Vietinis nehipofizės augimo hormonas sukelia senėjimą ir palengvina epitelio pažeidimą

Prašau susisiektioscar.xiao@wecistanche.comDaugiau informacijos

SANTRAUKA

Mikroaplinkos veiksniai, moduliuojantys su amžiumi susijusią DINA žalą, yra neaiškūs. Nehipofizės augimo hormonas (np) indukuojamas žmogaus storojoje žarnoje, netransformuotose žmogaus gaubtinės žarnos ląstelėse ir fibroblastuose bei 3-dimensiniuose žarnyno organoiduose su su amžiumi susijusiais DNR pažeidimais. Autokrininis / parakrininis npGH slopina p53 ir susilpnina DNR pažeidimo atsaką (DDR), sukeldamas TRIM29 ir sumažindamas ATM fosforilinimą, todėl sumažėja DNR atstatymas ir DNR pažeidimų kaupimasis. Iki 4 mėnesių kultivuojami organoidai pasižymi senėjimo žymenimis, p16 ir SA- -galaktozidaze ir sumažėjusiu telomero ilgiu, taip pat DNR pažeidimo kaupimu, padidintu npGH, slopintu p53 ir susilpnėjusiu DDR. GH slopinimas senuose organoiduose padidina p53 ir sumažina DNR pažeidimus. WT pelėms būdingas nuo amžiaus priklausomas gaubtinės žarnos DNR pažeidimo kaupimasis, o senoms pelėms, kurioms nėra gaubtinės žarnos GH signalizacijos, DNR pažeidimas išlieka mažas, o p53 yra padidėjęs. Kadangi su amžiumi susijusi npGH indukcija įgalina proliferacinę mikroaplinką, npGH signalizacijos panaikinimas gali būti taikomas kaip anti-senėjimo terapija, trukdant DNR pažeidimams ir su amžiumi susijusioms patologijoms.

ĮVADAS

Biologinės funkcijos silpsta senstant, kartu didėjant su amžiumi susijusioms ligoms.flavonoidųSu amžiumi susijusias patologijas lemia susikaupę DNR pažeidimai ir DNR atstatymo trūkumai, sukeliantys mutacijas ir su amžiumi susijusias chromosomų aberacijas. Nuolatinis DNR pažeidimas taip pat gali blokuoti ląstelių dauginimąsi, dėl kurio atsiranda senėjimas ir apoptozė, taip dar labiau skatinant senėjimo procesą (Ou ir Schumacher, 2018). DNR pažeidimai kaupiasi su amžiumi laukinio tipo (WT), netransformuotose žmogaus ir pelių ląstelėse, kaip rodo padidėjęs fosforilinto histono 2A variantas (yH2AX), dvigubų DNR pertraukų (DSB) žymuo (Sedelnikova ir kt., 2004) ir nepataisyti DNR pažeidimai (Dolle ir kt., 1997; Hasty ir kt., 2003; Lombard ir kt., 2005; Petr ir kt., 2020). Genominis nestabilumas, atsirandantis dėl defektinio DNR pažeidimo atstatymo, gali paskatinti ląstelių transformaciją (Negrini ir kt., 2010). DNR pažeidimas sukelia ataksijos-telangiektazijos mutuotų (ATM) genų, atsakingų už vienos grandinės DNR pertraukų ir DSB, fosforilinimą. ATM fosforilina ir stabilizuoja naviko slopintuvą p53, taip užtikrindamas DNR pažeidimo atstatymą palengvindamas kelis DNR atstatymo būdus. Taigi, bankomatas atlieka pagrindinį vaidmenį suaktyvinant atsaką į DNR pažeidimą (DDR) ir DNR taisymą (Ou ir Schumacher, 2018).

Norėdami sužinoti daugiau, spustelėkite čia

ATM ekspresija ir aktyvumas prastėja su amžiumi (Feng ir kt., 2007; Gutierrez-Martinez ir kt., 2018), todėl greičiausiai prarandamas su amžiumi susijęs funkcinis p53 ir atsiranda DNR pažeidimai bei chromosomų nestabilumas (Simon ir kt., 2009). .p53 atsakas į stresorius, tokius kaip spinduliavimas, yra mažesnis vyresnio amžiaus pelėms (Feng ir kt., 2007) ir žmogaus odos fibroblastams, gautiems iš pagyvenusių asmenų (Goukassian ir kt., 2000). Taigi, senėjimo požymiai yra sumažėjęs DDR aktyvumas ir p53 slopinimas su sukauptais nepataisomais DNR pažeidimais, o tai sudaro palankią aplinką epitelio proliferacijai (Lopez-Otin ir kt., 2013).

Kadangi su amžiumi hipofizės augimo hormono (GH) sekrecija mažėja, senėjimo procesui įtakos turėjo pakitęs GH signalas (Ho ir Hoffman, 1993). Nepaisant to, daugybė įrodymų patvirtina teigiamą GH slopinimo poveikį senėjimui. Ląstelėje pelių. ir žmonių ligų modeliai (Brown-Borg ir kt., 1996; Junnila ir kt., 2013), GH trūkumo nauda pirmiausia kyla iš stebėjimų, palankesnių antriniams veiksniams, kurie prailgina gyvenimo trukmę, įskaitant padidėjusį jautrumą insulinui, sumažėjusią kepenų baltymų oksidaciją. , sumažėjo sergamumas vėžiu ir su amžiumi susijęs uždegimas (Aguiar-Oliveira ir Bartke, 2019; Bartke, 2016; Junnila ir kt., 2013; Spadaro ir kt., 2016). Leideno tyrimų šeimų palikuonys, kurių šeimos ilgaamžiškumas ir mažesnis mirtingumas nei aplinkai suderintos kontrolės priemonės turi mažesnį integruotą cirkuliuojantį GH lygį (van der Spoeletal., 2016), o GH perteklius sumažina pacientų, sergančių akromegalija, gyvenimo trukmę (Chesno-kova ir kt., 2019a; Melmed, 2020; Waters ir Barclay, 200). 7) ir transgeniniuose pelių modeliuose, kurie per daug ekspresuoja GH (Bartke, 2003).hesperidino vartojimasKai kurie siūlė neigiamą koreliaciją tarp ūgio ir ilgaamžiškumo žmonėms (He ir kt., 2014; Samaras and Storms, 1992) ir šunims (Greer ir kt., 2007). Mes iškėlėme hipotezę, kad neigiamas GH poveikis senėjimui gali bent jau iš dalies priskiriami sukauptiems DNR pažeidimams (Ches-nokova ir Melmed, 2020). Remiantis šia prielaida, limfocitai, gauti iš akromegalijos pacientų, pasižymi DNR pažeidimu ir padidėjusiomis chromosomų aberacijomis (Bayram ir kt., 2014), o nepataisyti DNR pažeidimai kaupiasi zebrafinės akromegalijos modelio kepenyse (Elbialy ir kt., 2018). Didelis cirkuliuojantis GH kiekis susilpnina pelių gaubtinės žarnos DNR atstatymą, sukeldamas DNR pažeidimo kaupimąsi, o DNR pažeidimas susilpnėja blokavus GH receptorių (GHR) žmogaus gaubtinės žarnos ląstelėse ir pelėms, kurių GHR signalizacija panaikinta (Chesnokova ir kt., 2019a).

Nehipofizės GH (np), susintetintas lokaliai periferiniuose audiniuose, yra identiškas endokrininiam GH1, kurį gamina hipofizė, ir veikia per autokrininius / parakrininius mechanizmus per plačiai išreikštą GHR (Ballesteros ir kt., 2000), kuris atpažįsta ir hipofizės GH (npGH ligandus) Waters ir Barclay, 2007; Waters ir kt., 2006).prarasta imperija cistancheKadangi DDR aktyvacija sukelia npGH (Chesnokova ir kt., 2013), iškėlėme hipotezę, kad su amžiumi susijęs sukauptas gaubtinės žarnos DNR pažeidimas sukelia npGH ekspresiją, o tai savo ruožtu dar labiau apribotų DNR pažeidimo taisymą.

Cistanche gali kovoti su senėjimu

Naudodami tiek in vitro, tiek ex vivo žmogaus modelius, atspindinčius senėjimą, čia parodome, kad npGH yra sukeltas ir DNR pažeidimai kaupiasi senesniuose žmogaus audiniuose, kaip rodo padidėjęs H2AX fosforilinimas (yH2AX). Be to, storosios žarnos DNR pažeidimas žymiai padidėja senoms WT pelėms, o epitelio DNR pažeidimas išlieka mažas amžių atitinkančioms GHR{4}} pelėms, neturinčioms GH signalizacijos, ir gaubtinės žarnos specifinėms GHR išmuštoms pelėms (GHRcolKO).

Vietinis npGH taip pat buvo sukeltas senuose 3-matmenų (3D) žarnyno organoiduose, sukurtuose iš indukuotų žmogaus pluripotentinių kamieninių ląstelių (iPSC) (Barrett ir kt., 2014; Chesnokova ir kt., 2019a). Organoidas npGH savo ruožtu slopino p53 ir susilpnino DNR pažeidimo taisymą.mikronizuota išgryninta flavonoidų frakcija 1000 mgTikėtina, kad npGH poveikis buvo parakrininis, nes augant GH ekspresuojančius fibroblastus kartu su storosios žarnos žarnos mikroskysčių prietaisais, įtaisytais su žmogaus kolonoidais, buvo slopinamas p53/p21 ir sustiprėjo DNR pažeidimai. Priešingai, GH slopinimas senuose organoiduose užkirto kelią DNR pažeidimui.

Taigi parodome, kad epitelio npGH yra stipriai indukuojamas senėjimo metu ir kad npGH sumažina DNR atstatymą ir palengvina su amžiumi susijusių DNR pažeidimų kaupimąsi. Apskritai rezultatai rodo, kad vietinis gaubtinės žarnos epitelio npGH sukelia gleivinės lauko pokyčius, sukurdamas chromosomų nestabilumo aplinką, kuri yra palanki senstančių audinių neoplastiniam vystymuisi.

Svarbu tai, kad nors plačiai paplitęs netinkamas GH kaip „anti-senėjimo“ hormono naudojimas, nepaisant įtikinamo poveikio senėjimo procesui (Blackman ir kt., 2002; Clemmons ir kt., 2014; Lieut al., 2007); Melmed, 2019), mūsų rezultatai rodo, kad vietinis GH signalizavimas prisideda prie audinių mikroaplinkos ir skatina su amžiumi susijusių patologijų vystymąsi. Todėl vietinio npGH signalizacijos slopinimas, siekiant apriboti neigiamą epitelio DNR pažeidimą, gali pasiūlyti anovulianto senėjimo terapinį tikslą. Šių tyrimų rezultatai rodo novatorišką požiūrį į gyvenimo trukmės pratęsimą (ty vietinio GH signalizacijos slopinimą, o ne indukciją). REZULTATAI

Žmogaus gaubtinės žarnos DNR pažeidimai ir npGH kaupiasi senstant

Su amžiumi susijęs DNR pažeidimas buvo įvertintas nenavikinių žmogaus gaubtinės žarnos parafino audinių mėginiuose, paimtuose iš pacientų grupių, apimančių 3 amžiaus grupes: jaunų (18-39 m.), vidutinio amžiaus (40-60 m.) ir amžiaus ( 61-88 metų). Įvertinus yH2AX, 3 iš 11 mėginių (27 proc.) jaunoje kohortoje buvo DNR pažeidimai, 8 iš 16 (50 proc.) – vidutinio amžiaus, o 8 iš 18 (45 proc.) senų mėginių – DNR pažeidimai (paveikslai). 1A-1C ir 1J).

Kaip mes anksčiau parodėme, kad DNR pažeidimas sukelia npGH (Chesnokova ir kt., 2013), siekėme nustatyti, ar nuo amžiaus priklausomas DNR pažeidimo kaupimasis buvo susijęs su GH ekspresija ne navikiniame gaubtinės žarnos audinyje. Kadangi neuroendokrininėse storosios žarnos ląstelėse nėra išreikštas (Chesnokova ir kt., 2016), mes neįtraukėme šių ląstelių iš analizės.

Epitelio GH ekspresija buvo aptikta 16 procentų -17 procentų normalių storosios žarnos mėginių, gautų iš vidutinio amžiaus ir amžiaus grupių (atitinkamai 38 ir 42 mėginiai), tačiau tik 2 procentuose jaunos grupės (37 mėginiai), o GH ekspresijos balas buvo padidintas vidutinio amžiaus grupėje ir toliau padidėjo senų kohortos mėginiuose (p<0.01) (figures="" 1d-1f="" and="" 1k).="" furthermore,="" colon="" mrna="" gh="" expression="" increased="" in="" both="" middle-aged="" (30%="" of="" 10="" samples)="" and="" aged="" (26%="" of="" 14="" samples)="" versus="" young="" cohort="" samples(17%="" of9=""><0.01 and=""><0.05, respectively)(figures="" 1g-1).="">oteflavonoidasApibendrinant, šie rezultatai rodo, kad DNR pažeidimai kaupiasi be indukcijos senstančioje dvitaškyje.

DDR aktyvinimas sukelia vietinį npGHin pelių ir žmogaus gaubtinę žarną

Toliau svarstėme, ar aktyvuota DDR sukelia vietinę gaubtinės žarnos npGH ekspresiją, ir gydėme peles nutlin3, kad stabilizuotų p53 (Vassilev ir kt., 2004), ir stebėjome indukuotą gaubtinės žarnos p53 ir aukštesnę (2A pav.). Be to, gaubtinės žarnos adenokarcinomos mėginiai, gauti iš tų pačių pacientų. prieš ir po DNR pažeidžiančios terapijos (S1 lentelė) visuose 6 tirtuose pacientų mėginiuose stebėjome nedidelę pradinę epitelio npGH ekspresiją prieš gydymą ir padidėjusią npGH ekspresiją po gydymo (p<0.01) (figure="" 2b).="" enhanced="" gh="" expression="" was="" also="" observed="" in="" tumor-associated="" fibroblasts="" after="" dna="" damage(figure="" 2c),="" indicating="" that="" these="" findings="" are="" likely="" not="">

DDR aktyvina GH ekspresiją in vitro

Mes panaudojome topoizomerazės Il inhibitorių etopozidą, kad sukurtume tiek vienos grandinės DNR pertraukas, tiek DSB (Walles ir kt., 1996) ir nustatytume, ar DDR aktyvuoja GH in vitro. DNR pažeidimo sukeltas npGH NCC, hNCF ir HCT116 žmogaus gaubtinės žarnos adenokarcinomos ląstelėse (3A ir S1A-S1C pav.); organiniuose iduose etopozido sukelta GH ir GH mRNR (3B ir S1D paveikslai), o IGF1 ir prolaktino mRNR lygiai nepakito (S1E pav.). STAT5 fosforilinimas, pasroviui esantis GH signalas (Waters, 2016), buvo sukeltas visų tipų ląstelėse (3A-3C ir S1A-S1C pav.). Priešingai, npGH panaikinimas GH maža trukdančia RNR (siRNR) neleido etopozidui indukuoti pSTAT5 (3C ir S1F pav.), o tai rodo, kad DNR pažeidimo sukelta gaubtinės žarnos npGH yra funkciškai aktyvi. NCC vaizdavimas, apdorotas etopozidu 24 valandas, parodė GH ir yH2AX koekspresiją keliose ląstelėse (3D pav.).

DNR pažeistos epitelio ląstelės išskiria GH Norėdami nustatyti, ar sukeltas intracelulinis npGH turi autokrininį / parakrininį poveikį, įvertinome GH lygį, išskiriamą į NCC ir organoidinę auginimo terpę po gydymo etopozidu. Terpė, surinkta iš ANCC praėjus 8 ir 24 valandoms po gydymo ir iš organoidų po 4-48 val. po gydymo, parodė nuo laiko priklausomą GH padidėjimą po DDR aktyvinimo (3E pav.). Kadangi NCC ir organoidai ekspresuoja GH receptorius, kaip ir žmogaus gaubtinės žarnos audinys (Chesnokova ir kt., 2016), šie rezultatai rodo, kad vietinis GH, sukeltas reaguojant į DNR pažeidimą, gali paveikti senstantį audinį autokrininiu / parakrininiu poveikiu.

Autokrininis / parakrininis GH slopina žmogaus gaubtinės žarnos ląstelę p53

Kadangi endokrininis GH slopina pelių gaubtinės žarnos p53 (Chesnokova ir kt., 2016), mes nustatėme, ar vietinis GH daro panašų au-autokrininį / parakrininį poveikį žmogaus epitelio gaubtinės žarnos ląstelėse. Dviejų atskirų NCC linijų, gautų iš dviejų skirtingų pacientų po nukleofekcijos hGH arba užsikrėtimo lentivirusu, ekspresuojančiu GH (lenti-GH) (4A, 4B ir S2 paveikslai), taip pat organoidus, stabiliai ekspresuojančius hGH (4C pav.), analizė parodė slopinimą. p53 ir kartu esanti per didelė ekspresija. Ląstelės, gautos iš organo-id, užkrėstų lenti-GH arba tuščiu vektoriumi (lenti-V), pulsuotu bromodeoksiuridinu (BrdU), parodė p53 slopinimą, po kurio sekė nedidelis, bet reikšmingai padidintas BrdU įsijungimas, kaip nustatyta fluorescenciniu būdu suaktyvintu ląstelių rūšiavimu (FACS) (pav. S3A). Priešingai, dėl GH slopinimo lentivirusu, išreiškiančiu mažą plaukų segtuką GH (GH), sumažėjo kolonijų susidarymas ir kolonijų dydis NCC (S3B ir S3C paveikslai), o tai rodo, kad npGH veiksmai yra palankūs literatūrai.

Paracrine GH poveikis žmogaus gaubtinės žarnos mikroschemai Norėdami įvertinti parakrininį npGH poveikį žarnyno gleivinės epitelio ląstelėms, kartu kultivavome UNCF, užkrėstą lenti-GH ir gaubtinės žarnos mikroskysčių mikrofluidiniais prietaisais (Kasendra ir kt., 2020), įsėtus sveiką storąją žarną. organoidinės kilmės epitelio ląstelės 8 dienas. Vietinė GH sekrecija iš hNCF į terpę buvo patvirtinta ELISA metodu (338 ng/mL/1 × 10 laipsnių ląstelės).5-Etinil-2'-deoksiuridinas (EdU） (20 μM) buvo pridėtas 7 dieną). lustai buvo fiksuoti po 24 valandų ir nudažyti EdU ir H2AX, o EdU plius branduoliai buvo suskaičiuoti epitelio ląstelėse. Atskiras čipsų rinkinys pasėtas

su epitelio ląstelėmis buvo naudojamas p53/p21 įvertinti Western blot metodu. Padidėjo lustų epitelio ląstelių proliferacija (p<0.05), likely="" due="" to="" decreased="" p53="" and="" p21="" (figures="" 4d="" and="" 4e).="" moreover,="" dna="" damage="" accumulation="" was="" evident,="" with="" increased="" numbers="" of="" cells="" expressing="" γh2ax="" （p=""><0.01） （figure="">

Autokrininis / parakrininis GH slopina DDR

ATM suaktyvinimas pažeidus DNR fosforilina H2AX, kuris žymi pažeistas DNR vietas, kad suaktyvintų DDR ir skatintų taisymą (Turinetto ir Giachino, 2015). ATM taip pat fosforilina p53, dar labiau sustiprindamas DNR atstatymą (Blackford ir Jackson 2017). hNCC, taip pat organoiduose, užkrėstuose pIRES2-ZsGreen1hGH arba lęšių GH, per didelis GH ekspresija slopino ATM ir DNR baltymų kinazės (PK)cs fosforilinimą, kurie abu dalyvauja DNR atstatyme (Blackford ir Jackson). 2017) ir sumažėjęs tikslinio baltymo p53 fosforilinimas (5A-5C pav.).

Tip60 histono acetilazė aktyvuoja ATM (Jackson ir Bartek, 2009) ir yra neigiamai reguliuojama TRIM29 (Sho ir kt., 2011; Sun ir kt., 2005). Pastebėjome, kad per didelė GH ekspresija NCC ir organoiduose taip pat sukėlė TRIM29 indukciją, kuri savo ruožtu slopino Tip60 (5A-5C pav.). Panašūs rezultatai buvo pastebėti antroje NCC linijoje praėjus 48 valandoms po nukleofekcijos su GH ekspresuojančia plazmide ir praėjus 6 dienoms po užsikrėtimo lenti-GH (S4A ir S4B paveikslai).

Autokrininis / parakrininis GH susilpnina DNR taisymą

Toliau išmatavome poveikį DSB taisymo mechanizmams, ypač į klaidas linkusį nehomologinį galų sujungimą (NHEJ) (Jackson ir Bartek, 2009) ir klaidoms atsparią homologinę rekombinaciją (HR) (Beucher ir kt., 2009). Blackford ir Jackson, 2017; Chapman ir kt., 2012). Mes nukleofektavome NCC, stabiliai ekspresuojančias NHEJ ir HR reporterių kasetes su pcDNA3.{8}}žmogaus GH1 (hGH1) plazmidėmis, indukavome DSB bendrai transfekuodami su plazmide, koduojančia I-Excel endonukleazę, ir išmatavome DSB taisymo reporterių pakartotinį prisijungimą. Transfekcijos efektyvumas buvo kontroliuojamas kartu transfekuojant su plazmide, koduojančia DsRed (Seluanov ir kt., 2010). NHEJ efektyvumas po pcDNA3.{16}}hGH1 nukleofekcijos buvo 0.{19}}.83 ir sumažėjo 48 val.<0.05)(figure5d), and="" hr,while="" low(0.05),="" consistent="" with="" other="" reports="" (chitnis="" et="" al,2014;gatei="" et="" al.,2011),showed="" consistently="" decreased="" efficiency="" by="" up="" to="" 38.7%±3.5%="" (n="4" independent=""><0.05) at="" 72="">

Autokrininis / parakrininis GH padidina nepataisomą DNR pažeidimą

Nagrinėdami, ar npGH padidina DNR pažeidimą, pastebėjome, kad NCC ir organoidai, stabiliai transfekuoti lenti-GH, parodė padidėjusį endogeninį nepataisytą DNR pažeidimą, išmatuotą Comet testu (p< 0.05)="" (lee="" and="" paull,="" 2007)(figures="" 5e="" and="" 5f).="" levels="" of="" unrepaired="" dna="" were="" also="" markedly="" increased="" in="" a="" second="" ncc="" line="" in="" cells="" nucleofected="" with="" a="" plasmid="" expressing="" gh="" or="" infected="" with="" lenti-gh="" (figures="" s4c="" and="" s4d).="" overall,="" these="" results="" show="" that="" npgh="" is="" induced="" in="" response="" to="" dna="" damage="" and="" enhances="" dna="" damage="" accumulation="" by="" interfering="" with="" both="" ddr="" and="" dna="" repair="">

GH yra indukuojamas pasenusiuose 3D žmogaus žarnyno organoiduose ir susilpnina DDR

Pastebėjus padidėjusią GH ekspresiją ir DNR pažeidimus senų žmogaus gaubtinės žarnos mėginiuose, mes „sendiname“ organinius ID, sukurtus iš trijų nepriklausomų iPSC linijų, kad apibendrintume senstančio žmogaus audinio modelį. Šiuos organoidus sudaro enterocitai, taurelės ląstelės, Paneth ląstelės ir enteroendokrininės ląstelės ir jie išreiškia uodeginio tipo homeoboksą 2 (CDX2) (Barrett ir kt., 2014; Gao ir kt., 2009; Workman ir kt., 2017). Dvi iš trijų iPSC linijų (1 ir 3 eilutės) buvo gautos iš vyresnių nei 60 metų asmenų, o trečioji iPSC linija (2 eilutė) buvo gauta iš 30- metų amžiaus asmens fibroblastų. Organoidai, sukurti iš 1 ir 3 linijų, buvo auginami iki 2 mėnesių, tada ląstelių proliferacija žymiai sulėtėjo. Priešingai, organoidai, sukurti iš 2 linijos, kultūroje stipriai dauginosi iki 4 mėnesių. Ląstelių senėjimą patvirtino visose 3 linijose padidėjęs p16, taip pat sumažėjęs telomerų ilgis (p<0.05)(figures 6a="" and="" 6b).="" in="" aged="" organoids,="" we="" also="" found="" increased="" senescence-associated="" β-galactosidase="" (sa-β-galactosidase)="" activity,="" which="" has="" been="" shown="" to="" increase="" with="" age="" (kurz="" et="" al.,="" 2000;="" lee="" et="" al.,="" 2006),="" as="" well="" as="" increased="" β-galactosidase="" protein="" expression,="" which="" correlates="" with="" sa-β-galactosidase="" enzymatic="" activity(figures="" 6a="" and="">

Kadangi atrodo, kad šios in vitro organoidinės savybės tiksliai apibendrina ląstelių pokyčius, atitinkančius senstantį žmogaus audinį (Baker ir kt., 2011; Lieut al., 2019; Lopez-Otin ir kt., 2013), naudojome šį metodą. modelis, skirtas toliau tirti signalizacijos mechanizmus, kuriais grindžiamas žmogaus gaubtinės žarnos epitelio senėjimas. 1 eilutėje GH mRNR lygis buvo sukeltas po 1 mėnesio kultūroje ir toliau padidėjo po 2 mėnesių (p < 0,05)="" (6c="" pav.),="" o="" tai="" atitinka="" žymiai="" padidėjusį="" npgh,="" pastebėtą="" pasenusiuose="" organoiduose="" tiek="" western="" blot,="" tiek="" imunohistochemijos="" (ihc)="" tyrime.="" (6d,="" 6e="" ir="" s5b="" pav.).="" yh2ax="" taip="" pat="" buvo="" stipriai="" sukeltas="" ilgai="" trunkant="" kultūrai,="" o="" tai="" rodo="" susikaupusį="" endogeninį="" dnr="" pažeidimą="" senstant="" in="" vitro.="" remiantis="" rezultatais,="" rodančiais="" nuslopintą="" p53="" ncc="" ir="" organoidus,="" transfekuotus="" gh="" (4a-4c="" pav.),="" 1="" ir="" 2="" auginimo="" mėnesius="" stebėjome="" p53="" slopinimą,="" atitinkantį="" padidėjusį="" npgh="" (6e="" ir="" s5b="" pav.).="" panašūs="" rezultatai="" (="" a="" ir="" b)="" western="" blot="" (a)="" ancc,="" hncf="" ir="" hct116="" ląstelių="" ir="" (b)="" organoidų.="" ląstelės="" buvo="" apdorotos="" nurodytomis="" etopozido="" dozėmis="" ir="" analizuojamos="" po="" 24="" valandų.="" organoidai="" buvo="" apdoroti="" 3="" um="" etopozidu="">

(C) NCC, 24 valandas užkrėstas GH siRNR (siGH RNR) arba maišymo RNR (Scr RNR), kaip kontrolė, buvo apdorotas nurodytomis etopozido (Etop) dozėmis ir analizuojamas po 24 valandų. „ImageJ“ Western blotų kiekybinis įvertinimas pavaizduotas S1 paveiksle.

(D) Reprezentatyvus NCC vaizdas, apdorotas 20 μM etopozidu 24 valandas. GH, raudona; yH2AX, žalias; faloidinas, pilkas; DAPI, mėlyna. Ryškiai žalias branduolys rodo apoptozę. Mastelio juosta, 20 um. Kontrolinės, neapdorotos ląstelės.

(E) GH Western blot ANCC ir organoidų, apdorotų atitinkamai 20 arba 5 uM etopozidu, auginimo terpėje. Terpė buvo surinkta iš karščio praėjus 8 ir 24 val., o iš organoidų – po apdorojimo 4-48 val. Ponceau buvo naudojamas kaip pakrovimo kontrolė. Rodomi reprezentatyvūs blotai iš mažiausiai 3 nepriklausomų eksperimentų.

buvo gauti kultivuojant organoidus, gautus iš iPSC 2 ir 3 linijų, atitinkamai 4 ir 2 mėnesius (S6A-S6D paveikslai).

Be to, padidėjęs npGH senstuose organoiduose buvo susijęs su susilpnėjusiu DDR, slopintu tiek ATM, tiek DNR-PKcs fosforilinimu ir mažesniu fosforilinto p53 lygiu (6E ir S5B paveikslai). Šie rezultatai rodo, kad slopinamas DDR aktyvumas sukelia sukauptą nepataisytą DNR pažeidimą, ką taip pat rodo yH2AX indukcija (6E ir S5B paveikslai). Po 2 mėnesių kultivavimo, pasenę organoidai, užkrėsti GH shRNR, parodė padidėjusį p53 (6F ir S7A paveikslai) ir sumažėjusį DNR pažeidimą, išmatuotą Comet testu (p<0.01)(figure 6g),="" indicating="" a="" requirement="" for="" npgh="" in="" age-related="" dna="" damage="" accumulation="" in="" this="">

GH signalizacijos trūkumas susilpnina in vivo gaubtinės žarnos DNR pažeidimus senstančiose pelėse

Norėdami patvirtinti rezultatus, gautus naudojant senus organoidus, in vivo ištyrėme senas WT ir GHR{0}} peles. Storosios žarnos DNR pažeidimas žymiai padidėjo senoms (24-mėn.), palyginti su jaunoms (3-mėn.) WT pelėms (p.<0.01), but,="" strikingly,="" was="" not="" increased="" in="" aged="" ghr-mice="" (figures="" 7a="" and="" s7b),="" likely="" due="" to="" p53="" in-duction.="" we="" also="" generated="" transgenic="" mice="" with="" colon-specific="" ghr="" excision="" (car1-cre/ghr"loxmox,="" ghrcolko)(figure="" s7d).="" control="" mice="" were="" derived="" from="" the="" same="" breeding,="" but="" they="" did="" not="" harbor="" the="" cre="" enzyme.="" colon="" dna="" damage="" was="" much="" reduced="" in="" 20-month-old="" male="" ghrcolko="" mice="" with="" ghr="" excision="" compared="" to="" control="" mice,="" but="" not="" in="" the="" small="" intestine="" with="" intact="" ghr(figure="" 7d).="" thus,="" it="" appears="" that="" dna="" is="" repaired="" more="" efficiently="" in="" mice="" devoid="" of="" gh="" signaling,="" likely="" due="" to="" the="" higher="" colon="" p53="" expression="" we="" observed="" in="" both="" ghr-/-and="" in="" ghrcolko="" animals(figures="" 7b,7c,="" 7e,="" s7c,="" and="" s7e).="" these="" in="" vivo="" results="" buttress="" our="" hypothesis="" that="" npgh="" en-hances="" age-associated="" colon="" dna="" damage="">

DISKUSIJA

Čia parodome, kad npGH didėja su amžiumi žmogaus gaubtinės žarnos audinyje ir 3D žmogaus žarnyno organoiduose. Mes demonstruojame keletą įrodymų, kad senyvo žmogaus gaubtinės žarnos audinyje npGH sukelia DNR pažeidimas, kaip pastebėta žmonių modeliuose, įskaitant epitelio nešvarias ląsteles, normalius gaubtinės žarnos fibroblastus, organoidus ir gaubtinės žarnos vėžio audinį pacientams, kuriems taikoma DNR pažeidžianti terapija. ; mes taip pat parodome panašius rezultatus in vivo pelių, turinčių aktyvuotą DDR, dvitaškiuose.

Naudodami 3D žmogaus žarnyno organoidus, stebėjome padidėjusį p16, senėjimą ir telomerų sutrumpėjimą, visa tai atitinka su amžiumi susijusius žmogaus audinių pokyčius (Baker ir kt., 2011; Liu ir kt., 2019; Lopez-Otin ir kt., 2013). ). Nepaisant organoidinio modelio apribojimų, mūsų rezultatai palaiko žarnyno organoidus kaip patikimą žmogaus apibendrinimą tiriant signalizacijos mechanizmus, kuriais grindžiami su amžiumi susiję storosios žarnos pokyčiai (Hu ir kt., 2018).

Mes nustatėme, kad vietinis npGH, veikdamas autokrininiu / parakrininiu būdu, slopina p53 ir padidina gretimų ląstelių proliferaciją. Sukeltas GH taip pat slopina DDR ir DNR atstatymą, dar labiau padidindamas DNR pažeidimų kaupimąsi. Rezultatai taip pat atitinka pastebėtą poveikį DNR pažeidimo kaupimuisi GH išskiriančiuose žmogaus hipofizės navikuose (Ben-Shlomo ir kt., 2020).

GH veikimas normaliame gaubtinės žarnos audinyje skatina proliferacinę aplinką, kuri gali lemti su amžiumi susijusį padidėjusį gaubtinės žarnos polipų skaičių, o tai rodo su amžiumi susijęs DNR pažeidimas ir chromosomų nestabilumas, kaip vyresnio amžiaus pacientų gaubtinės žarnos vėžio paplitimo veiksniai. 50 metų (Aunan ir kt., 2017). Su amžiumi susijęs padidėjęs DNR pažeidimas, kurį parodome čia, taip pat atitinka pranešimus, kad normalių gaubtinės žarnos mėginių yH2AX didėja tiesiškai su amžiumi (Risques ir kt., 2008). Mūsų pastebėtas ryškus yH2AX reguliavimas senėjančiuose organoiduose rodo DNR pažeidimų kaupimąsi, nes yH2AX žymi DNR pažeidimo vietas, kad pritrauktų DNR atkūrimo baltymus (Turinetto ir Giachino, 2015). Šie rezultatai gali atrodyti nesuderinami su faktu, kad senstančiose ląstelėse sukeltas GH slopina H2AX fosforilinimą. Tačiau mes interpretuojame šiuos stebėjimus, kad parodytume, kad GH sumažina DDR aktyvumą, mažindamas ATM fosforilinimą, o tai savo ruožtu sumažina (bet visiškai nepanaikina) pasroviui esančių baltymų, įskaitant H2AX, fosforilinimą. Kai DDR nėra tinkamai suaktyvintas, DNR atstatymas pasikeičia, tačiau yH2AX vis tiek kaupiasi, nes žymi nepataisytas DNR pažeidimo vietas. Taigi, yH2AX lygiai, stebimi senstant žmogaus audiniuose ir organoiduose, atspindi grynąjį DDR aktyvumo rezultatą ir nepataisytos DNR kiekį.

DNR pažeidimai gali kauptis senstančiame audinyje dėl bazinio ekscizijos atstatymo praradimo, greičiausiai dėl p53 atsako į DNR pažeidimą praradimo (Cabelof ir kt., 2006; Simon ir kt., 2009, 2012). Mūsų eksperimentų metu p53 sumažėjo gaubtinės žarnos ląstelėse ir organoiduose, išreiškiančiuose npGH, tai atitinka ankstesnius duomenis, kad GH slopina p53 (Chesnokova ir kt., 2016). Priešingai, pagyvenusios GHR-/- pelės, kurios yra atsparios vėžiui ir turi ilgesnę gyvenimo trukmę (Basu ir kt., 2018), taip pat gaubtinės žarnos specifinės GHRcolKO pelės pasižymi padidėjusia gaubtinės žarnos p53 ekspresija, kuri greičiausiai pagerina DNR atstatymą. Kadangi GH slopina p53 (Chesnokova ir kt., 2013), npGH indukcija gali sukelti vietinės mikroaplinkos pokyčius, atitinkančius su amžiumi susijusį sumažėjusį p53 (Feng ir kt., 2007; Goukassian ir kt., 2000). GH promotoriuje yra p53 surišimo vieta (Chesnokova ir kt., 2013), o DNR pažeidimo sukeltas p53 aktyvina GH ekspresiją (Chesnokova ir kt., 2013, 2019a). Taigi, mūsų rezultatai rodo, kad senuose organoiduose DNR pažeidimų kaupimasis sukelia npGH, o tai savo ruožtu sumažina p53.

Svarbu tai, kad npGH išskiriamas lokaliai iš DNR pažeistų ląstelių, todėl gali būti veiksmingas parakrininis išskiriamo GH poveikis kaimyninėms ląstelėms. Kartu kultivuodami GH ekspresuojančią hNCF su gaubtinės žarnos mikroschema, pastebėjome padidėjusį DNR pažeidimą ir proliferaciją bei sumažintą p53/p21 reguliavimą mikroschemose įterptose epitelio ląstelėse, veikiamose parakrininio fibroblastų kilmės poveikio. Šie rezultatai rodo, kad vietinis nesukeltas senėjimas žmogaus audiniuose keičia audinių mikroaplinką, nes slopina naviko slopinimo baltymus ir padidina epitelio proliferaciją bei DNR pažeidimus.

Rezultatai atitinka pastebėjimus, kad gydymas egzogeniniu GH padidina DJ-1 KO pelių proliferacinį pajėgumą, kolonijų susidarymą ir metastazes (Chien ir kt., 2016), ir įrodymus, kad GH indukcija žmogaus naviko ląstelėse yra susijusi su kelių vėžio formų progresavimas (Perry ir kt., 2017); tai atitinka mūsų rezultatus, rodančius mažiau kolonijų formavimosi ir mažesnio kolonijų dydžio su GH slopinimu.

DNR pažeidimo atstatymo būdai apsaugo nuo chromosomų nestabilumo, kuris skatina ląstelių transformaciją (Negrini ir kt., 2010). Pavyzdžiui, Tip60 suaktyvina bankomatą (Jackson ir Bartek, 2009), o ATM, centrinis DDR reguliatorius, fosforilina ir stabilizuoja p53. Senstančios ląstelės pasižymi sumažėjusiu ATM ir p53 slopinimu, taip pat DNR atstatymo disreguliavimu ir vėlesniais nepataisomais DNR pažeidimais (Lan ir kt., 2019). Taigi storosios žarnos ląstelėse DNR pažeidimai kaupiasi su amžiumi (Risques ir kt., 2008; Schu-macher ir kt., 2008), bent jau iš dalies dėl mažėjančio DDR efektyvumo (Jackson ir Bartek, 2009) ir slopinto p53. atsakas į y-švitinimą senstančiose pelėse buvo siejamas su su amžiumi susijusiu p53-stabilizuojančio ATM sumažėjimu (Feng ir kt., 2007). Mūsų eksperimentų metu DNR pažeidimas taip pat slopino Tip60, o tai greičiausiai paskatino. sumažėjusiam DNR atstatymui, kaip rodo atitinkamai susilpnėjęs ATM ir p53 fosforilinimas. Šie rezultatai rodo, kad vietinė npGH ekspresija gali prisidėti prie su amžiumi susijusių nereguliuojamų DDR ir DNR atstatymo. Seniems organoidams GH indukcija susilpnino DDR, o GH slopinimas suaktyvino DDR, kaip rodo sumažėjęs DNR pažeidimas. Šiuos rezultatus patvirtina mūsų ankstesni stebėjimai, kad blokuojant GH signalizaciją ANCC sumažėjo DNR pažeidimas (Chesnokova ir kt., 2019a). Be to, parodome, kad gaubtinės žarnos DNR pažeidimai nesikaupia į gaubtinę žarną nukreiptose GHRcolKO pelėse, turinčiose iškirptą GHR, tačiau ji kaupiasi plonojoje žarnoje, kur GHR buvo nepažeista. Šie rezultatai, kartu su mūsų parodymu, kad senos GHR{20}}pelės nekaupia gaubtinės žarnos DNR pažeidimų, in vivo patvirtina hipotezę, kad vietinė npGH indukcija su amžiumi gali padaryti ląsteles jautrias transformacijai ir galbūt taip pat prisidėti prie atsparumo vėžio gydymui, nes buvo pasiūlyta (Basu ir Kopchick, 2019).

Čia pateikti rezultatai taip pat padidina galimybę, kad GH poveikį gali lemti į insuliną panašus augimo faktorius 1 (IGF1). Skirtingai nuo GH, IGF1 signalizacija suaktyvina DNR atstatymą ne navikinėse ir navikinėse ląstelėse (Chesnokova ir Melmed, 2020; Chitnis ir kt., 2014; Turney ir kt., 2012), ir mes parodėme, kad GH slopina p53 ir DNR indukciją. pažeidimai atsiranda nepriklausomai nuo IGF1 normaliame gaubtinės žarnos audinyje (Ches-nokova ir kt., 2019a, 2019b). Tačiau ląstelėse ir audiniuose, kuriuose GH aktyvuoja IGF1, pastarasis augimo faktorius taip pat gali signalizuoti ląstelėms būdingu būdu, kad neutralizuotų GH poveikį genomo stabilumui.

Išvados rodo, kad npGH, sukeltas senstančiame gaubtinės žarnos audinyje, reaguojant į sukauptą DNR pažeidimą, palengvina tolesnį DNR pažeidimą ir, atrodo, yra neigiamas DNR pažeidimo atstatymo veiksnys. Šių išvadų ekstrapoliacija suteikia platformą kelioms galimoms klinikinėms reikmėms. Kadangi DNR pažeidimų kaupimasis yra būdingas su amžiumi susijusių ligų požymis, GH signalų nukreipimas į autokrininės / parakrininės sistemos blokavimą gali būti naudingas siekiant užkirsti kelią su amžiumi susijusiems epitelio DNR pažeidimams ir galiausiai palengvinti su amžiumi susijusių epitelio patologijų progresavimą (Miman ir kt. ,2016) Toks požiūris taip pat gali būti naudingas vėžiu sergantiems pacientams, kuriems taikoma DNR pažeidžianti terapija, kurių epitelio lauko pokyčiai, kuriuos sukelia autokrininė / parakrininė, jokie veiksmai negali pažeisti normalaus kaimyninio audinio. Šiuo atžvilgiu GH signalizacijos sutrikdymas naudojant patvirtintą GHR antagonistą (List ir kt., 2011; Trainer ir kt., 2000) gali duoti klinikinės naudos. Svarbu tai, kad žmogaus GH buvo netinkamai reklamuojamas kaip nepatvirtintas senėjimą stabdantis ir jėgą stiprinantis gydymas (Giordano ir kt., 2008; Holt ir Ho, 2019; Medeiros ir Siegel Watkins, 2018; Melmed, 2019). Atsižvelgiant į žalingą parakrininį npGH poveikį, apie kurį pranešame čia, ilgalaikis netinkamas GH, kaip senėjimą stabdančio eliksyro, vartojimas gali sukelti GHR signalizaciją ir kelti pavojų epitelio ląstelių DNR pažeidimui, taip pat galimam okultinių proliferacinių pažeidimų suaktyvėjimui.

Šis straipsnis ištrauktas iš Cell Reports 37, 110068, 2021 m. gruodžio 14 d., ª 2021 Autorius (-ai). 1 Tai yra atviros prieigos straipsnis pagal CC BY-NC-ND licenciją (http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/)