MikroRNR inkstų vystymuisi ir ligoms Ⅲ

MiRNR Wilms navikuose

Wilmso navikas,arbanefroblastoma, yra dažniausia vaikystėinkstų vėžys, kurio dažnis yra 1 iš 10, 000 vaikų Šiaurės Amerikoje (111). Tai visų pirma sporadinė liga, nors šeiminės formos pasitaiko maždaug 1–2 % atvejų (112, 113). Wilmso navikai atsiranda dėl nenormalios nefrogenezės, kai pluripotentiniai embrioniniai inkstų pirmtakai nesiskiria ir išlieka.neįprastai į postnatalinį gyvenimą(111, 114, 115). Šie navikai histologiškai panašūsbesivystantys inkstaisusutrikusi morfologija(116), o vaisiaus nefrogenezėje dalyvaujančių genų, įskaitant WT1 (117–119), CTNNB1 (120), SIX1/2 (121, 122) ir TP53 (123, 124), mutacijos yra susijusios su maždaug 40 proc. Wilms navikai (125). Naujausi tyrimai, naudojant Wilmso navikų viso genomo ir viso egzomo seką, nustatė naujas mutacijas vėžio rizikos genuose (REST, CHEK2, PALB2) (126, 127), genuose, koduojančiuose baltymus, kurie tarpininkauja histono modifikacijoms nefrogenezės metu (BCOR, MAP3K4) (126). ) ir miRNR apdorojimo genai (121, 122, 128, 129).

KIEK TRUNKA, KAD CISTANCHE VEIKTI INKSTU LIGOS LIGOMS?

Tarp miRNR apdorojimo genų buvo pranešta apie DROSHA, DGCR8, DICER1, TARBP2 ir XPO5 (koduoja eksportiną 5) mutacijas anksčiau negydytuose ir neoadjuvantinėje chemoterapija gydytuose Wilms navikuose (3 pav.) (121, 122, 128, ). Apie 33% ištirtų Wilmso navikų turi žalingų miRNR apdorojimo kelio genų mutacijų (128). Pasikartojanti „hotspot“ mutacija (E1147K) DROSHA RNazės IIIb domeno met al surišančioje (Mg2+) liekanoje, kuri, atrodo, būdinga tik Vilmso navikui, panaikina šio domeno katalizinį aktyvumą, todėl jis nėra pilnas. pri-miRNR skilimas ir sumažėjęs miRNR brendimas (128). Somatinės hotspot mutacijos, turinčios įtakos DICER1 RNazės IIIb domenui, trukdo apdoroti 5p miRNR (tos, gautos iš pre-miRNR plaukų segtuko 5′-šakos) (129) ir dažnai aptinkamos kaip „antros patekimo“ mutacijos, veikiančios kartu su DICER1. gemalo linijos mutacijos, sukeliančios Wilmso naviko atsiradimą sergant DICER1 sindromu (sutrikimas, padidinantis jautrumą įvairiems navikams) (130–132). Lieka neaišku, kodėl sutrikusi DICER1 funkcija Wilmso navikuose sukelia nuolatinę ir nenormalią nefrogenezę, skirtingai nei Dicer1 praradimas pelių nefrono pirmtakuose, dėl kurio padidėja apoptozė ir priešlaikinis nefrogenezės nutraukimas (72–75). Kai kurios galimos galimybės apima tai, kad genų dozavimo aktyvumas gali būti labai svarbus nustatant ląstelių išgyvenimą arba kad mutacijos RNazės IIIb domene gali turėti įtakos miRNR surišimo DICER1 specifiškumui.

MiRNR apdorojimo genų mutacijos yra susijusios su svarbių miRNR, įskaitant miR-200 (121) ir let-7 šeimos narius, reguliavimu (3 pav.) (121, 129). Tegul-7 miRNR ir RNR surišantis baltymas Lin28 veikia kartu, kad būtų galima kontroliuoti pelių nefrogenezės nutraukimo laiką, galbūt reguliuojant augimą skatinantį geną Igf2 (133). Per didelis Lin28 ekspresija inkstų vystymosi metu sukelia nefrogeninių pirmtakų išsiplėtimą, slopindama paskutinę jų diferenciacijos bangą, kuri baigiasi neoplastine transformacija, kuri labai primena žmogaus Wilmso naviką (134). Padidėjęs LIN28B DNR kopijų skaičius ir let-7a DNR kopijų praradimas stebimas atitinkamai 25 % ir 46 % žmogaus Wilms naviko mėginių (126). Remiantis šiais stebėjimais, žmogaus DISL3L2 geno, koduojančio egzoribonukleazę, atsakingą už iš anksto apdorotų let-7 formų skaidymą, gemalo linijos mutacijos sukelia Perlmano sindromą ir polinkį į Wilms naviką (135, 136). Perlmano sindromas yra įgimtas peraugimo sindromas, kuriam būdinga makrosomija, polihidramnionas, veido dismorfologija, inkstų displazija ir nefroblastomatozė (Wilmso naviko pirmtakas) (137). 64 % kūdikių, sergančių Perlmano sindromu, išgyvenusių praėjus naujagimiams, išsivysto Wilmso navikas (138). Įdomu tai, kad visiškos arba dalinės DISL3L2 delecijos buvo nustatytos maždaug 30% ištirtų sporadinių Wilms navikų (136).

Neseniai atliktas tyrimas sustiprino miRNR reguliavimo tinklo reikšmę Wilmso naviko etiologijoje. Autoriai nustatė, kad pleiomorfinės adenomos genas 1 (PLAG1) yra vienas nuosekliausiai reguliuojamų genų Wilmso navikuose su miRNR apdorojimo genų mutacijomis (125). Negimdinė PLAG1 ekspresija besivystančiame pelės inkste sukelia neoplaziją, kurią lydi tikslinio geno, Wilmso naviko onkogeno IGF2, transaktyvacija. miR-16 ir miR-34, kurių reguliavimas Wilmso navikuose yra sumažintas, buvo nustatyti kaip galimi PLAG1 ekspresijos reguliatoriai (125). 2 lentelėje apibendrinami kiti tyrimai, kuriuose buvo pranešta apie nenormalią specifinių miRNR ekspresiją, susijusią su Wilmso naviko etiologija. Įdomu tai, kad šios miRNR gali veikti kaip onkogenai (vadinami oncomiR) arba naviko slopintojai Wilmso naviko vystymosi sąlygomis, atsižvelgiant į jų taikinių pobūdį.

MiRNR kaip galimi biomarkeriai ir terapiniai agentai

Be tarpląstelinės vietos, miRNR taip pat yra dideli kiekiai biologiniuose skysčiuose, įskaitant kraujyje, plazmoje, šlapime, motinos piene ir seilėse (139). Šios cirkuliuojančios miRNR randamos supakuotos į mikrodaleles (egzosomas, mikropūsleles ir apoptozinius kūnus) (140, 141), konjuguotos su AGO (142) arba nukleofosmino 1 baltymais (143) arba įkeltos į DTL (144), todėl jos yra nepaprastai svarbios. stabilus net ir esant nepalankioms sąlygoms, tokioms kaip virimas, ekstremalūs pH svyravimai, ilgesnis saugojimas ir keli užšaldymo-atšildymo ciklai (145, 146). Taigi miRNR parašai biologiniuose skysčiuose gali atspindėti ryšius su fiziologinėmis ar ligos sąlygomis (147). Kartu dėl šių savybių cirkuliuojančios miRNR yra patrauklios naudoti kaip neinvaziniai biomarkeriai ligų diagnostikai ir prognozėms.

Cirkuliuojančios miRNR gali būti išgaunamos tiesiogiai iš nefrakcionuotų biologinių skysčių arba tarpląstelinių pūslelių preparatų, naudojant komerciškai prieinamus ekstrahavimo rinkinius (148) arba TRIzol (149). Izoliuotos miRNR gali būti laikomos –70 laipsnių temperatūroje ir išlieka stabilios iki 1 metų (148). Yra keletas miRNR profiliavimo platformų, įskaitant mikrogardelių hibridizaciją, qPCR ir naujos kartos sekos nustatymą (150). „Microarray“ ir „qPCR“ yra dažniausiai naudojamos žinomų miRNR ekspresijos tyrimo metodikos (151). Abu metodai turi privalumus, nes yra paprasti naudoti, palyginti greiti nuo RNR žymėjimo iki duomenų generavimo ir santykinai ekonomiški (152). Tačiau jie priklauso nuo miRNR sekų prieinamumo ir tikslios anotacijos duomenų bazėse zondo ir pradmenų projektavimui (150). Nors ir brangesnis, naujos kartos sekos nustatymas leidžia vienu metu aptikti žinomas ir naujas miRNR rūšis ir pasižymi dideliu jautrumu (153). Be to, naujos kartos sekos nustatymo vieno nukleotido skiriamoji geba leidžia identifikuoti izomiR, kurie yra subrendusios miRNR izoformos, kurios skiriasi nuo kanoninių ilgiu, seka arba abiem (154, 155), kurios keičia miRNR taikymo specifiškumą ( 156).

Įvairūs tyrimai ištyrė cirkuliuojančių miRNR, kaip vaikų inkstų ligų biomarkerių, potencialą (157–160). Pavyzdžiui, vienas tyrimas nustatė 14 miRNR, kurios buvo žymiai padidintos pacientų, sergančių Wilms naviku, serume. Įdomu tai, kad parašas, pagrįstas miR-100-5p ir miR-130-3p išraiška, gali skirti šiuos pacientus nuo sveikų kontrolinių asmenų tikslumu, jautrumu ir specifiškumu (159). Nors šio tyrimo ir daugelio kitų tyrimų išvados suteikė įtikinamą motyvaciją ištirti cirkuliuojančių miRNR, kaip biomarkerių, potencialą, prieš pradedant platų klinikinį taikymą, reikia įveikti keletą kliūčių šioje srityje. Pirma, santykinai trūksta sutarimo tarp tyrimų, greičiausiai dėl to, kad nėra standartizuotos mėginių valymo (161) ir analizės metodikos (pvz., miRNR profiliavimo platformų skirtumai, nuorodos 162, 163; arba smRNA-Seq bibliotekos skirtumai). paruošimo būdai, 164 nuoroda). Antra, trūksta didelės imties tyrimų ir išsamių specifinių tyrimųligų.Kitas svarbus aspektas yra tai, kad klaidinančių kintamųjų, tokių kaip amžius, lytis ir išoriniai veiksniai (pvz., tabakas, alkoholis ir kt.), įtaka miRNR profiliams nebuvo iki galo ištirta (išsamią apžvalgą žr. 165).

Kalbant apie terapinę pusę, keli miRNR pagrindu pagaminti vaistai šiuo metu yra klinikiniuose tyrimuose, tačiau jiems dar nebuvo suteiktas FDA patvirtinimas (166, 167). Pagrindiniai miRNR terapijos būdai yra miRNR lygio atkūrimas naudojant miRNR imitacijas arba specifinių miRNR slopinimas naudojant antagonomiR (168). Vienas iš iššūkių, susijusių su miRNR pagrindu sukurtų terapijų kūrimu, yra miRNR kandidatų nustatymas kiekvienai ligai. Kadangi kiekvienoje ligoje nereguliuojamos kelios miRNR, reikia atlikti kruopščią pacientų mėginių analizę kartu su in vitro ir in vivo tyrimais, kuriais sprendžiami minėtų miRNR paveikti patofiziologiniai mechanizmai, siekiant susiaurinti kandidatų miRNR terapinei intervencijai (168, 169). Kitas iššūkis susijęs su strategijų, kaip pagerinti stabilumą in vivo ir konkrečios vietos vaistų tiekimą su minimaliu toksiškumu ir netiksliniu poveikiu, kūrimas. RNR molekulės yra chemiškai nestabilios dėl 2′-hidroksilo grupės buvimo pentozės žiede. Siekdamos užtikrinti didesnį stabilumą ir apsaugą nuo nukleazių, esančių serume arba ląstelių endocitiniame skyriuje, biotechnologijų įmonės sukūrė RNR molekules su cheminėmis modifikacijomis (2′-O-metilo grupe, fosforotioatu arba užrakintomis nukleino rūgštimis) savo pagrinde (166). Kalbant apie tiekimą in vivo, technologijos apima lipidų pagrindu pagamintas (pvz., lipidų nanodaleles ir neutralias liposomas) ir dendrimerus, konjuguotus su tiksline dalimi, be daugelio kitų strategijų. Pagrindiniai iššūkiai, susiję su miRNR tiekimo sistemomis, yra imunotoksiškumas ir specifinis afinitetas ligos vietai (170). Įvairiais vartojimo būdais (intraperitonine, intravenine ir poodine injekcija) arba vektoriais, turinčiais specifinių inkstui indukuojamų promotorių, buvo sėkmingai naudojamos selektyviam inkstų nukreipimui ir galimo neigiamo poveikio kitiems audiniams ir organams išvengti (171, 172). ).

2 lentelė. Vilmso naviko pakitimų miRNR sąrašas

MiRNR sąrašas, analizuojami mėginiai/pavyzdžiai, šiuose mėginiuose/pavyzdžiuose pastebėti miRNR lygiai, palyginti su atitinkamais kontroliniais preparatais, tikslinis genas, miRNR pokyčių pasekmės ir nuorodos. CAMKK2, nuo kalcio/kalmodulino priklausoma proteinkinazės kinazė 2; CDC7, ląstelių dalijimosi ciklas 7; CDH1, kadherinas 1; CREB1, cAMP atsako elementą surišantis baltymas 1; EYA1, akių nėra homologo 1; E2F3, E2F transkripcijos faktorius 3; FRS2, FGF receptoriaus substratas 2; Glut1, gliukozės transporteris 1; IGF1R, IGF1 receptorius; Jag1, dantytas1; MET, mezenchiminis-epitelinis perėjimas; MKNK1, su MAPK sąveikaujanti serino/treonino kinazė 1; PTEN, fosfatazės ir tenzino homologas; PUMA, p53-sureguliuotas apoptozės moduliatorius; p73, naviko baltymas p73; SIX1, sineoculis homeobox homolog 1; TGFBR1, TGF- receptorius 1; WT, Wilms navikas.

Santrauka

Nuo pirminio miRNR atradimo 1993 m. informacijos apie miRNR biogenezę, miRNR ekspresijos reguliavimą ir miRNR funkciją buvo gausu (6, 7). Tai lydėjo vis geresnis supratimas apie tai, kaip miRNR veikia tiek normalioje fiziologijoje, tiek daugelio ligų patofiziologijoje. Tapo aišku, kad miRNR ekspresijos reguliavimas sutrikdo ankstyvą inkstų vystymąsi ir yra susijęs su besivystančių inkstų ligų, tokių kaip CAKUT ir Wilms navikas, patogeneze. Atsižvelgiant į naujausius pokyčius, susijusius su miRNR kaip biomarkerių ir kaip naujų vaistų taikiniais, įžvalgos apie tai, kaip miRNR reguliuoja inkstų vystymąsi ir ligas, yra labai svarbios norint suprasti, kaip jos gali būti panaudotos naujoms šių ligų diagnostikos ir gydymo metodams. Norint visiškai įgyvendinti šias pastangas, būsimi tyrimai, nustatantys specifinių miRNR funkciją inkstų vystymuisi, yra labai svarbūs, be technologijų, skirtų optimizuoti mažų oligonukleotidų terapiją į inkstus.

Padėkos

JH laboratorija remiama NIH Nacionalinio diabeto ir virškinimo bei inkstų ligų instituto dotacijomis (R01DK125015 ir R01DK102843). DMC rėmė nefrozinio sindromo studijų tinklo karjeros plėtros apdovanojimas ir Pitsburgo vaikų ligoninės mokslinių tyrimų konsultacinės tarybos podoktorantūros stipendija. MT rėmė Pitsburgo universiteto vasaros tyrimų stažuočių programa (R25DK119180). Figūros buvo sukurtos naudojant BioRender.com. Adresas: Jacqueline Ho, Nefrologijos skyrius, Pediatrijos skyrius, Pitsburgo UPMC vaikų ligoninė, Rangos tyrimų centras, 4401 Penn Ave., Pitsburgas, Pensilvanija 15224, JAV. Telefonas: 412.692.9440; El. paštas: jacqueline.ho2@chp.edu.

1. Kozomara A ir kt. miRBase: nuo mikroRNR sekų iki funkcijos. Nucleic Acids Res. 2019;47(d1): D155–D162.

2. Friedman RC ir kt. Dauguma žinduolių mRNR yra konservuoti mikroRNR taikiniai. Genome Res. 2009;19(1):92–105.

3. Ghildiyal M, Zamore PD. Mažos nutildančios RNR: besiplečianti visata. Nat Rev Genet. 2009;10(2):94–108.

4. Djuranovičius S ir kt. miRNR sukeltas genų nutildymas transliacinėmis represijomis, po kurio seka mRNR deadenilinimas ir skilimas.

Mokslas. 2012;336(6078):237–240.

5. Huntzinger E, Izaurralde E. Genų nutildymas mikroRNR: transliacinių represijų ir mRNR skilimo įnašas. Nat Rev Genet. 2011;12(2):99–110. 6. Lee RC ir kt. C. elegans heterochroninis genas lin-4 koduoja mažas RNR, turinčias antisensinį komplementarumą lin-14. Ląstelė.