Metforminas pagerina iš žmogaus riebalų gautų kamieninių ląstelių kamieną, sumažindamas moduliaciją

Prašau susisiektioscar.xiao@wecistanche.comDaugiau informacijos

Santrauka:Riebalinis audinys vaidina svarbų vaidmenį reguliuojant metabolinę homeostazę, kaupdamas riebalų perteklių ir apsaugodamas kitus organus nuo lipotoksiškumo. Senėjimas yra susijęs su centriniu riebalų persiskirstymu, kuris baigiasi insulinui jautrių poodinių audinių sumažėjimu ir insulinui atsparių visceralinių riebalų sankaupų padidėjimu. Riebalų kilmės kamieninės ląstelės (ASC) vaidina svarbų vaidmenį regeneruojant riebalinį audinį. Pagyvenę ASC rodo sumažėjusį kamieną ir regeneracinį potencialą dėl oksidacinio streso kaupimosi ir su mitochondrijų disfunkcija susijusių ląstelių pažeidimo. Metforminas yra gerai žinomas vaistas nuo diabeto, kuris parodė senėjimą stabdantį poveikį įvairiems organizmams ir gyvūnų modeliams. Šiame tyrime išanalizavome gydymo metforminu poveikį žmogaus ASC kamienui ląstelių kultūroje ir viso riebalinio audinio kultūros modeliuose. Mūsų rezultatai rodo, kad metforminas pagerina ASC kamieną, sumažindamas jų proliferacijos greitį ir adipocitų diferenciaciją. Ištyrę galimą pagrindinį mechanizmą, mes stebėjome mTOR ir ERK aktyvumo sumažėjimą metforminu gydomuose ASC. Be to, po gydymo metforminu stebėjome autofagijos aktyvumo padidėjimą. Darome išvadą, kad gydymas metforminu pagerina ASC kamieną, sumažindamas mTOR ir ERK signalizaciją bei sustiprindamas autofagiją. Būsimi in vivo gyvūnų modelių ir žmonių vertinimai atvers kelią klinikiniam šio nusistovėjusio vaisto pritaikymui, siekiant atgaivinti senų kamieninių ląstelių kamieną.

Norėdami sužinoti daugiau, spustelėkite čia

Raktiniai žodžiai:riebalinės kamieninės ląstelės; riebalinis audinys; kamieniškumas; diferenciacija; platinimas; metforminas;mTOR; ERK; autofagija

1. Įvadas

Riebalinis audinys yra dinamiškas organas, kuris atlieka svarbų homeostatinį vaidmenį reguliuojant maistinių medžiagų balansą, jautrumą insulinui ir imuninės sistemos moduliavimą. Riebalinis audinys atlieka šį vaidmenį kaupdamas ir oksiduodamas riebalų rūgščių perteklių, taip užkertant kelią steatozei ir lipotoksiškumui kituose organuose [1]. Su amžiumi susijęs atsparumas insulinui yra labiausiai paplitusi medžiagų apykaitos liga. Maždaug 25 procentai JAV gyventojų, vyresnių nei 65 metų, serga cukriniu diabetu, dėl to padidėja mirtingumas, pablogėja funkcinė būklė, padidėja hospitalizavimo rizika ir per didelė našta sveikatos ekonomikai [2]. Nors ryšys tarp diabeto ir nutukimo jau seniai pripažintas, ryšys tarp senėjimo ir 2 tipo diabeto tebėra sunkus [3]. Pirmasis pastebėjimas, susijęs su gliukozės tolerancijos mažėjimu su senėjimu, buvo atliktas 1921 m. [4]. Keli tyrimai nuo to laiko nustatė, kad sumažėjęs jautrumas insulinui yra pagrindinė su amžiumi susijusio gliukozės metabolizmo sutrikimo priežastis [5,6]. Remiantis anatomine lokalizacija, riebalinis audinys gali būti plačiai suskirstytas į du sandėlius: poodinius ir visceralinius riebalinius depus. Riebalinio audinio depo vieta ir funkcija yra svarbios jautrumo insulinui požiūriu; Pavyzdžiui, visceralinis depas yra atsparesnis, o poodinis depas yra jautresnis insulinui [7]. Su amžiumi susijęs laipsniškas poodinio riebalinio audinio tūrio mažėjimas sumažina gliukozės ir lipidų pasisavinimą, dėl to lipidų perteklius ir negimdinis lipidų nusėdimas raumenyse ir kepenyse, prisidedant prie atsparumo insulinui išsivystymo [8].

Riebalinis audinys susideda iš skirtingų ląstelių tipų. Fermentiškai virškinant riebalinį audinį kolagenaze, susidaro dvi pagrindinės frakcijos: adipocitų frakcija ir stromos kraujagyslių frakcija (SVF)[9]. SVF susideda iš riebalinių kamieninių ląstelių (ASC), limfocitų, endotelio ląstelių, pericitų ir fibroblastų [10]. ASC imuniniu fenotipiniu požiūriu apibrėžiami kaip mezenchiminės kilmės CD34 plius CD90 plius CD29 ir CD{7}}CD31 ląstelės, pasižyminčios trijų linijų diferenciacija į kaulus, kremzles ar riebalus [11,12]. Baltuosiuose riebaliniuose audiniuose šios ląstelės daugiausia yra kraujagyslių stromoje aplink mažas kraujagysles ir gali daugintis bei diferencijuotis į adipocitus[11]. Riebalų kilmės kamieninės ląstelės (ASC) vaidina svarbų vaidmenį regeneruojant riebalinį audinį, o jos dauginasi, atsinaujina ir diferencijuojasi. Senėjimas yra susijęs su šių kamieninių savybių praradimu ASC [13, 14]. Manoma, kad su amžiumi susijęs poodinių riebalų sankaupų dydžio sumažėjimas atsirado dėl pakitusios ASC replikacijos ir diferenciacijos[15-17]. Findeisen ir kt. rodo, kad senėjimo metu riebaliniame audinyje kaupiasi oksidacinis stresas, o tai neigiamai veikia diferenciacijos gebėjimą [15]; tačiau tikslus mechanizmas (-ai), lemiantis ASC kamieno praradimą, nėra suprantamas. Naujausi tyrimai parodė, kad sumažėjusi autofagija, didesnis mechaninis rapamicino (mTOR) kelio aktyvumo taikinys ir reaktyviųjų deguonies rūšių (ROS) kaupimasis yra susiję su stiebo praradimu ASC ir priešlaikine senėjimo indukcija ASC [18-20].

Cistanche gali kovoti su senėjimu

Metforminas yra vaistas nuo diabeto, dažniausiai vartojamas cukraus kiekiui kraujyje mažinti ir jautrumui insulinui pagerinti. Juo galima gydyti įvairius su senėjimu susijusius medžiagų apykaitos sutrikimus, tokius kaip širdies ir kraujagyslių ligos, vėžys ir pažinimo nuosmukis [21,22]. Metformino ilgaamžiškumą didinantis poveikis buvo įrodytas kirminams, pelėms ir žiurkėms apribojus mitybą, o tai imituoja adenozino monofosfato aktyvuotos proteinkinazės aktyvumo (AMPK) stimuliavimo poveikį[23]. Įvairūs tyrimai parodė, kad metforminas slopina žinduolių rapamicino (mTOR) taikinį [24,25]. AMPK-mTOR signalizacijos keliai konkrečiai reguliuoja ląstelių homeostazių savybes, tokias kaip autofagija, proliferacija, energijos metabolizmas ir baltymų sintezė [26]. Įrodyta, kad metforminas slopina proliferaciją, diferenciaciją ir uždegimą, mažina oksidacinį stresą ir mitochondrijų potencialą bei pagerina bendrą įvairių tipų suaugusiųjų kamieninių ląstelių kamieną [27, 28]. Metformino poveikis ASC metabolizmui ir kamienui in vitro ir in vivo nėra aiškus.

Šiame tyrime mes panaudojome 2D žmogaus ASC kultūrą ir viso žmogaus riebalinio audinio kultūros metodus, kad imituotume in vivo ląstelių organizaciją ir audinių mikroaplinką. Naudodami šiuos eksperimentinius modelius, ištyrėme gydymo metforminu poveikį ASC diferenciacijai, proliferacijai ir kamienui bei ištyrėme šiuose ląstelių procesuose dalyvaujančius molekulinius mechanizmus.

2. Medžiagos ir metodai

2.1.Donoro specifikacijos

Riebalinis audinys buvo paimtas iš penkių moterų, nesergančių diabetu, donorų, kurių amžius yra 39 ± 13 ir KMI diapazonas 27 ± 4, kuriems Pitsburgo universiteto medicinos centre (UPMC) buvo atliekamos pasirenkamos plastinės chirurgijos procedūros. Audinių paėmimo procedūrą patvirtino Pitsburgo universiteto Institucinė peržiūros taryba (IRB Nr. 0511186).

2.2. Žmogaus ASC išskyrimas ir auginimas

Riebalų pirmtakų ląstelės buvo išskirtos taip [19, 29]. Riebalinio audinio biopsijos po chirurginių procedūrų buvo perkeltos į laboratoriją steriliame sandariame inde. Audinys buvo nuplaunamas Dulbecco fosfatiniu buferiniu tirpalu (PBS; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, JAV), po to pašalinta pluoštinė medžiaga ir kraujagyslės išpjaustant. Audinys buvo supjaustytas gabalėliais (1-2 mg) ir suardomas virškinimo buferyje (HBSS, kuriame yra 200 U/mL kolagenazių (II tipo CLS, Worthington Biochemical Corp., Lakewood, NI). , JAV) ir 2 % be BSA (Sigma-Aldrich, Sent Luisas, MO, JAV)) maišant 60 min 37 laipsnių temperatūroje; 1 mg riebalinio audinio / 3 ml virškinimo buferio. Išsklaidytas audinys buvo centrifuguojamas 10 minučių 200 x g kambario temperatūroje. Plaukiojantys adipocitai buvo išsiurbti, o susmulkintos stromos kraujagyslių frakcijos (SVF) ląstelės suspenduotos eritrocitų lizės buferyje (0,155 M NH4CI, 5,7 mM K2HPO4, 0,1 mM EDTA, pH 7,3) ir inkubuojamos 10 minučių kambario temperatūroje. Norint pašalinti audinių liekanas, ląstelių suspensija buvo filtruojama per nailono tinklelį (porų dydis 100 um; Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, JAV). Po kito centrifugavimo etapo (10 min. esant 200 × g) granuliuotas SVF buvo suspenduotas ASC terpėje (Dulbecco modifikuotoje Eagle terpėje (DMEM)/F-12 terpėje (1:1) su HEPES ir L-glutaminu (Thermo Fisher). Scientific, Waltham, MA, JAV), papildytas 33 μM biotino (Sigma-Aldrich, Sent Luisas, MO, JAV), 17 μM pantotenato (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, JAV), 10 ng/mL EGF,1 ng/mL bFGF, 500 ng/mL insulino, 2,5 procento galvijų vaisiaus serumo ir 12,5 μM/mL gentamicino (Sigma-Aldrich, Sent Luisas, MO, JAV) ir pasėtas 50, 000 ląstelių tankiu /cm2 T175 kolbose.

Pasiekus 70 procentų susiliejimą, ląstelės buvo plaunamos PBS ir tripsinizuojamos naudojant 0,05 procentų tripsino-EDTA 1x tirpalą (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, JAV). Trypsinas buvo inaktyvuotas pridedant ASC terpės ir 10 procentų FBS ir pašalintas centrifuguojant 300 x g 5 minutes, prieš sėjant ląsteles 5000 ląstelių/cm² tankiu. Prieš padalijimą ASC vėl buvo išauginti iki 70 procentų susiliejimo. Šiame tyrime buvo naudojami ASC ištraukose 3-4. Ląstelės buvo apdorotos skirtingų koncentracijų metforminu (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, JAV), rapamicinu (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, JAV) arba U0126 inhibitoriumi pagal eksperimentinę schemą.

2.3. Adipogeninė diferenciacija

Adipogenezės indukcijai ASC buvo pasėtos 50,000 ląstelių/cm² tankiu į 6-šulinėlių ląstelių kultūros plokšteles. Adipogenezė buvo sukelta naudojant diferenciacijos terpę, sudarytą iš 0,2 uM insulino (Sigma-Aldrich, Sent Luisas, MO, JAV), 0,5 mM 1-metilo{{9 }}izobutilksantinas (IBMX) (Sigma-Aldrich, Sent Luisas, MO, JAV), 0,25 μM deksametazonas (Sigma-Aldrich, Sent Luisas, MO, JAV) ir 10 ug/mL transferinas (St. AldrichS, St. Louis, MO, JAV) ASCmedium. Po 3 dienų diferenciacijos terpė buvo pakeista, o ląstelės buvo kultivuojamos diferenciacijos terpėje be IBMX 14 dienų.

2.4. Riebalinio audinio kultūra

Riebalinio audinio kultūra buvo atlikta 6-šulinėlių ląstelių kultūros plokštelėse su tam tikrais pakeitimais, kaip paskelbė Harms ir kt. [30]. Visas riebalinis audinys buvo susmulkintas į mažesnius 3-5 mm dydžio gabalus ir kultivuojamas 5 ml ląstelių auginimo terpėje. Ląstelių koštuvai, kurių porų dydis 70 μM, buvo laikomi virš audinių fragmentų, kad audinys būtų panardintas į terpę. Audinių fragmentai buvo virškinami kolagenaze, kaip paaiškinta aukščiau ASC išskyrimo procedūrai, o SVF buvo ištirta dėl su ASC susijusių kamieninių genų ekspresijos.

2.5. Alyvos raudonas O dažymas

Lipidų lašeliams vizualizuoti ląstelės buvo fiksuotos 4 procentų paraformaldehidu PBS 1 val. ir nudažytos 0,3 procentų Oil Red O (Sigma-Aldrich, Sent Luisas, MO, JAV) izopropanolyje/vandenyje ( 60:40) 1 val. Galutinis plovimas buvo atliktas du kartus distiliuotu vandeniu. Norint nustatyti absorbuotą alyvos raudonojo O kiekį, dėmė buvo eliuuojama izopropanoliu (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, JAV), o optinis tankis buvo išmatuotas ties 518 nm.

2.6. Kūno dažymas

14 dieną po adipogenezės indukcijos ląstelės buvo dažytos Bodipy (Invitrogen, Waltham, MA, JAV) ir Hoechst (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, JAV) 30 minučių 37 laipsnių temperatūroje. Vaizdai buvo gauti naudojant fluorescencinį mikroskopą ir analizuojami naudojant „ImageJ“ programinę įrangą.

2.7. Flucitometrija

Trečioje ištraukoje esantys ASC buvo naudojami srauto citometrinėms CD29 (Biolegend, San Diego, CA, JAV), CD90 (Biolegend, San Diego, CA, JAV), CD45 (BD, Franklin Lakes, NJ, JAV) paviršiaus ekspresijai. , CD24 (Biolegend, San Diego, CA, JAV) ir CD31 (BD, NJ, JAV). Ląstelės buvo tripsinizuojamos, plaunamos PBS ir nudažytos antikūnais FACS dažymo buferyje (1 procentas BSA PBS). Nedažyti ASC buvo naudojami kaip kontrolė. Fluorescencinis signalas buvo matuojamas srauto citometru (Fortessa, BD, Franklin Lakes, NJ, JAV), o duomenys buvo analizuojami naudojant FlowJo programinę įrangą (BD, Franklin Lakes, NJ, JAV).

2.8. Osteogeninė diferenciacija

ASC buvo auginami iki susiliejimo {{0}} šulinių plokštelėse, o osteogeninė diferenciacija buvo sukelta naudojant osteogeninę terpę (DMEM 10 procentų FBS, 0,1 uM deksametazono, 10 mM glicerolio fosfato ir 50 μM askorbo rūgšties). 21 dieną po diferenciacijos ląstelės buvo fiksuotos 4 procentų paraformaldehidu (Sigma-Aldrich, Sent Luisas, MO, JAV) ir nudažytos Alizarin Red Stain (Sigma-Aldrich, Sent Luisas, MO, JAV). Dažymo kiekybinis įvertinimas buvo atlikta naudojant Image J programinę įrangą.

2.9.Apoptozės aptikimas aneksino V-APC/PI dažymu

Apoptotinė ląstelių mirtis buvo išmatuota naudojant aneksino V-APC / PI rinkinį (Biolegend, San Diego, CA, JAV). Iš viso 10,000(ląstelių/šulinėlių) ASC buvo pasėta į 6-šulinėlių plokšteles ir inkubuojama 37 laipsnių temperatūroje su 5 procentais CO2. Ląstelės buvo apdorotos metforminu (0,25 mM, 0,5 mM, 1 mM, 2,5 mM ir 5 mM) (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, JAV). Po 72 valandų apdorojimo ląstelės buvo surinkti tripsinizuojant ir nudažyti 2,5 μL AnnexinV-APC ir 2, 5 μL PIin surišimo buferiu, inkubuojami tamsoje kambario temperatūroje 15–20 minučių ir analizuojami srauto citometrija (Fortessa, BD, NJ, JAV).

2.10.Reactoe deguonies rūšių aptikimas

ROS lygiai buvo nustatyti naudojant fluorescencinio dažiklio 2',7'-dichlorfluoresceino diacetato (DCFH2-DA) zondą (Invitrogen, Waltham, MA, JAV). ASC (10, 000 ląstelių / duobutėje) buvo kultivuojamos 6-šulinėlių plokštelėje ir inkubuojamos su metforminu (5 mM) 37 laipsnių temperatūroje, 5 proc. CO, 72 valandas. Po inkubacijos ASC buvo tripsinizuojami ir dažomi 50 μM DCFH2-DA dažais 30 min. 37 laipsnių temperatūroje ir analizuojami naudojant fluorescencinį mikroskopą.

2.11. TMRM dažymas

ASC (10,000 ląstelių/šulinėlyje) buvo kultivuojamos 6-šulinėlių plokštelėje, apdorotos skirtingomis metformino dozėmis (5 mM) 72 valandas ir inkubuojamos 37 laipsnių temperatūroje su 100 nM TMRM (Sigma-Aldrich). , Sent Luisas, MO, JAV) 30 min. 37 C temperatūroje. Po inkubacijos ląstelės buvo stebimos fluorescenciniu mikroskopu. Image] buvo naudojamas kiekybiškai įvertinti mikroskopinių vaizdų fluorescenciją.

2.12. Kiekybinė RT-PGR genų ekspresija

Bendra RNR buvo išskirta naudojant RNeasy Micro Kit (Qiagen, Hilden, Vokietija), o cDNR sintezė buvo atlikta naudojant RevertAid First Strand cDNA sintezės rinkinį (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, JAV). Genų specifiniai pradmenys buvo įsigyti iš Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, JAV. Kiekybinė ekspresijos analizė buvo atlikta naudojant Quantstudio 3 (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, JAV). MRNR kiekybinis nustatymas buvo atliktas normalizavimui naudojant -aktiną. Kiekvieno geno transkripto duomenys buvo normalizuoti apskaičiuojant skirtumą (ACt) tarp Ct-housekeeping ir Ct-Target genų. Santykinis ekspresijos padidėjimas arba sumažėjimas buvo apskaičiuotas lyginant etaloninį geną su tiksliniu genu (AACT), naudojant santykinės ekspresijos formulę (=24ACt).

2.13. Western Blot

Western blot analizė buvo atlikta iš esmės taip, kaip aprašyta [19]. Baltymų lygiui normalizuoti naudojamas metodas buvo "Pierce BCA Protein Assay Kit" (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, JAV). Ląstelių lizatai (15 ug bendro baltymo vienoje juostoje) buvo paruošti natrio dodecilsulfato (SDS) mėginio buferyje, atskirti SDS-PAGE ir blotuojami ant polivinilideno difluorido membranų. Buvo naudojami šie antikūnai: pelių anti-žmogaus aktinas (Proteintech, IL, JAV), perilipinas (Cell Signaling, MA, JAV), fosforas-P70S6K (Cell Signaling, MA, JAV), bendras P70S6K (Cell Signaling, MA, JAV), pERK1/2 (ląstelių signalizacija, MA, JAV), bendras ERK1/2 (ląstelių signalizavimas, MA, JAV), anti-pelės IgG HRP konjugatas (Proteintech, IL, JAV) ir triušio anti-žiurkės IgG HRP ( Proteintech, IL, JAV). Densitometrinei analizei buvo naudojama Image J programinė įranga. 2.14.Statistinė analizė

Statistinė analizė buvo atlikta GraphPad Prism (GraphPad Software Inc., La Jolla, CA, JAV). FlowJo buvo naudojamas FACS analizei. Vidurkių skirtumo reikšmingumas buvo įvertintas Stjudento t-testu arba dispersine analize. Nenustatyta klaida pateikiama kaip vidurkis ± SEM. Reikšmės buvo reikšmingos esant p reikšmėms<><0.01 and=""><>

3. Rezultatai

Metforminas yra gerai žinomas vaistas nuo diabeto, kuris, kaip įrodyta, atlieka svarbų vaidmenį ilginant ilgaamžiškumą [31]. Norėdami ištirti gydymo metforminu poveikį riebalinių kamieninių ląstelių kamienams, išskyrėme ASC iš žmogaus donorų riebalinio audinio kolagenazės virškinimu. Izoliuoti ASC buvo plastikiniai prilipę ir pasižymėjo fibroblastine arba verpstės formos morfologija. Srauto citometrijos analizė parodė, kad ASC buvo teigiami mezenchiminių kamieninių ląstelių žymenims, tokiems kaip CD29, CD90 ir CD24, bet neigiami hematopoetinės linijos žymeniui CD45 ir endotelio linijos žymeniui CD31 (1A pav.). Be tipiško ASC fenotipo, ASC parodė tvirtą adipogeninį ir osteogeninį diferenciacijos potencialą, identifikuotą atitinkamai Bodipy ir Alizarin Red S dažymu (1B pav.).cistanche แอ ม เว ย์Apibūdinti ASC buvo naudojami tolesniems mūsų tyrimo eksperimentams.

Literatūroje buvo pranešta, kad metforminas mažina kamieninių ląstelių adipogeninę diferenciaciją. Siekiame ištirti ASC adipocitų diferenciacijos reguliavimą gydant metforminu. ASC buvo gydomi 1, 2, 5 ir 5 metforminu, pradedant 2 dienas prieš adipogeninę indukciją ir viso diferenciacijos proceso metu. Bodipy ir Oil Red Ostains buvo naudojami aliejaus lašeliams vizualizuoti 14 dieną po diferenciacijos sukėlimo. Oil Red O (1C pav.) ir Bodipy dažymo (1D pav.) rezultatai rodo, kad gydymas metforminu reikšmingai slopina adipogeninę diferenciaciją priklausomai nuo dozės, palyginti su kontrolinėmis ląstelėmis. Adipogeninės diferenciacijos slopinimas buvo toliau patvirtintas naudojant adipocitų diferenciacijos žymens baltymo perilipino Western blot analizę. Tam ląstelių lizatai buvo paimti iš diferencijuotų ląstelių 14 adipogeninės diferenciacijos dieną ir buvo analizuojama perilipino ekspresija. Mūsų Western blot rezultatai rodo reikšmingą perilipino ekspresijos sumažėjimą gydant metforminu adipogeninės diferenciacijos metu (1E pav.), o tai koreliavo su Bodipy ir Oil Red O dėmių sumažėjimu. Darome išvadą, kad gydymas metforminu slopina žmogaus ASC adipogeninę diferenciaciją, o slopinimo mastas teigiamai koreliuoja su gydymo metforminu doze.

Didesnis diferenciacijos ir dauginimosi greitis lemia stiebo praradimą. Kadangi pastebėjome, kad metforminas mažina adipogeninę diferenciaciją, buvome suinteresuoti ištirti gydymo metforminu poveikį ASC proliferacijai in vitro. ASC buvo gydomi metforminu, o ląstelės buvo skaičiuojamos 4 dieną po kultivavimo, esant metforminui arba be jo. Iš mūsų rezultatų pastebėjome, kad metforminas žymiai sumažina ląstelių proliferacijos greitį, palyginti su kontroliniais ASC (2A pav.). Kamieninės ląstelės atlieka svarbų vaidmenį regeneruojant ir palaikant audinius.kiek cistanche paimtiKad kamieninės ląstelės efektyviai atliktų savo regeneracinį vaidmenį, jos turi išlaikyti savo kamienines savybes. Išanalizavome gydymo metforminu poveikį kamieninių genų ekspresijai ASC. Šiuo tikslu mes panaudojome kiekybinę realaus laiko PGR, kad analizuotume genus, susijusius su stiebo palaikymu ASC. Mes pastebėjome, kad metforminas žymiai padidino riebalinių kamieninių ląstelių žymenų, tokių kaip BMP7, DPP4, Sox2, Oct3/4, Wnt2, ICAM1, CD90 ir DLK1, ekspresiją, palyginti su kontroliniais ASC (2B pav.). Mūsų rezultatai rodo, kad gydymas metforminu veiksmingai sulėtina ASC proliferaciją, taip užkertant kelią ląstelėms nuo proliferacijos išsekimo, sustiprindamas kamieninių genų ekspresiją.

1 pav. Gydymas metforminu slopina adipogeninę ASC diferenciaciją priklausomai nuo dozės. (A) ASC buvo tiriami dėl CD29, CD90, CD24, CD31 ir CD45 ekspresijos srauto citometrija. Pateikiamas tiek procentinis pozityvumas, parodytas histogramose, tiek vidutinis fluorescencijos intensyvumas (MFI), parodytas kontrolės (nedažyti ASC), ir dažyti (ASC, apdoroti atitinkamais antikūnais) lentelėje. (B) ASC buvo paveikti adipogenine arba osteogenine diferenciacija, naudojant linijai būdingus diferenciacijos kokteilius. Atskyrimas nuo adipocitų linijos buvo patvirtintas Bodipy dažymu, o osteogenezę patvirtino Alizarin Red dažymas. Alizarin Red dažytos srities procentinė dalis buvo apskaičiuota naudojant J vaizdą. (C) ASC buvo gydomi adipocitų diferenciacijos kokteiliu, esant skirtingoms metformino dozėms arba be jų 14 dienų. Adipocitų vystymasis 14 dieną po indukcijos buvo įvertintas dažant lipidų lašelius, naudojant Oil Red O dėmę. Absorbuota Oil Red O dėmė buvo išgauta ir išmatuotas optinis tankis. Kontrolinių ASC optinis tankis buvo paimtas kaip 100 procentų, o santykinis pokytis po gydymo metforminu buvo nubraižytas (n =3). (D) Lipidų kiekis 14 dieną buvo nustatytas naudojant Bodipy dėmę (žalia). Branduoliams dažyti buvo naudojamas Hoechst (mėlynas).kas yra cistanche(E) Perilipino baltymo ekspresijos Western blot analizė. -Aktinas buvo naudojamas kaip pakrovimo kontrolė. Perilipino baltymo juostos tankio, normalizuoto iki -aktino, kiekybinis įvertinimas. Vaizdas J. Vaizdai ir grafikai yra trijų nepriklausomų pakartojimų (n=3) atstovai. *p<0.05,**><0.01,***p><0.001 and="" ***=""><0.0001 as="" compared="" with="">

Siekdami atmesti galimybę, kad diferenciacijos ir proliferacijos sumažėjimas nėra dėl bet kokio citotoksinio metformino poveikio ASC, išanalizavome metforminu apdorotų ląstelių gyvybingumą. Analizuojant AnnexinV/PI dažymą srauto citometrijos metodu, nepastebėta reikšmingo apoptozinių ar nekrozinių ląstelių padidėjimo, kai metformino koncentracija didėja iki 5, palyginti su ląstelių kultūros terpės kontrole (3A pav.). Mitochondrijų aktyvumas ir reaktyviųjų deguonies rūšių (ROS) susidarymas yra svarbūs ląstelių diferenciacijai, o adipogeninės diferenciacijos metu buvo pastebėtas padidėjęs mitochondrijų metabolizmo ir ROS susidarymo lygis [32]. Iš mūsų rezultatų pastebėjome, kad gydymas metforminu sumažina ASC adipogeninę diferenciaciją. Toliau ištyrėme poveikį mitochondrijų aktyvumui ir ROS gamybai. ASC buvo apdoroti metforminu ir nudažyti TMRM, kad būtų įvertintas mitochondrijų membranos aktyvumas, ir DCF2DA, kad būtų galima įvertinti ROS koncentraciją. Fluorescencinio mikroskopo vaizdai ir fluorescencinio signalo kiekybinis įvertinimas parodė, kad gydymas metforminu žymiai sumažina mitochondrijų aktyvumą (3B pav., C) ir ROS gamybą (3D pav., E). Darome išvadą, kad metformino sukeltas mitochondrijų aktyvumo ir ROS gamybos sumažėjimas prisideda prie ASC kamieno padidėjimo.

Norėdami suprasti galimą signalizacijos kaskadą, atsakingą už sumažėjusią adipocitų diferenciaciją, proliferaciją ir kamieninių genų reguliavimą ASC gydant metforminu, mes sutelkėme dėmesį į mTOR, autofagiją ir ekstraląstelinio signalo reguliuojamos kinazės (ERK) signalizacijos kaskadas. Ankstesni tyrimai parodė svarbų šių būdų vaidmenį palaikant ASC kamieną [19, 33]. Tiek ERK, tiek mTOR signalizacija vaidina svarbų vaidmenį skatinant ląstelių proliferaciją ir diferenciaciją. Po to, kai ASC buvo apdorotos skirtingomis metformino dozėmis, ląstelių lizatai buvo surinkti ir Western blot'as, siekiant nustatyti LC3, fosforilinto-p70S6 kinazės, bendros p70S6 kinazės, fosforilinto-ERK42/44 ir bendro ERKp42/44 antikūnų kiekį. Beta-aktinas buvo naudojamas kaip namų tvarkymo genas. Western blot analizė parodė, kad, palyginti su kontroliniais ASC, gydymas metforminu sumažino fosforilinto p70S6K ir fosforilinto-ERK42/44 kinazės ekspresiją (4A, B, D pav.). Tiek ERK, tiek mTOR signalizacija atlieka svarbų vaidmenį reguliuojant autofagijos kelią.bioflavonoidaiWestern blot rezultatai atskleidė, kad gydymas metforminu padidina autofagijos aktyvumą ASC (4A, C pav.). Toliau išanalizavome autofagijos kelio genų ekspresiją gydant metforminu mRNR lygiu, naudodami kiekybinę realaus laiko PGR. Atlikdami qPCR analizę, pastebėjome reikšmingą autofagijos kelio genų VMP1, P62, ATG5 ir ATG7 padidėjimą po gydymo metforminu (4E pav.), o tai atitinka mūsų Western blot rezultatuose parodytą autofagijos aktyvumo padidėjimą. Mūsų analizėse taip pat buvo pastebėtas nereikšmingas ATG 9 ekspresijos padidėjimas. Darome išvadą, kad gydymas metforminu sumažina ERK ir mTOR aktyvumą ir sustiprina autofagiją ASC kaip galimą pagrindinį mechanizmą, skirtą sumažinti proliferaciją ir diferenciaciją bei padidinti kamieną.

Norėdami pabrėžti tiesioginį ERK ir mTOR signalizacijos vaidmenį gydant metforminu sukeltam diferenciacijos slopinimui ir ASC kamienų padidėjimui, mes atskirai slopinome ERK signalizaciją ir mTOR kelią, naudodami atitinkamai ERK inhibitorių U0126 ir rapamiciną, ir išanalizavome poveikį ASC. diferenciacija ir kamieniškumas [19,33]. Pridėjus ERK inhibitorių U0126 ASC adipocitų diferenciacijos metu, diferenciacija žymiai sumažėjo, kaip rodo Bodipy dažyti vaizdai ir kiekybinis fluorescencijos įvertinimas (5A, B pav.). Kiekybiniai realaus laiko PGR rezultatai, rodantys kamieninių genų reguliavimą dėl inhibitorių sukelto specifinio slopinimo. ERK signalizacija (5C pav.) taip pat patvirtino mūsų išvadą, kad ERK kelio reguliavimas gydant metforminu prisideda prie kamieniškumo didinimo.

Tada mes panaudojome rapamiciną, gerai žinomą mTOR kelio inhibitorių, galintį suaktyvinti autofagiją, ir įvertinome poveikį adipogenezei ir kamieninių genų ekspresijai [19]. ASC ląstelių lizatai, apdoroti rapamicinu, buvo surinkti ir tiriami fosforilinta p70S6 kinaze, bendra p70S6 kinaze ir aktino antikūnais. Pastebėjome, kad rapamicinas sumažino fosforilinto-p70S6 kinazės ekspresiją (6A pav.). Norint nustatyti funkcinį vaidmenį adipogeninėje diferenciacijoje, ASC buvo gydomi rapamicinu ir indukuojami adipogenine terpe. Po 14 dienų ląstelės buvo nudažytos Bodipy dažais, kad būtų galima įvertinti adipogenezę. Pastebėjome, kad gydymas rapamicinu žymiai sumažino adipogeninę diferenciaciją (6B, C pav.). Toliau išanalizavome mTOR signalo perdavimo blokavimo poveikį ASC kamienui. Šiuo tikslu ASC buvo gydomi rapamicinu, o realaus laiko PGR buvo naudojamas transkriptų, susijusių su kamienu, ekspresijai matuoti. Pastebėjome, kad rapamicinas žymiai padidino su stiebu susijusių žymenų ekspresiją (6D pav.). Darome išvadą, kad tiek ERK, tiek mTOR takų slopinimas prisideda prie adipocitų diferenciacijos sumažėjimo ir kamieno padidėjimo žmogaus ASC.

Toliau išbandėme, ar galime atkurti metformino gydymo kamieną gerinantį poveikį 2Dkultūriniams ASC sudėtingesniame ir in vivo verčiamame viso riebalinio audinio kultūros modelyje. Tam mes pakeitėme Harms ir kt.30 paskelbtą riebalinio audinio kultūros protokolą, naudodami ląstelių koštuvus, o ne transwell intarpus, kad riebalinio audinio fragmentai būtų panardinti į terpę (7A pav.). Po 5 dienų kultivavimo 3-5 mm žmogaus riebalinio audinio fragmentų su metforminu arba be jo, riebalinio audinio fragmentų virškinimu kolagenaze išskyrėme stromos kraujagyslių frakciją (SVF) ir išanalizavome su kamienu susijusių genų ekspresiją. Realaus laiko PGR duomenys parodė, kad SVF iš riebalinio audinio, apdoroto metforminu, parodė reikšmingą kamieninių žymenų, tokių kaip BMP7, DLK1, MYC1, DPP4, OCT3/4, Sox2, Nanog, KLF4, PDGFR ir Wnt2, ekspresijos reguliavimą (7B pav. ).

4. Diskusija

Riebalinės kamieninės ląstelės (ASC) regeneruoja riebalinį audinį per savaiminį atsinaujinimą ir diferenciaciją, taip išlaikydamos audinių kamieninių ląstelių telkinį. Tačiau senėjimas ir nutukimas yra susiję su ASC kamieninių savybių praradimu. Metforminas yra vaistas nuo diabeto ir parodė daug žadančių rezultatų kaip anti-senėjimo priemonė. Mes sutelkėme dėmesį į metformino poveikio ASC kamienui analizę ir pagrindinio mechanizmo supratimą, siekdami nustatyti, kad metforminas yra potencialus agentas, padedantis išlaikyti ASC kamieną su amžiumi. Kad būtų lengviau perkelti savo rezultatus į žmones, mes panaudojome 2D žmogaus ASC ląstelių kultūros modelį ir panaudojome žmogaus riebalinio audinio kultūros metodą sudėtingesnei audinių aplinkai modeliuoti. Kaip audinių šaltinį savo tyrimams naudojome poodinį riebalinį audinį. Naudodami šias įvairias ląsteles ir audinių kultūros metodus, ištyrėme gydymo metforminu poveikį ASC kamienui.

Nutukimas sukelia ASC diferenciacijos kinetikos pokyčius, o tai sumažina kamieninių ląstelių telkinį. Mūsų rezultatai rodo, kad, palyginti su negydytais ASC, gydymas metforminu sumažino adipogenezės greitį priklausomai nuo dozės. Šis stebėjimas atitinka ankstesnes ataskaitas, kurios parodė, kad metforminas slopina adipogenezę riebalinėse kamieninėse ląstelėse, kaulų čiulpų stromos ląstelėse, periodonto raiščių kamieninėse ląstelėse ir 3T3 ląstelių linijose [34-37]. Kamieninių ląstelių dauginimosi greitis vaidina svarbų vaidmenį palaikant kamieninių ląstelių telkinį, kamieniškumą ir gebėjimą atsinaujinti. Pastebėjome, kad metforminas slopino ASC proliferaciją, nesukeldamas jokio citotoksinio poveikio ASC, o tai atitinka kitus tyrimus, paskelbtus apie pelių riebalines kamienines ląsteles [28], stromos ląsteles ir fibroblastus [38, 39].nusipirk cistancheNeseniai atliktas tyrimas, kuriame buvo panaudotos riebalinės arklių kamieninės ląstelės, parodė proproliferacinį metformino poveikį [27]. Labiausiai tikėtinas šių prieštaringų stebėjimų paaiškinimas yra donorų rūšių ir anatominės ląstelių surinkimo vietos skirtumas, nes arklio ASC buvo paimti iš uodegos. Agnieszka Smieszek ir kt. pastebėta, kad metforminas slopina ląstelių proliferaciją ir skatina ląstelių mirtį, didinant dozes (5 ir 10 mM) pelių kaulų čiulpų gautose stromos ląstelėse ir Balb/3T3 embrioninių fibroblastų ląstelių linijoje [40]. Be to, metforminas slopina palydovinių ląstelių, išskirtų iš pelių raumenų, dauginimąsi |41. Remdamas mūsų stebėjimą, Min-lung Park ir kt. pranešė, kad metforminas pagerina žmogaus ASC priešuždegimines savybes, sumažindamas IL-1, IL-6 ir TGF- ekspresijos lygius; metforminas taip pat padidina persodintų ASC išgyvenamumą ir apsaugo nuo apoptozinės ląstelių mirties [42]. Šie rezultatai rodo skirtingą gydymo metforminu poveikį ląstelių, gautų iš skirtingų rūšių, gyvybingumui ir kad žmogaus ASC yra atsparūs galimam gydymo metforminu citotoksiniam poveikiui.

ASC diferencijavimas į adipocitus yra susijęs su didesniais energijos poreikiais ir medžiagų apykaitos greičiu, todėl padidėja mitochondrijų aktyvumas ir ROS gamyba. ROS vaidina lemiamą vaidmenį palaikant ramybę ir kamieniškumą suaugusiųjų kamieninėse ląstelėse, nes didesnis ROS lygis skatina ląstelių diferenciaciją ir galiausiai kamieninių ląstelių senėjimą bei ląstelių mirtį [43]. Pastebėjome, kad metforminas žymiai sumažina mitochondrijų membranos potencialą ir reaktyviųjų deguonies rūšių susidarymą. Remiantis mūsų duomenimis, ankstesni tyrimai taip pat pranešė, kad metforminas mažina oksidacinį stresą ir pagerina antioksidantų ekspresiją pelių embriono fibroblastuose [44], pelių ASC [38] ir žmogaus aortos endotelio ląstelėse [45]. Be to, sutikdami su mūsų tyrimu, Chien-Hung Lin ir kt. pranešė, kad metforminas veikia kaip neuroprotekcinis agentas, sumažindamas oksidacinį stresą žmogaus nervų kamieninėse ląstelėse [46]. Keletas kitų tyrimų patvirtina, kad metforminas veikia kaip antioksidantas, mažindamas oksidacinį stresą ir padidindamas antioksidantų fermentų ekspresiją, pvz., superoksido dismutazę pelių ASC, pelių C2C12 mioblastus ir cirkuliuojančios žmogaus endotelio progenitorines ląsteles [38, 47, 48]. Be to, Alejandro Martin-Montalvo ir kt. patvirtina mūsų pastebėjimą, įrodantį, kad metforminas reikšmingai slopina mitochondrijų kompleksą, slopindamas pelių mitochondrijų kvėpavimą [49] Metformino poveikį sumažėjusiam reaktyviųjų deguonies rūšių susidarymui galbūt lemia redukuoto glutationo [50] padidėjimas mechanizme, kuriame dalyvauja redokso- jautrus transkripcijos faktorius Nrf2 [51].

Nustatyta, kad metforminas skatina palydovinių ląstelių ramybės būseną, sumažindamas metabolizmą, reikalingą proliferacijai ir diferenciacijai. Įvairūs tyrimai taip pat patvirtina, kad metforminas stipriai skatina kamieninių ląstelių augimą ir atjaunėjimą [23,39,41,49,52,53]. Taip pat žinoma, kad jis žymiai pagerina ir padidina kamieninių ląstelių žymenų ekspresijos lygius. Kadangi mes pastebėjome, kad metforminas slopina proliferaciją ir adipogenezę, slopindamas oksidacinį stresą ir mitochondrijų aktyvumą, siekėme patvirtinti, ar metforminas pagerina kamieną ASC ar in vitro riebalinio audinio kultūros modelyje. Atitinkamai, mes pastebėjome, kad metforminas reikšmingai pagerino DPP4, Wnt2, THP1, DLK1, PDGFR, ICAM1 ir Annexin3, Oct3/4, Nanog, BMP4, SOX2 ir Mycl su stiebu susijusią žymenų ekspresiją 2D ASCculture ir riebalinio audinio kultūros modeliuose. . Viso riebalinio audinio kultūros naudojimas suteikia unikalią galimybę imituoti žmogaus audinių mikroaplinką in vivo, kur ląstelės yra orientuotos taip, kaip natūrali jų architektūra ir turi interaktyvų palaikymą iš skirtingų ląstelių tipų, įaustų audinių matricoje. Kiek mums yra žinoma, mūsų tyrimas pirmą kartą parodo gydymo metforminu kamieną didinantį poveikį žmogaus ASC, tiek 2D, tiek viso riebalinio audinio kultūrose. Manome, kad mūsų rezultatai, rodantys kamieninių genų parašo padidėjimą ASC, išskirtuose iš metforminu gydytų riebalinio audinio fragmentų, skatina tolesnius metformino naudojimo kaip terapijos tyrimus, siekiant sulėtinti senėjimo procesą ir atjauninti senus riebalinius audinius.

Mechaninis rapamicino (mTOR) taikinys vaidina pagrindinį vaidmenį kamieninių ląstelių proliferacijoje ir diferenciacijoje. MTOR aktyvumo sumažinimas genetinėmis manipuliacijomis, terapine intervencija ar su gyvenimo būdu susijusiais pokyčiais padidina kamieną ir ilgaamžiškumą [19, 20]. Kadangi pastebėjome, kad metforminas slopina adipogenezę, išbandėme metformino poveikį mTOR signalizacijai. Įdomu tai, kad rezultatai parodė, kad metforminas žymiai sumažina PS70S6 kinazės, kuri yra pagrindinė signalizacijos molekulė pasroviui nuo mTOR ir mTOR kelio aktyvumo reporteris, fosforilinimo lygį. Ankstesni tyrimai taip pat rodo, kad metforminas slopina adipogenezę, slopindamas mTOR signalizacijos kelią pelių embrioniniuose fibroblastuose (MEF), C3H10T1/2 pelės mezenchiminėse kamieninėse ląstelėse ir 3T3-L1 preadipocituose [34]. Mechaninis rapamicino taikinys susideda iš dviejų kompleksų, mTORCl ir mTORC2, o signalizacija vaidina svarbų vaidmenį adipogenezėje. Nustatyta, kad mTORC1 signalizacijos slopinimas rapamicinu pablogina adipogenezę, nes sumažėja PS6kinazės fosforilinimas 3T3-L1 preadipocituose. Šie tyrimai taip pat parodė, kad mTOR signalizacijos slopinimas slopina adipogenezę, sumažindamas adipocitų linijos žymenų, tokių kaip PPARgamma, CEBPI , CEBP1 ir adiponektinas [54-56], ekspresijos lygius. Be to, mTOR signalizaciją tarpininkauja S6 kinazės fosforilinimas. Įrodyta, kad S6 kinazės numušimas yra atsparus nutukimui ir svorio padidėjimui riebios dietos sąlygomis dėl adipogenezės sutrikimo [57]. Patvirtinome savo pastebėjimą, kad metforminas sukelia mTOR aktyvumo sumažėjimą, kaip galimą tarpininką didinant kamieną ir sumažinant ASC diferenciaciją, naudojant rapamiciną, kuris specifiškai blokuoja m TOR kelio aktyvumą.

Be mTOR, ERK signalizacijos kelias vaidina lemiamą vaidmenį proliferacijoje ir adipogenezėje. Xiaomin Ning ir kt. savo publikacijoje teigia, kad adipogenezę suaktyvina ERK signalizacija [58]. Kadangi pastebėjome, kad metforminas slopina adipogenezę ir proliferaciją, nusprendėme ištirti metformino poveikį ERK signalizacijai. Remiantis ankstesnėmis ataskaitomis, mūsų rezultatai taip pat rodo, kad metforminas gali slopinti adipogenezę, slopindamas ERK signalizaciją ir padidindamas su kamienu susijusią genų ekspresiją. mTOR signalizacija reikalinga ląstelių proliferacijai ir diferenciacijai ir yra neigiamas autofagijos reguliatorius [{{2 }}]. Tačiau autofagijos praradimas yra susijęs su kamieno praradimu, nors gydymas metforminu pagerino su kamiene susijusią genų ekspresiją, aktyvuodamas su autofagija susijusią žymenų ekspresiją, tokią kaip LC3Il. Taigi, mūsų rezultatai rodo, kad metforminas pablogina adipogenezę, pagerindamas žmogaus ASC arba žmogaus riebalinio audinio kultūros modelių kamieną, aktyvuodamas autofagiją ir slopindamas mTOR signalizacijos kelius. Būsimi in vivo gyvūnų ir žmonių tyrimai, skirti įvertinti metformino poveikį ASC biologijai, padės pritaikyti metformino, kaip kamieninių ląstelių senėjimo agento, naudojimą.

Šis straipsnis yra ištrauktas iš Biomedicines 2021, 9, 1782. https://doi.org/10.3390/biomedicines9121782 https://www.mdpi.com/journal/biomedicines