirnefroprotekcija, o cholesterolio esteriai yra labiausiai skiriamos rūšys, kartu su sulfatidais ir fosfolipidais. Galimi cisplatinos sukeltos diagnostikos biomarkeriai inkstų pažeidimasir cilastatinasnefroprotekcijataip pat buvo rasti.
Raktiniai žodžiai:lipidomika; cisplatina; ūminis inkstų pažeidimas; cilastatinas; nefroprotekcija; biomarkeriai; cholesterolio esteriai; sfingolipidai; fosfolipidai; chemoterapija
Įvadas Nefrotoksiškumas yra rimtas cisplatinos chemoterapijos šalutinis poveikis [1], pasireiškiantis ūminiuinkstų pažeidimas(AKI), kuriama maždaug. 30 procentų gydytų pacientų [2]. Tai taip pat yra pagrindinis dozę ribojantis veiksnys ir svarbus cisplatinos terapijos trūkumas – vienas iš svarbiausių solidinių navikų gydymo būdų [2]. Cisplatina kaupiasi ir sukelia žaląinkstųproksimalinių kanalėlių epitelio ląstelės (RPTEC), o pažeidimas ypač lokalizuotas proksimalinio kanalėlio S3 segmente, nusileidžiančiame nuoinkstųžievė link kortikomeduliarinės jungties ir išorinės smegenų [3]. Tačiau taip pat buvo pasiūlyta tiesioginė žala medulinei Henlės kilpai [4,5]. Ląstelėje vyksta daugybė įvykių, susijusių suinkstųkanalėlių ląstelių pažeidimas po cisplatinos įsisavinimo, įskaitant oksidacinį stresą, nitrozinį stresą, kraujagyslių pažeidimą, uždegimą, mitochondrijų pažeidimą arba Na plus, K plus -ATPAzės slopinimą ląstelės membranoje ir endoplazminį tinklinį stresą, po kurio įvyksta proksimalinių kanalėlių ląstelių mirtis, daugiausia dėl apoptozė (apima vidinį ir išorinį kelią) arba nekrozė, dėl kurios prarandamainkstų funkcija[2,6,7]. Tai pasireiškia glomerulų fifiltracijos greičio (GFR) ir magnio bei kalio koncentracijos serume sumažėjimu, padidėjusiu šlapalo azoto (BUN) ir kreatinino kiekiu serume [2].
Buvo tiriami įvairūs metodainefroprotekcijacisplatinos terapijos metu tiek in vitro, tiek in vivo, remiantis daugybe molekulinių taikinių [7–9]. Tačiau galimas citotoksinio cisplatinos poveikio naviko ląstelėms sutrikimas ir dažnai nepilnas apsauginis poveikis apribojo renoprotektorių vystymąsi [9]. Dėl to nėra jokios klinikinės intervencijos, kuri sėkmingai apsaugotų arba gydytų cisplatinos sukeltą AKI [7]. Gilesnis supratimas apie molekulinius kelius, susijusius su cisplatinos sukeltu AKI ir galimus taikiniusnefroprotekcijašiuo atžvilgiu atrodo labai svarbus.
Įrodyta, kad cilastatinas veiksmingai apsaugoinkstasnuo žalos, kurią sukelia keli veiksniai, įskaitant cisplatiną [10, 11], gentamiciną [12], vankomiciną [13], ciklosporiną A ir takrolimą [14], tiek in vitro, tiek in vivo modeliuose. Cilastatinas savo apsauginį poveikį daro selektyviai slopindamasinkstųdehidropeptidazė I (DHP-I), esanti lipidų plaustuose ant RPTEC šepetėlio krašto [11]. Dėl to cilastatinas sutrikdo procesus, susijusius su membranos išskyrimu, pvz., Fas sukeltą išorinę apoptozę, ir progresuojainkstų pažeidimaspo toksinio įžeidimo sulaikomas [11]. Išskyrus išorinį cilastatino sukeliamą apoptozės sutrikimą, buvo nustatyta, kad sumažėjo oksidacinis stresas, uždegimas ir nefrotoksinių junginių kaupimasis [10–13, 15, 16]. Taigi,inkstų funkcijaliekanos išsaugotos kartu gydant cisplatina ir cilastatinu [11]. Neseniai cilastatinas sėkmingai baigė I fazės klinikinius tyrimus, skirtus naudoti kaip nefroprotektorių, ir netrukus bus pradėti II fazės tyrimai. Neseniai atliktas daug žadantis tyrimas taip pat atskleidė, kad cilastatinas (vartojamas kaip imipenemas ir cilastatinas) gali turėti renoprotekcinį poveikį pacientams, sergantiems pilvaplėvės karcinomatoze hiperterminio gydymo intraperitonine cisplatina metu [17].
Pastaraisiais metais omikos technologijos, ypač proteomika [18, 19] ir metabolomika [20–23], pasirodė naudingos ieškant naujų ankstyvųjų diagnostinių AKI biomarkerių, be BUN ar kreatinino serume [18, 20]. Be to, metabolomikos analizė gali suteikti vertingos informacijos, padedančios suprasti cisplatinos nefrotoksiškumo mechanizmus [5,24] ir galimų nefroprotektorių terapinį poveikį [25–27].
Visų pirma, lipidomikai taip pat gali suteikti svarbios informacijos apieinkstų liga[28], atsižvelgiant į tai, kad lipidai atlieka pagrindinius struktūrinius, ląstelių signalizacijos ir metabolizmo vaidmenis, ir jie gali būti pakeisti ląstelėse, audiniuose ir biofluiduose.inkstųpatologinės būklės [29,30]. Šiuo atžvilgiu buvo nustatytas padidėjęs trigliceridų ir neesterifikuotų riebalų rūgščių kiekisinkstasgydymo cisplatina metu [31], be Tal neutralių lipidų [32]. Padidėjęs sfingolipidų – keramidų (Cer) ir heksozilkeramidų (HexCer) – kiekis taip pat buvo pastebėtasinkstųžievė cisplatinos sukelto AKI metu [33]. Kita vertus, fosfolipidų rūšys, įskaitant fosfatidilcholiną (PC), fosfatidiletanolaminą (PE) ir lizofosfatidilcholiną (LPC), taip pat buvo pakeistosinkstų audinysarba ląstelėse gydymo cisplatina metu [26]. Taip pat nustatyta, kad po cisplatinos pavartojimo žiurkės serume pakito įvairių LPC rūšių lygis [23]. Be to, masių spektrometrijos vaizdavimo netikslinis pusiau kiekybinis metodas leido palyginti lipidų pasiskirstymą žiurkėse.inkstasskyriuose ir teigė, kad cis platina sukėlė įvairių fosfolipidų (PC, PE, fosfatidilglicerolių (PG), fosfatidilinozitolių (PI), fosfatidilserinų (PS), fosfatido rūgščių (PA), sulfatidų (sulfato) arba kardiolipinų (34) pokyčius. (rodo skirtingą elgseną žievėje ir smegenyse), o gydymas kartu su cilastatinu kai kuriuos iš šių pokyčių susilpnino [4].
Šiame darbe mes žengėme žingsnį toliau ir atidžiau pažvelgėme į svarbius struktūrinius lipidusinkstas, pvz., fosfolipidai (PC, LPC ir PE), sfingolipidai (Sulf, sfingomielinai (SM), dihidrosfingomielinai (dhSM), Cer, dihidrokeramidai (dhCer), HexCer, dihidroheksozilceramidai (dhHexCerified) ir laisvasis cholesterolis (fFC) formų (cholesterolio esteriai (CE)), apimanti naujas lipidų klases ir rūšis ir naudojant patikimesnį tikslinį kiekybinį metodą, pagrįstą skysčių chromatografija, sujungta su tandeminės masės spektrometrijos (LC-MS/MS) analize. Iš viso buvo kiekybiškai įvertintos 108 lipidų rūšysinkstųgydytų žiurkių žievės ir smegenų ekstraktai, siekiant geriau suprasti nefrotoksinį cisplatinos poveikį ir nefroprotekcinį cilastatino poveikį. Nauja informacija apie su AKI susijusią cisplatinos poveikįinkstųbuvo gautos lipidų rūšys ir gauta papildomų įžvalgų apie apsauginį cilastatino poveikį, dėl kurio susilpnėjo kai kurie specifiniai lipidų pokyčiai, kuriuos sukelia cisplatina arbainkstųžievė arba medulla. Įvairūs galimi cisplatinos sukeltų biomarkeriaiinkstų pažeidimasirnefroprotekcijaTaip pat buvo rasta cilastatino.
Rezultatai
Cilastatino apsauginis poveikis nuo cisplatinos sukelto inkstų pažeidimo
Įvertinimasinkstų funkcijacisplatina ir (arba) cilastatinu gydytoms žiurkėms pirmą kartą buvo atliktas naudojant kelis biocheminius serumo ir šlapimo rodiklius. Kaip parodyta 1 lentelėje, kreatinino kiekis serume, BUN, šlapimo baltymai, šlapimo tūris ir dalinis natrio bei kalio išsiskyrimas žymiai padidėjo dėl gydymo cisplatina, palyginti su kontroline grupe, o kartu vartojant cilastatiną ir cisplatiną jų sumažėjo, palyginti su kontroline grupe. su valdymo lygiais. Kita vertus, cisplatina gydytų žiurkių GFR sumažėjo, palyginti su kontroliniais mėginiais, o kartu skiriant cilastatiną šis poveikis sumažėjo. Šie rezultatai patvirtinainkstų pažeidimassukeltas cisplatinos ir apsaugotas cilastatinu. Vien cilastatinas neparodė jokio poveikioinkstų funkcijaparametrus.
Histopatologinė analizė taip pat buvo atlikta hematoksilinu / eozinu dažytuose skyriuose, siekiant ištirti morfologinius pokyčius, susijusius suinkstų pažeidimas. 1 paveiksle pavaizduoti cisplatinos sukelti pažeidimo požymiai proksimalinėje srityjeinkstųkanalėlių, įskaitant kanalėlių patinimą, ląstelių nuolaužų atsiskyrimą arba šepetėlio kraštinės membranos praradimą (1C, G, I pav.). Baltymų kaupimasis taip pat buvo pastebėtas žievės ir smegenų kanalėliuose (atitinkamai 1C, G pav.). Tai skiriasi nuo normalios morfologijos, stebimos kontrolinėse arba cilastatino grupėse žievėje (atitinkamai 1A, B pav.) ir smegenyse (atitinkamai 1E, F pav.). Gydant cilastatinu kartu su cisplatina, akivaizdžiai sumažėjo visų šių cisplatinos sukeltų žievės ir smegenų pakitimų (1D, H, J pav.).
Cisplatinos pasaulinių inkstų lipidų klasių pokyčiai žievėje ir smegenyse. Apsauginis cilastatino poveikis
Bendras skirtingų lipidų klasių lygis, įskaitant sterolius (CE, FC), fosfolipidus (LPC, PC, PE) ir sfingolipidus (Cer, dhCer, HexCer, dhHexCer, Sulf, SM, dhSM), buvo nustatytas.inkstųžievės ir medulla, siekiant įvertinti bendrą cisplatinos poveikį lipidams AKI metu. Išsamius lipidų analizės rezultatus rasite S1 lentelėje. Kaip matyti iš 2A, B paveikslų, visose grupėse buvo pastebėtos gana panašios tendencijos žievėje ir smegenyse. Gydymo cisplatina metu CE ir Cer žymiai padidėjo, o SM, dhSM ir PE sumažėjo tiek žievėje, tiek smegenyse, palyginti su kontrolinėmis grupėmis. Tarp jų Cer ir CE patiria ryškiausius pastebėtus cisplatinos sukeltus pokyčius. Be to, gydant cisplatina, dhCer ir HexCer žymiai padidėjo medulėje, o žievėje dhHexCer padidėjo, o LPC ir Sulf sumažėjo.
1 pav. Histopatologinė hematoksilinu/eozinu dažytų medžiagų analizėinkstųskyriuose parodyta cilastatino apsauga nuo cisplatinos sukeltos žalos. Vaizdai rodomi 20 kartų padidinus (A) kontrolinę žievę; (B) cilastatino žievė; (C) cisplatinos žievė; (D) cisplatina ir cilastatino žievė; (E) kontrolinė smegenų dalis; (F) cilastatino medulla; (G) cisplatinos smegenų; ir (H) cisplatina ir cilastatinas medulla. Mastelio juosta nuo A iki H reiškia 100 µm. Išsamūs vaizdai išinkstų60 kartų padidinus kanalėlius rodomi (I) cisplatina ir (J) cisplatina ir cilastatinas. I ir J mastelio juosta reiškia 25 µm.InkstųPavaizduoti pažeidimo rodikliai: →: baltymų sluoksnių kaupimasisinkstųkanalėlių. ir sritis: kanalėlių patinimas. *: šepečio kraštinės membranos praradimas. #: ląstelių nuolaužų atsiskyrimas.
Kartu vartojant cilastatiną ir cisplatiną, kai kurie iš šių cisplatinos sukeltų lipidų pokyčių susilpnėjo, todėl Cer ir dhHexCer lygiai žievėje arba dhCer, HexCer, SM, dhSM ir PE nesiskiria nuo kontrolinių grupių. lygiai smegenyse. Be to, cisplatinos sukelto CE padidėjimo žievėje atveju, cilastatinas, vartojamas kartu su cisplatina, žymiai sumažino jo kiekį, palyginti su cisplatinos grupe, nors atsigavimas buvo dalinis, palyginti su koiatrolio grupėmis. Likusios lipidų klasės, kurias pakeitė cisplatina, liko neatkurtos kartu gydant durirtg cilastatisi. Kita vertus, pats cilastatinas neturėjo jokio poveikio žievės ir smegenų lipidams, išskyrus LPC ir dhCer žievėje, kurios, lyginant su kontroline grupe, atrodė atitinkamai sumažėjusios ir padidėjusios. Bendras FC, PC ir dhHexCer lygis po gydymo cisplatina reikšmingų žievės ir smegenų pokyčių neparodė.
2C, D paveiksluose pavaizduoti lipidų klasių koreliacijos šilumos žemėlapiai atitinkamai žievėje ir smegenyse, siūlantys panašias tendencijas.
Individualių inkstų lipidų rūšių pašalinimas gydant cisplatina. Cilastatinas Attenuating Egect
Cholesteolio esteriaiPenkių atskirų CE rūšių (CE 18:1, CE 18:2, CE 18:0, CE 20:4 ir CE 22:6) analizė, atliktainkstųžievė ir medulla atskleidė, kad cisplatina reikšmingai padidino kiekvieną iš jų, palyginti su kontroliniu lygiu (3 pav.). Kita vertus, kartu vartojant cilastatiną ir cisplatiną, apskritai sumažėjo atskirų CE rūšių lygis, palyginti su gydymu cisplatina, o tai buvo statistiškai reikšminga visoms CE rūšims žievėje ir CE 18:2 smegenyse, kaip galima. 3 paveiksle. Šis žievės CE rūšių atsigavimas dėl cilastatino kartu buvo dalinis, palyginti su kontrolinės grupės lygiais, tuo tarpu statistiškai reikšmingo atsigavimo daugumoje medella CE rūšių (išskyrus CE 18:2) nebuvo pastebėta kartu vartojant cilastatiną. palyginti su cisplatina. Išsamūs žievės ir smegenų lipidų rūšių statistinės analizės rezultatai pateikti atitinkamai S2 ir S3 lentelėse.
Sfingolipidai: Cer, dhCer, HexCer, dhHexCer, SM, dhSM ir SulfIš viso buvo kiekybiškai įvertintos 43 sfingolipidų rūšysinkstųžievę ir smegenų žievę, kad įvertintų gydymo cisplatina ir cilastatinu poveikį jų lygiams, kaip parodyta 4 paveiksle. Kalbant apie Cer (4A pav.), dhCer (4B pav.), HexCer (4C pav.) ir dhHexCer (4D pav.) rūšis, kaip Kaip matyti, gydymas cisplatina žymiai padidino 19 rūšių skaičių iš keturių klasių.inkstųžievė ir medulla. Vėlgi, gydymas kartu su cisplatina ir cilastatinu rodo tendenciją susilpninti cisplatinos poveikį, bendrai mažėjant cisplatinos pakeistam lipidų kiekiui žievėje ir smegenyse. Tiesą sakant, dhCer (4B pav.) ir dhHexCer (4D pav.) Skirtumas tarp cisplatina ir cilastatinu gydytų grupių ir kontrolinių grupių nepastebėtas, o tai rodo visišką pasveikimą. Cer (4A pav.) ir HexCer (4C paveikslas) atveju toks atsigavimas taip pat būdingas kai kurioms pakeistoms rūšims, tokioms kaip HexCer 34:1 (žievė ir medulla) ir HexCer 38:1 ir HexCer 42:1 (medulla). ); Cer 36:1, Cer 38:1, Cer 40:1, Cer 42:1 ir Cer 42:2 žievėje; ir Cer 34:1 ir Cer 42:2 meduloje, visiškai arba iš dalies atsigavę. Ir atvirkščiai, gydymas cisplatina ir cilastatinu vis dar parodė reikšmingus skirtumus, palyginti su kontrolinių grupių Cer 36:1, Cer 38:1, Cer 40:1, Cer 42:1 ir HexCer 36:1 meduloje, be atsigavimo. daug geresnis cilastatino atkūrimo efektas žievėje nei Cer ir HexCer smegenyse.
SM (4E pav.) ir dhSMt (4F pav.) rūšių atveju cisplatina sumažino trumpiausios ir ilgiausios grandinės rūšių žievės ir medulių kiekį, o tai buvo statistiškai reikšminga SM 34:1, dhSM 34:{{ 5}}, SM 42:2, SM 42:1 ir dhSM 42:1. Priešingai, gydymo cisplatina poveikis tarpinės grandinės SM ir dhSM rūšims žievėje ir smegenyse buvo padidėjęs, o tai buvo statistiškai reikšmingas dhSM 36:0 (ir žievėje, ir smegenyse) ir dhSM 4{{ 15}}:0, SM 36:1, SM 38:1 ir SM 40:1 smegenyse. Kartu vartojant cisplatiną ir cilastatiną, daugeliu atvejų normalizavosi SM ir dhSM rūšių lygis, naudojant SM 34:1, SM 36:1, SM 38:1, SM 40:1, SM 42:2, SM 42:1, dhSM 36:0, dhSM 40:0 ir dhSM 42:1, nesiskiriant nuo kontrolinių grupių meduloje. Galiausiai, kai kurios Sulf rūšys taip pat buvo pakeistos gydant cisplatinainkstųžievė ir medulla, kaip parodyta 4G paveiksle. Nors buvo nustatyta, kad po gydymo cisplatina sulfatas 40:1 žymiai padidėjo tiek žievėje, tiek smegenyse, kitos rūšys, pvz., Sulf-OH 40:1 arba ilgos grandinės Sulf-OH 42:2, Sulf-OH 42:2 sumažėjo žievėje, o Sulf 42:0 ir Sulf-OH 42:1 taip pat sumažėjo tiek žievėje, tiek smegenyse. Cilastatinas, vartojamas kartu su cisplatina, vėl sukėlė nedidelį atsigavimo efektą, ypač sulf 40:1 (žievė ir smegenys) ir Sulf 40:2 bei Sulf-OH 42:1 (medulla), nesiskyrė lyginant su kontrolinėmis grupėmis.
Fosfolipidai: PC, PE ir LPCBuvo atliktas 60 fosfolipidų rūšių (28 PC, 20 PE ir 12 LPC) kiekybinis įvertinimas.inkstųžievė ir medulla, kad būtų galima įvertinti galimus cisplatinos sukeltus pokyčius ir cilastatino renoprotekcinį poveikį. PC rūšių rezultatai parodyti atitinkamai 5A, B paveiksluose. Kaip matyti, cisplatina reikšmingai pakeitė iki 19 PC rūšių žievėje arba smegenyse. Daugumą šių PC rūšių sumažino cisplatina, išskyrus PC 40:2, PC 40:4 ir PC 34:2, kurių padidėjo žievėje. Labai neprisotintų PC rūšių dalis buvo žymiai sumažinta tiek smegenyse, tiek žievėje, o rūšių, turinčių dvi dvigubas jungtis, frakcija žymiai padidėjo, kaip matyti iš 5C, D paveikslų. Gydymo cisplatina ir cilasto atinu poveikis buvo panašus į anksčiau pastebėtą poveikį, pastebėtas tam tikras silpninantis poveikis, dėl kurio kai kuriais atvejais visiškai atsistatė PC lygis, be reikšmingų skirtumų su kontroline grupe arba iš dalies atsigavo. Šis atsigavimas daugiausia buvo pastebėtas. PE rūšių nustatymo rezultatai žievėje ir smegenyse parodyti atitinkamai 6A, B paveiksluose. Iš viso 16 PE rūšių reikšmingai pakeitė cisplatina arba žievėje, arba smegenyse, o daugiausia pakitusių rūšių rasta meduloje. Daugeliu atvejų PE rūšių sumažėjo gydant cisplatina, išskyrus PE 38:2, PE 40:6 ir PE 40:4, kurie padidėjo arba žievėje, ir smegenyse, arba ir žievėje, ir smegenyse. atitinkamai. Atitinkamai, atsižvelgiant į bendrą PE rūšių riebalų rūgščių grandinių ilgį smegenyse, bendras PE kiekis su 34, 36 ir 38 C žymiai sumažėjo vartojant cisplatiną, o 40 C rūšys padidėjo, kaip parodyta 6C paveiksle. . Gydymas cilastatinu kartu su cisplatina susilpnino daugumą cisplatinos sukeltų pokyčių atskirose PE rūšyse, randamose smegenyse, todėl 11 iš 15 cisplatinos pakitusių rūšių smegenyse nebuvo reikšmingų skirtumų, palyginti su kontrolinėmis grupėmis, ir dar 2 PE rūšys. iš dalies pasveiko. Tačiau žievėje tik 2 iš 11 cisplatina pakeistų rūšių buvo atkurtos naudojant cilastatiną iki kontrolinio lygio, o 2 papildomos PE rūšys buvo iš dalies atkurtos. Panašiai kaip ir atliekant PC rūšių stebėjimus, labai nesočiųjų PE rūšių dalis buvo žymiai sumažinta smegenyse, o rūšių, kuriose yra 1-3 dvigubų jungčių, dalis žymiai padidėjo, kaip parodyta 6D paveiksle.
Kalbant apie LPC rūšių analizę, dauguma cisplatinos sukeltų pokyčių buvo nustatytiinkstųžievė, kur LPC 16:1, LPC 16:0, LPC 18:1, LPC 18:0 , LPC 20:3, LPC 22:6 ir LPC 22:5 buvo žymiai sumažintas su kontrolinių mėginių atžvilgiu, kaip matyti 7A paveiksle. Kita vertus, gydymo cisplatina metu nustatyta, kad LPC 17:1 ir LPC 18:2 padidėjo medulėje (7B pav.). Bendras gydymas cisplatina ir cilastatinu neturėjo jokio poveikio žievės LPC rūšims. Atvirkščiai, LPC 17:1 ir LPC 18:2 buvo rasta smegenyse, be reikšmingų skirtumų, palyginti su kontroliniais mėginiais.
Inkstų lipidai kaip klasifikavimo kintamiejiInkstų pažeidimasir apsauga
Daugiamatė analizė buvo atlikta naudojant visus lipidų kintamuosius, išmatuotus žievėje ir smegenyse, siekiant įvertinti, ar šios rūšys gali būti naudojamos klasifikuojant grupes ir skiriant cisplatinos sukeltą poveikį.inkstų pažeidimasirnefroprotekcijasu cilastatinu. Pagrindinių komponentų analizė (PCA) ir stačiakampių projekcijų latentinių struktūrų atskyrimo analizė (OPLS-DA) buvo atlikta naudojant atskirai žievės arba smegenų lipidus, kaip parodyta 8 paveiksle. Žievės (8A pav.) ir smegenų (8B pav.) PCA analizė. lipidai pasiūlė modeliams galimybę parodyti aiškų cisplatinos grupės atskyrimą nuo kontrolinės ir cilastatino grupių, o pastarosios dvi glaudžiai susibūrė. Kita vertus, cisplatina ir cilastatinu gydoma grupė buvo linkusi atsiskirti nuo cisplatina grupės ir buvo tarp kontrolinės ir cisplatinos grupių, o tai rodo skirtumus tarp grupių. Visuose PCA modeliuose R2 buvo didesnis nei 0.7, o Q2 vertės didesnis nei 0.5.
Kelių grupių OPLS-DA analizė taip pat parodė aiškiai atskirtą skirtingų grupių grupavimą naudojant žievės (8C pav.), arba smegenų (8D pav.) lipidų kintamuosius. OPLS-DA modeliai pateikė priimtinas Q2 vertes ir R2 reikšmes, didesnes nei 0.7, ir pasirodė esąs tinkamas atliekant permutacijos testą 100 iteracijų, kaip parodyta 8E, F pav. Požymius, turinčius kintamą svarbą projekcijos (VIP) balams, didesniems nei 1, galima rasti 8G, H paveiksle, nurodant atitinkamai žievės arba smegenų lipidus, kurie turi didesnį poveikį grupių atskyrimui. Tai apėmė įvairias lipidų rūšis iš CE, sfingolipidų ir fosfolipidų klasių. Nustatyti specifinius lipidų skirtumus tarp atskirų grupių, susijusių su gydymu cisplatina irnefroprotekcija, tolesnė OPLS-DA analizė buvo atlikta atskirai su žievės ir smegenų lipidais, kaip matyti atitinkamai 9 ir 10 paveiksluose. OPLS-DA modeliai buvo sukurti cisplatinai, palyginti su kontroline grupe, cisplatina ir cilastatina, palyginti su cisplatina, taip pat cisplatina ir cilastatina, palyginti su kontroline grupe. Labiausiai skiriasi OPLS-DA modeliai tarp kontrolinių ir cisplatina arba cisplatina plius cilastatina gydytų grupių, atsižvelgiant į jų didžiausias R2 ir Q2 reikšmes, tinkamai patvirtinant permutacijos testo rezultatus po 100 ciklų (9A, B, D paveikslai, E ir 10A, B, D, E pav.).
Kita vertus, OPLS-DA modeliai, skirti cisplatinos ir cilastatinos ir cisplatinos grupėms, naudojant žievės (9C pav.) arba smegenų (10C pav.) lipidus, taip pat leido atskirti grupes su pagrįstomis R2 ir Q2 reikšmėmis. ir atitinkami patvirtinimo rezultatai iš 100-ciklo permutacijos testų (9F ir 10F pav.), kai smegenų lipidai yra tie, kurie geriau nuspėjami. Skirtingų OPLS-DA modelių S diagramos yra įtrauktos į 9G, H, I ir 10G, H, I paveikslus, skirtus žievės arba smegenų lipidų savybėms. Rūšis su |p(corr)| didesni nei 0,5, o VIP balai, didesni nei 1, S-plokštuose pažymėti kaip svarbiausi grupių diskriminacijos požymiai. Išsamius duomenis, įskaitant p (corr) ir VIP reikšmes iš OPLS-DA modelių, kartu su kiekvienos lipidų rūšies vienkartine statistika, galima rasti papildomose lentelėse S2 (žievės lipidai) ir S3 (medulla lipidai). Atrodo aišku, kadinkstųžievės ir smegenų lipidai gali būti skiriamieji cisplatinos sukeltų kriterijųinkstų pažeidimasir cilastatinuinefroprotekcijagydymo cisplatina metu.
Inkstų lipidai kaip galimi cisplatinos sukelto inkstų pažeidimo biomarkeriai, siekiant atrinkti galimus inkstų pažeidimo lipidų biomarkerius
cisplatinos sukeltas daugelio kriterijų derinys, sudarytas iš statistiškai reikšmingų p verčių, gautų iš vienmatės cisplatinos ir kontrolinių grupių analizės, taip pat p(corr) ir VIP reikšmės, nustatytos atitinkamame OPLS-DA modelyje. Pasirinkti lipidai, kurių p reikšmės < 0.05;="" fdr="">< 0.1;="" |p(korr)|=""> 0,5 ir VIP > 1 galima rasti 2 lentelėje (žievės lipidai) ir 3 lentelėje (smegenų lipidai), kur taip pat yra imtuvo veikimo charakteristikų (ROC) kreivių raukšlės pokytis (FC) ir plotai po kreive (AUC).
Kaip matyti, 2 ir 3 lentelėse atitinkamai atrinkta iki 4 0 lipidų iš smegenų ir 27 lipidų iš žievės, įskaitant CE, sfingolipidus ir fosfolipidų rūšis. Kiekvieno lipido ROC kreivių AUC vertės buvo didesnės nei 0,85 ir daugeliu atvejų artimos 1, o tai rodo geras rūšių atskyrimo galimybes tarp cisplatinos ir kontrolinių grupių. Pažymėtina, kad cisplatinos padidintos CE rūšys (CE 18:1, CE 18:2, CE 18:0, CE 20:4 ir CE 22:6) atrodo labiausiai diskriminuojančios. tiek smegenyse, tiek žievėje, rodančios didžiausias FC, VIP, p(corr) ir AUC reikšmes. dhHexCer 34:0 yra dar vienas padidėjęs lipidų kiekis žievėje, turintis aukštą FC ir atitinkamus balus. Kita vertus, tokie sulfatidai kaip Sulf 42:0, Sulf-OH 40:1 arba Sulf-OH 42:1 taip pat yra gana svarbūs žievėje, o PE 36:5, PE 38:6, PE 38:5. PC 36:5 arba PC 36:6 taip pat yra labai svarbūs smegenyse, visi jie sumažėja gydymo cisplatina metu.
Inkstų lipidai kaip galimi cilastatino nefroprotekcijos biomarkeriai
Norint atrinkti galimus cilastatino apsaugos nuo cisplatinos nefrotoksiškumo lipidinius biomarkerius, buvo taikomas tas pats kelių kriterijų metodas, kaip ir 2.5 skyriuje, naudojant vienmatinę cisplatinos ir cilastatinos ir cisplatinos grupių analizę, o p(corr) ir VIP vertes, nustatytas atitinkamose OPLS- DA modelis. Pasirinkti lipidai, kurių p reikšmės < 0.05;="" fdr="">< 0.1;="" |p(korr)|=""> 0,5, o VIP > 1 galima rasti 4 lentelėje (žievės lipidai) ir 5 lentelėje (smegenėlių lipidai), kur taip pat buvo apskaičiuoti ROC kreivių FC ir AUC.
Kaip matyti iš 4 lentelės, visos CE rūšys (CE 18:1, CE 18:2, CE 18:0, CE 20:4 ir CE 22:6) žievė gali būti laikoma galingiausiu cilastatino teikiamos apsaugos rodikliu, kuris tuo pačiu metu žymiai sumažina cisplatinos sukeltus pokyčius. PE 36:5 ir dhHexCer 34:0 žievėje taip pat yra svarbūs potencialūs cilastatino apsaugos biologiniai žymenys, ypač pastarasis, kuris dėl cilastatino visiškai atsistato iki kontrolinio lygio. Kalbant apie smegenų lipidus, kaip parodyta 5 lentelėje, rastas didesnis potencialių cilastatino apsaugos biomarkerių kiekis nei žievėje. Pažymėtina, kad Sulf 40:2, atsižvelgiant į aukščiausius FC ir VIP balus, yra labiausiai išsiskirianti rūšis meduloje. Taip pat buvo rasta įvairių PC ir PE rūšių, įskaitant PE 36:5, PE 38:5, PE 38:6, PE 36:4, PE 34:3 ir PC 36:6, be Cer. 42:2, dhHexCer 36:0 ir HexCer 34:1, kaip reikšmingi cilastatino apsaugos biologiniai žymenys smegenyse. Visais atvejais šie lipidai buvo susiję su daliniu arba visišku cilastatino sukeltu kontrolinio lygio atstatymu, palyginti su cisplatinos pakitusiu jų kiekiu. Visoms rūšims gautos ROC kreivių AUC vertės buvo didesnės nei 0,85, o tai įrodo jų geras diskriminavimo galimybes
DiskusijaŠiame darbe mes kiekybiškai įvertinome iš viso 108 lipidų rūšis, apimančias svarbius struktūrinius lipidus, tokius kaip fosfolipidai, sfingolipidai ir cholesterolis kartu su jo esterifikuotomis formomis.inkstasžiurkių, gydytų cisplatina ir (arba) cilastatinu, žievės ir smegenų. Tai buvo atlikta siekiant geriau suprasti nefrotoksinį cisplatinos poveikį ir apsauginį cilastatino poveikį. Nustatyta, kad gydant cisplatina iki 63 lipidų rūšys buvo reikšmingai pakeistos smegenyse, o 56 lipidų rūšys buvo paveiktos žievėje, atspindinčios.inkstų pažeidimasabiejuose regionuose. Nors tradiciškai dauguma cisplatinos sukeltų AKI tyrimų daugiausia dėmesio skiria proksimalinėms kanalėlių ląstelėms irinkstųžievės pažeidimas, kai daugiausia dėmesio skiriama vaistų kaupimuisi, naujausi tyrimai rodo, kad, remiantis TUNEL apoptozės tyrimais, smegenų sužalojimas gali būti toks pat sunkus kaip ir žievėje [5]. Tai gali būti susiję su cisplatinos kaupimu proksimalinių kanalėlių S3 segmente [3,5], besileidžiančiame link išorinės medulės, neskaitant galimo tiesioginio ir antrinio Henlės kilpos pažeidimo [4]. Be to, medulla buvo nurodyta kaip jautriausiainkstųplotą, kad būtų galima stebėti su cisplatina susijusius pasaulinius metabolito pokyčius, palyginti su žieve [5]. Ankstesni mūsų rezultatai taip pat parodė, kad cisplatina tiesiogiai pažeidžia medulla ląsteles (išskyrus antrinį pažeidimą), atsispindi įvairiuose fosfolipidų ir kardiolipino pakitimuose [4]. Šie nauji rezultatai išplečia šiuos stebėjimus papildomomis lipidų rūšimis ir klasėmis, kurias pakeitė cisplatina, ir sustiprina medulla pažeidimo svarbą cisplatinos sukeltam AKI.
Nors FC ininkstasGydymas cisplatina reikšmingai nepakito, tiek bendras CE, tiek visos išmatuotos atskiros CE rūšys labai padidėjo tiek žievėje (bendras CE padidėjo aštuonis kartus), tiek smegenyse (keturis kartus padidėjo bendras CE) dėl cisplatinos sukeltos dozės.inkstų pažeidimas.Cholesterolis yra pagrindinė plazmos membranų sudedamoji dalis, besiskirianti tarp fosfolipidų ir įtakojanti takumą, paviršiaus krūvį ir polinių galvos grupių sąveiką [35, 36]. Jo buvimas taip pat yra labai svarbus lipidų plaustuose, sukuriant hidrofobinę sąveiką su SM ir yra būtinas molekulėms atskirti ir kontroliuoti jų sąveiką su kitais membranos komponentais [37]. Ląstelės palaiko cholesterolio pusiausvyrą tarp de novo sintezės endoplazminiame tinkle (ER) ir MTL tarpininkaujamo įsisavinimo. Dauguma cholesterolio yra plazmos membranoje, bet taip pat gali grįžti į ER, kur FC gali būti paverstas (per ACAT tarpininkaujantį esterifikavimą) į CE, kuris laikomas citozoline cholesterolio kaupimo forma [36]. CE taip pat gali būti hidrolizuojamas atgal į FC, sudarant cholesterolio esterio ciklą [36]. Tai, kad FC gydymo cisplatina metu nepakito, tačiau CE padidėjo tiek žievėje, tiek smegenyse, rodoinkstųcholesterolio metabolizmas, susijęs su cisplatinos sukeltu AKI. Ankstesni tyrimai parodė gana panašius stebėjimus tiek HK-2 žmogaus proksimalinėse kanalėlių ląstelėse, tiek pelių inkstų žievėje ūminės išemijos metu.inkstų pažeidimas, su nepakitusiu FC ir padidėjusiu CE lygiu [36]. Tokiu atveju labiausiai tikėtinas paaiškinimas atrodė plazmos membranos sužalojimas, sukeliantis padidėjusį FC judėjimą iš membranos į ER, dėl kurio padaugėjo CE. Atsižvelgiant į tai, cholesterolio turtingų lipidų plaustų, o ne plazmos membranos pažeidimas buvo veiksmingesnis padidėjus cholesterolio patekimui į ER [36]. Tokiuose ankstesniuose tyrimuose taip pat buvo numanomas citoprotekcinis CE vaidmuo. Taip pat buvo pranešta apie CE koncentracijos padidėjimą žiurkėmsinkstųžievė ankstyvoje diabetinės nefropatijos stadijoje [29]. Rezultatai taip pat sutampa su pasauliniu neutralių lipidų padidėjimuinkstųproksimaliniai kanalėliai, apie kuriuos pranešta gydymo cisplatina metu [32]. Mūsų rezultatai pirmą kartą rodo, kad bendras CE, be atskirų CE rūšių, padidėjo visame pasaulyje.inkstųžievėje ir smegenyse, cisplatinos sukelto AKI metu. Kita vertus, pats cilastatinas šiek tiek padidino CE 18:0 ir CE 22:6 tik žievėje, nors bendras FC arba CE lygis nepakito. Šis nežymus poveikis gali atsirasti dėl to, kad jo taikinys, DHP-I, yra lipidų plaustuose proksimaliniame kanalėlyje (daugiausia žievėje), o jo sąveikos metu gali būti numanomas nedidelis membranos sutrikimas. Kita vertus, kartu vartojant cisplatiną ir cilastatiną, sumažėjo visų cisplatinos padidintų CE rūšių žievėje, o smegenyse beveik jokio atsistatymo efekto nepastebėta, o CE18:2 atsigavo tik iš dalies. . Tai rodo specifinį cilastatino poveikį proksimalinėse kanalėlių ląstelėse, reikšmingai apsaugodamas nuo ląstelių žūties išplitimo, susijusio su tiesioginiu cisplatinos pažeidimu plazmos membranoje ir lipidų plaustuose žievėje, o ląstelių pažeidimas, susijęs su cholesterolio disbalansu visoje smegenyse. likti beveik neapsaugotam.
Sfingolipidai yra aktyvūs lipidai, daugiausia randami ląstelių membranose ir yra gana daug lipidų plaustų [37]. Keramidai yra pagrindiniai sfingolipidų metabolizmo metabolitai, kuriuose dalyvauja įvairios molekulės ir fermentai, atliekantys svarbų vaidmenį ląstelių procesuose, įskaitant ląstelių augimą, apoptozę, diferenciaciją, atsparumą vaistams ir senėjimą [38, 39]. Be to, sfingolipidai dalyvauja keliuose, susijusiuose su cisplatinos vėžio ląstelių mirtimi ir AKI [33]. Keramidai gali būti generuojami keliais būdais, įskaitant de novo sintezę, sfingomielino hidrolizę arba sudėtingų sfingolipidų perdirbimą [38]. De novo sintezė yra pagrindinis kelias ir vyksta ER, iš palmitoil-CoA ir serino, per daugybę fermentinių sfinganino gamybos būdų, kurie per dihidrokeramido sintazę (CerS) veda į dihidrokeramidus. Galiausiai, dhCer desaturacija sukuria Cer [40]. SM taip pat gali hidrolizuoti sfingomielinazės, gaminančios Cer. Cer gali būti transformuojamas į sudėtingesnius sfingolipidus Golgi aparate: fosforilinamas, kad susidarytų Cer-1-P, signalinė molekulė; paverčiamas SM veikiant SM sintazei; arba glikozilinti, kad būtų gauti hezoksilceramidai (gliukozil- arba galaktozilkeramidai), sulfatidų pirmtakai [38]. Cer taip pat gali būti suskaidytas į sfingoziną, sfingozino-1-fosfato (S1P) pirmtaką, turintį svarbų vaidmenį ląstelių išlikimui ir dauginimuisi, uždegimui ir atsparumui vaistams [39]. Galiausiai, S1P skilimas į etanolaminą ir heksadecenalą yra šio maršruto išėjimo kelias [38].
Kiekybiškai įvertinant sfingolipidų rūšis, gydant cisplatina buvo pastebėtas bendras Cer, dhCer, HexCer ir dhHexCer koncentracijos padidėjimas, o tai buvo ypač aktualu Cer. Skirtumai, susiję su kontroleinkstasbuvo aiškesni kiekybiškai įvertinus atskirus porūšius – 19 iš 22 rūšių padidėjo arba žievėje (11 rūšių) ir (arba) meduloje (18 rūšių), gydant cisplatina. Tai sutampa su ankstesniais stebėjimais, rodančiais Cer ir HexCer padidėjimą pelėjeinkstųžievė, susijusi su gydymu cisplatina [33], tačiau čia mes nustatėme, kad šis poveikis taip pat turi įtakos smegenų smegenims.
Šie stebėjimai gali atspindėti padidėjusią Cer / dhCer ir HexCer / dhHexCer metabolinę gamybą. Viena vertus, tai galėtų įvykti padidinus CerS aktyvumą, atsižvelgiant į ankstesnius stebėjimusinkstųžievėje, kur gydymo cisplatina metu buvo matuojamas ilgos grandinės CerS aktyvumas, o dėl CerS slopinimo sumažėjo pastebėtas Cer / HexCer kaupimasis [33]. Be to, cisplatinos sukeltas SM/dhSM koncentracijos sumažėjimas žievėje ir smegenyse rodo papildomą Cer/dhCer gamybos padidėjimą hidrolizuojant SM/dhSM per sfingomielinazės (SMase) kelią [38], o tai daro ypatingą poveikį ilgos grandinės Cer/dhCer, visa tai kenkia AKI modeliams [40]. Tai taip pat atitiktų faktą, kad ilgos grandinės Cer rūšys yra svarbios AKI metu [40] ir ankstesnius stebėjimus apie padidėjusį SMase aktyvumąinkstųžievė gydymo cisplatina metu [33]. Cer dalyvauja cisplatinos sukeltoje apoptozėje per signalizaciją tiek vidiniais, tiek išoriniais būdais [39]. Vidiniame mitochondrijų kelyje cisplatina sukelia mitochondrijų išorinės membranos pralaidumą. Cer padidėjimas kartu su jo pasroviui metabolitais gali prisidėti prie šio pralaidumo, o kanalų formavimasis Cer palengvina apoptozę mitochondrijų membranoje, leidžiančią Bax patekti į mitochondrijų išorinę membraną, taip pat ištekėti citochromas C [39]. Be to, Fas sukelta išorinė apoptozė naudoja Fas receptorius, esančius lipidų plaustuose, o jo klasterizavimą skatina cisplatinos sukelta SMase aktyvacija ir Cer pakilimas [39]. Todėl Cer nustato cisplatinos sukeltos AKI apoptozę, o jų išlyginimas per transformaciją į HexCer atrodo apsauginis [33] ir yra susijęs su atsparumu cisplatinai [39]. Didelis kiekis Cer taip pat gali paveikti fizines membranų savybes ir išstumti cholesterolį bei paskatinti jo esterifikaciją [35]. Kita vertus, SM daugiausia yra plazmos membranose ir turi tiesioginį ryšį su cholesterolio molekulėmis, ypač svarbiomis lipidų plaustuose [41]. SM regeneracijos trūkumas gali turėti neigiamos įtakos tinkamai membranos funkcijai [41].
Sulfų yra gausuinkstas,ypač distalinių kanalėlių viršūninėje membranoje [42]. Nors normaliai jie nėra būtiniinkstų funkcijaNustatyta, kad sulfo trūkumą kompensuoja padidėjęs sulfatuotų glikolipidų ir choleterolio susidarymas [42]. Sulfatidas yra pagrindinis L-selektino ligandasinkstas,kurie atlieka gyvybiškai svarbų vaidmenį monocitų infifiltracijoje įinkstasinterstitium [42]. Kita vertus, su lipidais susijęs mielino ir limfocitų baltymas (MAL) sudaro kompleksus su sulfatidais ir glikosfingolipidais.inkstųmembranos, prisidedančios prie glikosfingolipidais praturtintų mikrodomenų stabilizavimo ir rūšiavimo [42]. Mūsų rezultatai apie sulfato pokyčius žievėje ir smegenyse patvirtina ankstesnius tyrimus, kuriuose buvo manoma, kad cisplatina inkstuose taip pat pakeitė įvairias sulfatidų rūšis [34].
Visos Cer, dhCer, HexCer ir dhHexCer rūšys, kurias žievėje pakeitė cisplatina, buvo iš dalies arba visiškai atkurtos kartu vartojant cilastatiną, o smegenyse daug Cer rūšių nebuvo atkurta, o dhCer atsigavo beveik visiškai. , HexCer ir dhHexCer. Atsižvelgiant į Cer rūšių dalyvavimą Fas sukeltoje išorinėje apoptozėje ir jos blokavimą, kai cilastatinas prisijungia prie DHP-I lipidų plaustuose proksimaliniame kanalėlyje, tai gali paaiškinti apsauginį poveikį ir Cer atsigavimą, daugiausia vykstantį žievės ląstelėse. Kalbant apie SM, dhSM ir Sulf, atrodė, kad cilastatino atsistatymas yra svarbesnis smegenyse nei žievėje, o tai rodo, kad cilastatino veikimas proksimaliniuose kanalėliuose, pasiekiančiuose išorinę smegenis, kur daugumainkstų pažeidimasyra koncentruotas [4].
Fosfolipidai yra gausiausios rūšys ląstelių membranose, kuriose vyrauja PC ir, kiek mažesniu mastu, PE, daugiau PC yra luminalinėje pusėje, o PE yra daugiau citozoliniame lapelyje [35, 43]. Kita vertus, lizofosfolipidai yra signalinės rūšys, kurios gali būti gaunamos hidrolizuojant glicerofosfolipidus, įskaitant LPC [35]. Nustatyta, kad dauguma 60 kiekybiškai įvertintų PC, PE ir LPC rūšių buvo pakeistos gydant cisplatina žievėje arba smegenyse, o PC ir LPC žievės pakitimai buvo didesni, o su PE susijusių pokyčių buvo daugiau. ir ryškus smegenyse. PakeitimaiinkstųPC, PE arba LPC rūšys, atsiradusios dėl gydymo cisplatina, atitinka ankstesnius pastebėjimusinkstasAKI metu [4,5,26,34,44]. Mūsų rezultatai rodo, kad daugumą pakeistų PE, PC ir LPC rūšių cisplatina sumažino tiek žievėje, tiek smegenyse. Kalbant apie cilastatino nefroprotekcinį poveikį, stebina, kad cisplatinos pakeistų lipidų smegenyse buvo pastebėtas didesnis dalinis arba visiškas atsistatymo poveikis nei žievėje. Kitas įdomus faktas yra tai, kad visas tas cisplatinos padidintas PC, PE ir LPC rūšis žievėje ir smegenyse atkūrė cilastatinas, o dauguma cisplatinos sumažėjusių rūšių žievėje vis dar buvo pakeistos kartu gydant cilastatinu. Tai gali reikšti didesnį tiesioginės žalos laipsnį, kurį sukelia cisplatinos kaupimasis žievėje, neapsaugotas nuo cilastatino, ir dėl to miršta ląstelė ir su tuo susiję PC, PE (pagrindiniai ląstelės membranos komponentai) ir LPC išsiskyrimas apoptoziniuose kūnuose ir todėl jų lygių sumažėjimas. Priešingai, cilastatinas gali apsaugoti nuo antrinės žalos, susijusios su išorine apoptoze ir dėl to sukeltu baltymų kaupimu proksimaliniuose kanalėliuose. Tai reikštų, kad PC, PE ir LPC rūšys sumažėjo medulėje ir yra labiau susijusios su cisplatinos sukeltu antriniu ląstelių pažeidimu. Kita vertus, padidėjusios PC, PE ir LPC rūšys gali būti susijusios su ląstelių membranos regeneracija arba signalizacijos procesais, kurie, remiantis šiais rezultatais, gali būti labiau susiję su antrine išorine apoptoze, kurią sukelia cisplatina, apsaugota cilastatinu.
Be to, taip pat buvo pastebėtas cisplatinos sukeltas PC ir PE rūšių, turinčių labai nesočiųjų riebalų grandinių, procento sumažėjimas, kuris gali būti susijęs su lipidų peroksidacijos procesais, o jį sumažintų cilastatinas [4, 10, 11].
Pasauliniu mastu, atsižvelgiant į čia kiekybiškai įvertintas lipidų rūšis, cilastatino atsistatymo poveikis buvo pastebėtas 26 iš 56 cisplatinos pakeistų lipidų žievėje ir 50 iš 63 cisplatinos pakeistų lipidų smegenyse. Galbūt tai atspindi didelius lipidų pokyčius, susijusius su neapsaugotu tiesioginiu mitochondrijų pažeidimu, kurį cisplatina daugiausia daro žievėje, palyginti su smegenimis, o daugiau lipidų pokyčių, susijusių su antrinės žalos apsauga, aptikta visoje medulėje. Be to, daugiamatė analizė leido nustatyti galimus naujus lipidų biomarkerius tiek cisplatinos sukeltam AKI, tiek cilastatinui.nefroprotekcija, įskaitant CE, Sulf, PE, PC, Cer arba HexCer rūšis, kaip aprašyta 2.5 ir 2.6 skyriuose. Remiantis mūsų išvadomis, CE 18:2 ir PE 36:5 yra galimi biomarkeriai, galintys tuo pačiu metu atskirti cisplatinos ir cilastatino pažeidimus.nefroprotekcijatiek žievėje, tiek smegenyse. Tačiau kadangi šių dviejų rūšių atkūrimas naudojant cilastatiną yra dalinis, tinkamesnės rūšys kaip biologiniai žymenys būtų dhHexCer 34:0 žievėje ir Sulf 42:0 smegenyse, kad būtų galima atskirti abu.inkstų pažeidimasir apsauga, o cilastatinas visiškai atkuria cisplatinos pakeistus kiekius iki kontrolinės grupės. Tai gali būti ekstrapoliuojama į bet kokį Fas / Fas ligando sukeltą inkstų pažeidimą, tačiau tai turėtų būti patvirtinta būsimuose tyrimuose. Pastaraisiais metais buvo pasiūlyta keletas naujų AKI biomarkerių, daugiausia baltymų (pvz., KIM-1 [45] arba NGAL [46]). Tai, kad radome potencialius naujus cisplatinos sukeltos AKI ir susijusios apsaugos nuo cilastatino biomarkerius, turinčius lipidų pobūdžio.inkstasaudinį, praplečia turimas žinias ir suteikia papildomų galimybių geriau diagnozuoti, prognozuoti ir stebėti. Tiesą sakant, biologinių žymenų aptikimo derinys netgi gali būti naudojamas kaip specifinio AKI, kurį sukelia tam tikras nefrotoksinis preparatas (pvz., cisplatina) arba kita priežastis, požymis ir netgi atskirti ligos būklę / progresavimą. Kitas žingsnis būtų nustatyti, ar mūsų rezultatai pasikeisinkstųlipidų modeliai taip pat atsispindi cirkuliuojančiuose lipiduose kraujyje arba šlapime. Tai leistų aptikti cisplatinos sukeltos AKI ir cilastatino biomarkeriusnefroprotekcijalabiau įmanoma pacientams.
Cisplatinos sukeltų AKI susijusių lipidų kiekio pokyčių yra daug ir įvairių, įskaitant svarbius struktūrinius lipidus.inkstųstruktūra: žievė ir medulla. Daugelio šių pokyčių susilpnėjimas cilastatinu rodo didelį jo tobulėjimo potencialąinkstų funkcijair su lipidais susijusių struktūrinių pokyčių mažinimas, koreliuojantis su normalizuotuinkstųmorfologija. Vėlgi, cilastatinas pasirodė esąs naudingas norint nustatyti neapsaugotus tiesioginius ląstelių pažeidimus, kuriuos sukelia cisplatina, ir antrinius pokyčius, susijusius su pirminiu pažeidimu, kuriuos proksimaliniuose kanalėliuose gali pakenkti cilastatinui užblokavus Fas sukeltą apoptotinį kelią.
Medžiagos ir metodai
ReagentaiBuvo naudojamas cilastatinas (maloniai tiekiamas Merck Sharp ir Dohme SA, Madridas, Ispanija) ir cisplatina (Pharmacia Nostrum (Madridas, Ispanija). {{0}},9 proc. NaCl tirpalas (Braun Medical SA, Barselona, Ispanija) buvo naudojamas vaistiniams tirpalams ruošti. ß-1,10-N-dodekanoil-D-eritro-sfingozinas [HexCer 30:1 (d18:1/12:0)], N-dodekanoilas D -eritrosfinganilfosforilcholinas [dhSM 3{{50}}:0 (d18:0/12:0)], 1,2-dimiristoleoil-sn glicerolis-3- fosfocholinas [PC 28:2 (14:1/14:1)], 1-heptadekanoil-2-hidroksi-sn-glicero-3- fosfocholinas [LPC (17:0)] ir 1, 2- dipalmitoleoil-sn-glicero-3-fosfoetanolaminas [PE 32:2 (16:1/16:1)] buvo įsigytas iš Avanti Polar Lipids (Alabaster, Alabama, JAV). Deuteruotas N-tetrakozanoil- D-eritro-sfingozinas [Cer 42:1-d7 (d18:1/24:0)], N-stearoil-D-eritro-dihidrosfingozinas [dhCer (36:0-d3)] , ir C16-30-sulfogalaktozilceramidas [Sulf 34:1(d18:1/16:0)] buvo įsigyti iš Matreya LLC (State College, PA, JAV). Cholesterol-d7 (FC-d7) ir cholesteril-d7 palmitatas [CE (16:0-d7)] buvo iš Sigma-Aldrich.
Buvo naudojami išskirtinai HPLC arba LC-MS tirpikliai ir reagentai, įskaitant metanolį (MeOH), acetonitrilą (ACN) ir izopropanolį (iPrOH) (VWR International Eurolab, Barselona, Ispanija), taip pat chloroformą, dichlormetaną ir amonią matei. (NH4COOH) („Sigma-Aldrich“, „Merck Life Science SL“, Madridas, Ispanija). Itin grynas vanduo buvo gautas iš Milli-Q valymo sistemos (Millipore, Merck Life Science SL, Madridas, Ispanija).
Gyvūnų modelisSuaugę žiurkių patinai (WKY, Criffa, Barselona, Ispanija) buvo veisiami Instituto de Investigación Sanitaria Gregorio Marañón (IiSGM, Madridas, Ispanija). Jie buvo laikomi kontroliuojamose temperatūros, šviesos ir drėgmės sąlygomis, laisvai prieiga prie maisto ir vandens. Gydymas buvo skiriamas intraperitoniniu būdu, kaip aprašyta anksčiau [4,11] keturioms žiurkių grupėms (n=6 gyvūnų vienoje grupėje): 1 grupė: kontrolinė (CNT) – 0.9 proc. NaCl buvo švirkščiama į žiurkėms taip pat, kaip ir 3 ir 4 grupių gydymui; 2 grupė: Cilastatinas (CIL) – švirkščiamas (150 mg kg 1 kūno svorio (kw) per dieną); 3 grupė: cisplatina (CISPL) švirkščiama (unikali 5 mg kg 1 kūno svorio dozė 0 dieną); ir 4 grupė: cisplatina ir cilastatinas (CISCIL) – švirkščiama 5 mg kg 1 kūno svorio 0 dieną ir sušvirkšta cilastatina (150 mg kg 1 kūno svorio per dieną). Gyvūnai buvo paaukoti praėjus penkioms dienoms po gydymo pradžios. Prieš tai 24 valandas šlapimas buvo surinktas į metabolinius narvus iš kiekvienos žiurkės. Kraujo serumas taip pat buvo išskirtas centrifuguojant. Inkstai buvo pašalinti po perfuzijos 0,9 proc. fiziologiniu tirpalu esant 4 °C temperatūrai, po to dekapsuliuojant. Kairiosios pusės žievė ir medullainkstasir skersai nupjauta dešinės pusės pusėinkstasbuvo iškirpti, greitai užšaldyti skystame N2 ir galiausiai laikyti t 80 ◦C temperatūroje. Kita pusė dešinėsinkstasbuvo fiksuotas 4 procentų paraformaldehidu ir įterptas į parafiną histologiniams tyrimams.
Histologiniai tyrimaiHematoksilino / eozino dažymas (Sigma-Aldrich, Steinhem, Vokietija) buvo atliktas 5 µm sagitalinei žiurkei.inkstasskyriuose. Mikronuotraukoms 20 ir 60 kartų didinant histologiniam tyrimui buvo daromas apverstas IX70 mikroskopas (Olympus, Hamburgas, Vokietija).
Inkstų funkcijos rodikliaiAutoAnalyzer Cobas 711 (Roche, Bazelis, Šveicarija) buvo naudojamas BUN, kreatinino, natrio ir kalio nustatymui serumo mėginiuose. Apskaičiuojant GFR buvo naudojamas kreatinino klirenso greitis. Bendras baltymų kiekis šlapime nustatytas sulfosalicilo rūgšties metodu [47].
Audinių homogenizacija Inkstasžievės ir smegenų žievės audiniai (kiekvienas maždaug po 50 mg) buvo sudėti į 1,5 ml talpos plastikinius mėgintuvėlius su užsukamu dangteliu, kuriame yra 800 µL lizės buferinio tirpalo: 50 mM Tris-HCl pH 7,5, 125 mM NaCl, 5 mM NaF, 1,4 mM Na3VO, 1,4 mM Na41O7P ir proteazės inhibitorius (Pierce Biotechnology, Inc., Rockford, IL, JAV) ir 1,5 mm cirkonio granules. Audiniai buvo išskaidyti naudojant BeadBug{19}} Homogenizatorių (Benchmark D1036-E, Bechmark Scientifific, Sayreville, NY, JAV) esant 4500 aps./min., trimis ciklais po 90 s. Homogenatas toliau buvo apdorojamas ultragarsu 40 s esant 10 procentų amplitudės ir centrifuguojamas 600 × g 1 minutę 4 °C temperatūroje. Gauto supernatanto alikvotinė dalis buvo atskiesta santykiu 1:10, kad būtų galima nustatyti bendrą baltymą bicinchonino rūgšties (BCA) baltymų tyrimu (Pierce Biotechnology Inc., Rockford, IL, JAV). Likusi baltymų ekstrakto dalis buvo laikoma t 80 ◦C temperatūroje iki lipidinės analizės.
Lipidominė analizė LC-MS/MSLipidai buvo išgauti iš audinių (atitinka 250 µg viso baltymo) taikant Folcho metodą [48]. Prieš lipidų ekstrakciją buvo pridėta dešimt mikrolitrų vidinio standarto (IS) mišinio, kad būtų gautas santykinis molinis lipidų rūšių kiekybinis įvertinimas, kaip aprašyta anksčiau [49]. IS mišinį sudarė: CE (16:0-d7), FC-d7, Cer (42:{{10}} d7), HexCer (30 :1), LPC (17:0), PC (28:2), PE (32:2), SM (30:1), dhSM (30:0), dhCer (35:0) ir Sulf (34) :1), S4 lentelėje nurodytomis koncentracijomis. Lipidų ekstraktai buvo džiovinami azoto srove ir ištirpinami 250 µl acetonitrilo/izopropanolio (1:1, tūrio: tūrio), 10 minučių apdoroti ultragarsu, o po to perkelti į injekcinį buteliuką.
Penki mikrolitrai lipidų ekstrakto buvo sušvirkšti į LC sistemą Eksigent UltraLC{{0}} (AB-Sciex LLP, Framingham, MA, JAV). Rūšys buvo atskirtos Kinetex C18 kolonėlėje (100 × 2,1 mm, 1,7 µm; Phenomenex, Macclesfifield, JK), veikiančioje 55 ◦C temperatūroje. Eliuacija buvo taikoma naudojant dvejetainį tirpiklio A mišinį (60 procentų acetonitrilo vandenyje, 10 mM NH4COOH) ir tirpiklio B (90 procentų izopropilo alkoholio acetonitrile, 10 mM NH4COOH) ir tiesinį gradientą nuo 60 procentų A iki 100 procentų B 12 m. min ir 100 procentų B iki 60 procentų A per 8 minutes, esant 0,4 mL tėkmės greičiui min 1 . Lipidų aptikimui buvo naudojamas QTrap 4000 instrumentas (AB-Sciex LLP, Framingham, MA, JAV) su Analyst 1.6.2 programine įranga. Azotas buvo naudojamas ir kaip džiovinimo dujos (T: 500 ◦C, slėgis: 30 psi), ir kaip purškimo dujos (50 psi). Aptikimas buvo nustatytas elektropurškimo (ESI) teigiamu režimu visoms lipidų klasėms, išskyrus Sulf, kuris buvo analizuojamas ESI neigiamu režimu. CE ir FC buvo analizuojami naudojant atmosferos slėgio cheminės jonizacijos (APCI) šaltinį teigiamų jonų režimu. Lipidų aptikimui buvo naudojamas tikslinis metodas, nustatantis daugybinius reakcijos stebėjimo (MRM) perėjimus kiekvienai lipidų rūšiai jų sulaikymo laiku (S5 lentelė). LC-MS/MS smailių chromatogramos buvo apdorotos naudojant Skyline programinės įrangos versiją 4.1 (MacCoss Lab, Seattle, WA, JAV) [50]. Lipidų rūšys buvo kiekybiškai įvertintos tiesiogiai lyginant kiekvienos rūšies plotą su jų lipidų klasės IS plotu, kaip aprašyta anksčiau [49]. Rezultatai buvo išreikšti nmol/mg baltymo. Bendras lipidų klasės lygis buvo nustatytas kaip kiekybiškai įvertintų atskirų lipidų klasės rūšių suma. Lipidų rūšys buvo priskirtos pagal rekomenduojamą žymėjimą [51].
Statistinė analizėVertės buvo išreikštos kaip vidurkis ± standartinis nuokrypis. SPSS 11.5 (SPSS, Chicago, IL, JAV) buvo naudojamas aprašomajai statistikai ir statistiniams kintamųjų skirtumams tarp grupių įvertinti dispersijos analizės būdu. Dviejų nesuporuotų grupių lipidų kintamiesiems palyginimui atlikti parametriniai (dviejų uodegų nesuporuoti Stjudento t) arba neparametriniai (Mann–Whitney) testai, atlikus normalumo testą (Shapiro–Wilk). Benjamini-Hochberg metodas buvo naudojamas klaidingai aptikimo dažnio (FDR) p-reikšmių korekcijai lyginant kelias atskiras lipidų rūšis. Dvipusė p reikšmė < 0.05="" ir="" fdr="">< 0,1="" buvo="" atsižvelgta="" siekiant="" nustatyti="" statistiškai="" reikšmingus="" skirtumus,="" kad="" būtų="" išvengta="" potencialių="" biomarkerio="" kandidatų="" trūkumo.="" x="" grupės="" pokytis,="" palyginti="" su="" y="" grupe,="" buvo="" apskaičiuotas="" kaip="" atitinkamų="" grupių="" x:y="" kintamųjų="" vidutinių="" verčių="">
Daugiamatė duomenų analizė (MVDA) buvo atlikta naudojant SIMCA 14.1 versiją (MKS Umetrics, Upsala, Švedija) ir MetaboAnalyst 5.0 (https://www.metaboanalyst.ca (prieiga 30 rugsėjo 2 d.) {{20}}21)) [52], įskaitant neprižiūrimą PCA ir prižiūrimą OPLSDA. Trūkstamos reikšmės buvo pakeistos k-arčiausių kaimynų metodu. Kintamieji buvo logaritmiškai transformuoti ir pareto masteliu prieš MVDA. Modeliai buvo įvertinti pagal jų R2 ir Q2 reikšmes. OPLS-DA buvo patvirtintas permutacijos testu (100 ciklų). VIP balai ir S-plotai iš OPLS-DA modelių buvo naudojami siekiant nustatyti atitinkamus kintamuosius CISPL ir CNT, CISCIL ir CNT ir CISCIL ir CISPL grupių diskriminacijos atveju. Vienu metu laikomasi VIP > 1, apkrovos išskaidytos kaip koreliacijos koeficientas |p(corr)| > 0,5, o dvipusė p reikšmė < 0,05="" ir="" fdr="">< 0,1="" dviejų="" grupių="" palyginimui="" buvo="" kriterijai,="" naudojami="" potencialaus="" biomarkerio="" atrankai.="" auc="" reikšmės="" buvo="" gautos="" iš="" roc="" kreivės="">
PatentaiŠie patentai iš dalies susiję su šiame rankraštyje pateiktu darbu: „Cilastatino naudojimas įvairių junginių nefrotoksiškumui mažinti“ (patento numeriai EP2 143 429 B1; US 9 216 185 B2; US 9 522 128 B2 ir US9 757 349 B). Jie priskirti Fundación para la Investigación Biomédica ligoninei Gregorio Marañón (FIBHGM), o FIBHGM suteikė Telara Pharma SL licenciją Telara Pharma SL šiuo metu yra sudariusi licencijavimo sutartį su Arch Biopartners.