Antioksidacinių fermentų, glutationo peroksidazės, tiolio peroksidazės ir katalazės melanino spalvą mažinantis aktyvumas

Kontaktas:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791

Gyeongchan Jeon¹· Chinhan Kim²· JK Min Cho²· Ee Taek Hwang³· Hyung Seo Hwang⁴· Jiho Min¹

Abstraktus

Melaninas yra svarbiausias veiksnys, lemiantis odos spalvą. Dedama daug mokslinių tyrimų, siekiant suskaidyti jau pagamintus melanino junginius odoje ir siekti grožio. Šiame tyrime buvo tiriamas trijų antioksidantų fermentų, glutationo peroksidazės (GPX), tiolio peroksidazės (TPX) ir katalazės, poveikis melanino spalvos mažinimui lizosomų frakcijoje. Melanino tirpalas buvo apdorotas fermentais ir vandenilio peroksidu, tada reagavo 48 valandas. GPX ir TPX nuspalvino melaniną, o tarp jų GPX buvo efektyvesnis, bet katalazė nebuvo veiksminga. GPX taip pat slopino melanino gamybą B16F10 melanomos ląstelėse. GPX, kurio yra beveik visuose mikroorganizmuose, atlieka svarbų vaidmenį ląstelių gynybos mechanizme reaktyviosiomis deguonies rūšimis. Be to, jis nebuvo citotoksiškas, bet buvo labai veiksmingas melanino spalvos pašalinimui. Todėl biologinėje ir mikrobiologinėje srityje jo panaudojimo galimybė odos balinimo kosmetikoje yra didelė.

Raktažodžiai Melaninas · Glutationo peroksidazė (GPX) · Tiolio peroksidazė (TPX) · Katalazė · B16F10 · Lizosoma

Cistanche yra odą balinantis ingredientas.

Įvadas

Švarus veidas yra vienas iš esminių šiuolaikinių žmonių grožio elementų, ypač azijiečiai entuziastingai vertina baltą odą. Melanino junginys yra svarbiausias veiksnys, lemiantis odos spalvą. Jis skiriasi nuo juodos arba rudos spalvos eumelanino ir feomelanino, kuris suteikia nuo rausvos iki raudonos spalvos [1]. Melanino junginys sintetinamas tirozino oksidacijos būdu melanocitų ląstelėse, kurios randamos baziniame epidermio sluoksnyje; o pagrindinis šio pigmento vaidmuo odoje yra apsaugoti dermą blokuojant žalingą ultravioletinę spinduliuotę [2, 3]. Tačiau jei odoje yra per daug melanino junginių, oda tampa tamsi ir nešvari ir gali sukelti hiperpigmentaciją, pavyzdžiui, melazmą [4].

Buvo atlikta daug tyrimų, susijusių su odos priežiūros kosmetika, kurios sprendžia šias problemas, tačiau dauguma šiuo metu sukurtų odą balinančių kosmetikos priemonių turi funkciją slopinti melanino sintezę per kelis mechanizmus, pavyzdžiui, blokuoja tirozino oksidaciją arba UV spindulius, kurie gali skatinti. melanino sintezė [5]. Šie produktai yra veiksmingi ilgą laiką ir nėra veiksmingi esant specifiniams simptomams, tokiems kaip hiperpigmentacija [6]. Šiuo metu tipiškas jau pagaminto melanino pašalinimo būdas yra gydymas lazeriu [7]. Jei bus sukurtos medžiagos, galinčios išspręsti šias problemas be tokių procedūrų, jos bus labai naudingos biologijos ir kosmetikos srityse.

Ankstesniuose tyrimuose bandėme rasti būdą, kaip panaikinti jau pagamintų melanino junginių spalvą. Buvo tyrimų ataskaitų apie lizosomų ir melanino koreliaciją. Labai tikėtina, kad diferencijuoti keratinocitai ypač suardo išorines melanosomas pagal pagrindines autofagijos funkcijas, kurios kontroliuoja ląstelių organelių kiekį, arba pašalina sugedusias organeles, tokias kaip peroksisomas [8]. Autofaginis kelias nuo citoplazmos iki lizosomų vaidina svarbų vaidmenį skaidant melanosomas žmogaus epidermalkeratinocituose [9]. Šie duomenys rodo, kad specifiniai lizosomų fermentai prisideda prie melanino skaidymo. Anksčiau mes nustatėme lizosomų frakcijoje esantį fermento melanino spalvą mažinantį aktyvumą, kompleksą, kuriame yra hidrolizatų, kurie skaido atliekas ir ląstelių šiukšles peroksisomose ir lizosomose [10, 11]. Šiame dokumente buvo tiriamas trijų pasirinktų fermentų, glutationo peroksidazės, tiolio peroksidazės, katalazės, poveikis lizosomų frakcijai, siekiant sumažinti melanino spalvą. Šios peroksidazės apsaugo nuo ląstelių pažeidimo, kurį sukelia reaktyviosios deguonies rūšys (ROS), ir yra visuose eukariotuose [12].

Reaktyviosios deguonies rūšys (ROS) susidaro kaip natūralus normalaus deguonies metabolizmo ląstelėse produktas ir gali padidėti dėl aplinkos streso. Labai sukurta ROS gali pažeisti ląsteles. Žalingas ROS poveikis ląstelei yra toks [12, 13]: DNR arbaRNR pažeidimas, polinesočiųjų riebalų rūgščių oksidacijos lipiduose, aminorūgščių oksidacijos baltymuose ir specifinių fermentų oksidacinis dezaktyvavimas oksiduojant kofaktorius. Ląstelės neutralizuojasi. ROS antioksidacinė sistema, kad būtų išvengta tokių audinių pažeidimų. Šioje sistemoje superoksido anijonas, susidarantis metabolizmo metu, yra labai niokojantis; nors superoksido dismutazė (SOD) jį paverčia vandenilio peroksidu, vandenilio peroksidas vis tiek reaguoja. Vandenilio peroksidas katalazės paverčiamas H2O ir sunaudojamas gaminant glutationisulfidą (GSSG) iš glutationo katalizuojant GPX. TPX veikia panašiai kaip GPX [13].

Šiame tyrime buvo tiriamas trijų antioksidantų fermentų – GPX, TPX ir katalazės – melanino spalvą mažinantis poveikis. Dėl to GPX ir TPX efektyviai sumažino melanino spalvą. Tarp jų GPX neturėjo citotoksiškumo esant optimaliai melanino spalvą mažinančio aktyvumo koncentracijai ir veiksmingai slopino melanino sintezę. Todėl jis pateikia įrodymų, kad GPX vaidina svarbų vaidmenį lizosomų frakcijos melanino spalvos pašalinimo mechanizme, ne tik antioksidacinį aktyvumą, ir siūlo naujos balinančios kosmetikos priemonės, kaip vieno fermento, potencialą.

Medžiagos ir metodai

Peroksidazės ir peroksidazės aktyvumo tyrimas

Trijų peroksidazių (glutationo peroksidazės, tiolio peroksidazės ir katalazės) koncentracija buvo nustatyta naudojant tyrimo rinkinį (Peroxidase assay kit, D2PD-100, QuantiChromTM), įsigytą iš Bioassay Systems. Glutationo peroksidazė 2 (GPX2, NBP1-78,824, Novus) ir tiolio peroksidazė (TPX,NBP1-78,805, Novus) buvo įsigyta iš Novus, o katalazė (9001-05-2, Sigma-Aldrich) ) buvo įsigytas iš Sigma-Aldrich.

Šiame tyrimo rinkinyje naudojamas H2O2 ir elektronų donoro dažiklis, kuris peroksidazės metu sudaro rezorufiną. Tyrimas buvo atliktas kambario temperatūroje (RT), o spalvos intensyvumas buvo matuojamas ties 57 0 nm. Peroksidazės buvo reaguojamos su elektronų donoro dažais su 0, 6% vandenilio peroksidu 10 minučių kambario temperatūroje. Po reakcijos buvo pridėtas sustabdymo reagentas, o mėginio absorbcija buvo išmatuota mikroplokštelės spektrofotometrija. Veikla buvo apskaičiuota taip:

Peroksidazės aktyvumas=RSAMPLE −RBLANK × [Resorufin](𝜇M) × Reaction Vol(𝜇L)RRESORUFIN −RH2 O t(min) Mėginio tūris(𝜇L)

(U/L). Vienas fermento vienetas (U) katalizuoja 1 μmolio resorufino susidarymą per minutę tyrimo sąlygomis. Čia RSAMPLE, RBLANK, RRESORUFIN ir RH2O yra atitinkamai mėginio, mėginio ruošinio, resorufino ir vandens absorbcija; ir n yra mėginio praskiedimo koeficientas. Šio tyrimo [Resorufin] yra 50 μM. Reakcijos tūris yra 100 μL, o mėginio tūris šiame tyrime yra 10 μL.

Melanino spalvos pašalinimas naudojant glutationo peroksidazę (GPX), tiolio peroksidazę (TPX) ir katalazę

Melanino tirpale yra {{0}},1 mM PBS (fosfatiniu buferiniu tirpalu, pH: 7,0) ir melanino milteliais (Synthetic, Sigma), kurie buvo gauti oksiduojant tiroziną vandenilio peroksidu. Melanino kiekis buvo matuojamas pagal absorbciją esant 450 nm. Norint nustatyti melanino koncentraciją, buvo sudaryta standartinė kreivė iš autentiško sintetinio melanino standarto (R2=0.999, duomenys nerodomi).

Norint patikrinti melanino spalvos praradimą, 100 ppm melanino tirpalas, kuriame yra (50–1000) μU/L peroksidazės (GPX, TPX, katalazė) su 1 mM vandenilio peroksidu, buvo reaguojama kambario temperatūroje ir matuojamas kasdien. Melanino spalvos praradimo vertė buvo nustatyta iš pradinės vertės atėmus melanino koncentraciją po reakcijos.

Cistanche slopina melanino sintezę.

Ląstelių kultūros

B16F10 pelių melanomos ląstelės (KCLB 80008) buvo įsigytos iš Korėjos ląstelių linijos banko (KCLB, Seulas, Korėja). Ląstelės buvo kultivuojamos Dulbecco modifikuotoje erelio terpėje (DMEM), kurioje yra 4500 mg/l gliukozės, 4 mM l-glutamino, 1 mM natrio piruvato, į kurį buvo pridėta 10 procentų galvijų vaisiaus serumo (FBS), 20 mM HEPES, 1 procentas penicilino, ir ląstelės buvo inkubuojamos drėgnoje aplinkoje, kurioje yra 5 procentai CO2 37 laipsnių temperatūroje. Terpė buvo keičiama kas 2 dienas (d), o ląstelės buvo surinktos naudojant tripsino / EDTA tirpalą.

Ląstelių gyvybingumo tyrimas (MTT tyrimas)

Toksinis glutationo peroksidazės poveikis B16F10 melanomos ląstelėms buvo patvirtintas MTT tyrimu – bendruoju metodu, naudojamu mėginio poveikiui prilipusios ląstelės gyvybingumui nustatyti. Šiam tyrimui naudojamas 3-(4,5-dimetil-tiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolio bromidas (MTT), kurį mitochondrijos gali redukuoti į formazaną fermentas gyvybingose ​​ląstelėse. 3 × 103 ląstelės buvo pasėtos į 96-šulinėlių plokštelės šulinėlį ir inkubuojamos 24 valandas. Tada į kiekvieną duobutę buvo pridėtas mėginys ir inkubuojamas 72 valandas. Po to terpė buvo pakeista į tokią, kurioje yra 0, 5 mg / ml MTT, ir inkubuojama 2 valandas. Tada MTT dažų reagentas buvo pašalintas, o susidaręs formazanas ištirpintas DMSO 30 min. Galiausiai formazano koncentracijos buvo išmatuotos esant 570 nm, naudojant mikroplokštelės spektrofotometriją. Ląstelių gyvybingumas buvo apskaičiuotas taip: ląstelių gyvybingumas (procentai )=(mėginys – tuščias)/(kontrolė – tuščias)*100.

cistanche hindi kalba

Melanino kiekio tyrimas

3 × 105 B16F10 ląstelės buvo pasėtos į šulinėlį į 6-šulinėlių plokštelę ir inkubuojamos 24 valandas, kad priliptų. Kiekvieno šulinėlio terpė buvo pakeista terpe, kurioje yra įvairios fermento koncentracijos ir 10 nM -MSH, po to inkubuojama 72 valandas. Po to visi šuliniai buvo plaunami DPBS buferiu ir surenkami naudojant 0, 5% tripsino / EDTA tirpalą. Ląstelių granulės, gautos centrifuguojant, buvo lizuojamos 200 μL 1 N NaOH, turinčio 10 procentų DMSO, 1 valandą 80 laipsnių temperatūroje. Galiausiai, lizuoto melanino kiekis buvo matuojamas pagal absorbciją esant 450 nm. Fermento melanino gamybos slopinimo efektyvumas buvo nustatytas lyginant su teigiama kontrole, naudojant 100 mg/mL arbutino.

Rezultatai

Glutationo peroksidazės (GPX), tiolio peroksidazės (TPX) ir katalazės peroksidazės aktyvumas

Šis tyrimas yra išplėstinis lizosomų frakcijų apdorojimo pritaikymas melanino junginių spalvos pašalinimui in vitro ir in vivo. Ankstesniame tyrime nustatėme, kad iš Hela ląstelių, S. cerevisiae, vištų kiaušinių išskirta lizosominė frakcija mažina melanino spalvą irmelanino spalvos pašalinimo efektyvumas buvo susijęs su lizosomų frakcijos, nesusijusios su membrana, mikrosomų frakcijos, įskaitant lizosomas ir peroksisomas, peroksidazės aktyvumu. Norint patvirtinti peroksidazių melanino spalvą mažinantį poveikį, buvo pasirinktos trys peroksidazės: glutationo peroksidazė (GPX), tiolio peroksidazė (TPX) ir katalazė. Šie fermentai atlieka svarbų vaidmenį mažinant oksidacinį stresą, kurį sukelia reaktyvios deguonies rūšys ląstelėse [14].

Šių fermentų aktyvumas buvo nustatytas tyrimo rinkiniu (Peroxidase assay kit, D2PD-100, QuantiChrom™). Šis metodas buvo pagrįstas elektronų donorų dažų, kurie peroksidazės reakcijos metu susidaro rausva spalva, oksidacija [15]. Peroksidazės aktyvumas buvo išreikštas naudojant šiuos vienetus: 1 vienetas=1 U=1 µmolio resorufino susidarymas per minutę tyrimo sąlygomis. 1 lentelėje apibendrinamas trijų peroksidazių, GPX, TPX ir katalazės, aktyvumas ir koncentracija.

Glutationo peroksidazės (GPX), tiolio peroksidazės (TPX) ir katalazės melanino spalvos pašalinimo aktyvumas

Siekiant patvirtinti peroksidazių melanino spalvą mažinantį poveikį, 100 ppm melanino tirpalas buvo apdorotas 1 mM vandenilio peroksidu ir (50–1000) µU/L kiekvienos peroksidazės koncentracija. Mėginiai buvo reaguojami 2 dienas kambario temperatūroje, tada lyginami su pradine koncentracija. 1 paveiksle parodytas melanino sumažėjimas po 48 val. 1 paveiksle parodytas įrodymas, kad TPX ir GPX turi melanino spalvos pašalinimo aktyvumą. Katalazė neturėjo įtakos melanino spalvos mažinimui (1a pav.). TPX buvo veiksmingas melanino junginių spalvos pašalinimui, o efektyvumas buvo geriausias, kai buvo apdorota 1 µU/mL koncentracija (1b pav.). GPX taip pat pasižymėjo melanino spalvos mažinimo aktyvumu, kuris buvo geriausias, kai koncentracija buvo 0,2 µU/mL, ir palaipsniui mažėjo esant didesnei koncentracijai (1c pav.). Ši vertė reiškia 175 procentais pagerėjusį melanino spalvos sumažėjimą, palyginti su kontroline medžiaga, apdorota tik vandenilio peroksidu. GPX buvo efektyvesnis koncentracijos ir peroksidazės aktyvumo požiūriu, palyginti su TPX. 0,2 µU/mL GPX ir 1 mM vandenilio peroksido apdorojimas ikimelanino tirpalas per 4 dienas pašalino spalvą 13 procentų 100 ppm melanino (1 pav.).2). Tačiau nei GPX, nei TPX neparodė jokio spalvų mažinimo efekto, kai nebuvo vandenilio peroksido (duomenys nerodomi).

1 lentelė Specifiniai fermentų, glutationo peroksidazės 2, tiolio peroksidazės ir katalazės duomenys

Glutationo peroksidazės (GPX) ir H2O2 poveikis B16F10 ląstelių gyvybingumui

GPX poveikis B16F10 melanomos ląstelių gyvybingumui buvo patvirtintas MTT tyrimu prieš melanino sintezės slopinimo testą. Norint rasti tinkamą gydyti vandenilio peroksido koncentraciją, citotoksiškumas buvo įvertintas apdorojant vandenilio peroksidu 72 valandas skirtingomis koncentracijomis. Esant koncentracijai 0,1 mM, H2O2 neturėjo toksinio poveikio ląstelėms 72 valandas, o esant didesnei nei 1 mM koncentracijai, buvo pastebėtas didelis toksiškumas. (3a pav.). Tada GPX poveikis ląstelių išgyvenimui buvo įvertintas naudojant 0,1 mM vandenilio peroksido, kuris nebuvo citotoksinis. GPX neturėjo citotoksinio poveikio B16F10 ląstelėms, kurių koncentracija mažesnė nei 0,5 μU/mL, o tai buvo veiksminga atliekant melanino spalvos pašalinimo tyrimus (3b pav.).

1 pavSantykinis melanino spalvos sumažėjimas, palyginti su apdorojimu tik vandenilio peroksidu.

Glutationo peroksidazės (GPX) ir H2O2 poveikis melanino sintezei B16F10 melanomos ląstelėse

Ištyrėme GPX, kuris buvo efektyviausias melanino spalvos pašalinimui, poveikį melanino sintezei melanocituose. 4 paveiksle parodytas melanino kiekis B16F10melanomos ląstelėse, apdorotose kiekvienu mėginiu 72 valandas. Gydymas 0,05 μU/mL GPX ir 0,1 mM H2O2 sukėlė didžiausią melanogenezės slopinimą 43 proc., palyginti su kontroliniu (tik gydymas -MSH). Tai buvo 153 procentais daugiau nei teigiama kontrolė (gydymas arbutinu ir -MSH) ir 22 procentais didesnis nei vandenilio peroksido be fermento, o gydant GPX neparodė dramatiško melanino kiekio sumažėjimo, kai nebuvo vandenilio peroksido, taip pat patvirtina šią nuomonę. (duomenys neskelbtini). Dėl to GPX slopino melanino junginių gamybą, tačiau melanino sintezę ląstelėse labiau paveikė GPX vandenilio peroksidetanas.

Diskusija

Šiame tyrime mūsų mokslininkai nustatė optimalią GPX, TPX ir katalazės, antioksidantų, mažinančių oksidacinį stresą ląstelėse, koncentraciją ir poveikį melanino junginių spalvos praradimui. Dėl ekstraląstelinių eksperimentų, kuriuose naudojami susintetinti melanino junginiai, GPX ir TPX turi melanino spalvą mažinantį poveikį, o Catalasedo – ne. Yra pranešimų, kad kai kurių grybų ligniną skaidantys fermentai, pvz., lakkazė, lignino peroksidazė, gali suskaidyti melaniną esant vandenilio peroksidui [16–18]. Šio tyrimo metu buvo patvirtinta, kad antioksidantų fermentai, kurių yra visuose eukariotuose ir nėra lignino skaidančių fermentų, turi melaniną mažinantį poveikį. Nors GPX ir TPX taip pat gali sumažinti melanino spalvą esant vandenilio peroksidui, šie fermentai gali veikti kaip pagrindinis lizosominės frakcijos melanino spalvos pašalinimo mechanizmo komponentas.

GPX, kuris buvo veiksmingiausias mažinant melanino spalvą in vitro, buvo apdorotas B16F10 melanomos ląstelėmis, siekiant nustatyti jo poveikį melanino sintezei. B16F10 melanomos ląstelėse GPX nebuvo citotoksiškas esant koncentracijoms, kurios buvo veiksmingos melanino junginių spalvos pašalinimui, o kartu apdoroto vandenilio peroksido koncentracija buvo 0, 1 mM, be toksiškumo. Gydymas vandenilio peroksidu labai slopino melanino sintezę, o dirbant su GPX efektyvumas buvo geresnis, o vaisto priklausomybė nuo koncentracijos nebuvo. Kadangi vandenilio peroksidas greitai sunaudojamas fermentų, galima suprasti, kad kuo didesnė apdorojamo fermento koncentracija, tuo mažesnis melanino sintezės slopinimas vandenilio peroksidu. Tai, kad GPX gydymas neparodė dramatiško melanino sumažėjimo, kai nėra vandenilio peroksido, taip pat patvirtina šį požiūrį (duomenys nerodomi). Dėl to GPX slopino melanino junginių gamybą, tačiau melanino sintezę ląstelėse labiau paveikė GPX vandenilio peroksidetanas. Šie rezultatai rodo, kad antioksidaciniai fermentai indukuoja melanino skaidymą autofagijos mechanizmuose, kurie virškina melanosomas.

cistanche tabletės

Norėdami gauti daugiau informacijos, spustelėkite čia.

Išvada

Mūsų tyrimas rodo, kad glutationo peroksidazė (GPX) ir tiolio peroksidazė (TPX) prisideda prie melanino spalvos išnykimo, o GPX veiksmingai slopino melanino sintezę. Rezultatai patvirtina hipotezę, kad antioksidaciniai fermentai indukuoja melanino skaidymą autofagijos mechanizmuose, kurie virškina melanosomas. Norint padaryti galutinę išvadą, gali prireikti melanosomų virškinimo odos ląstelėse, keratinocituose ir melanocituose mechanizmo tyrimo.