MiR-103a-3p slopinimas pagerina kalcio oksalato nusėdimą žiurkės inkstuose, aktyvindamas UMOD/TRPV5 ašį

Išlaikant pusiausvyrąkalcio (Ca2+) metabolizmasinkstuose yra labai svarbusužkirsti kelią inkstų akmenų susidarymui. Funkciniu požiūriu šiame procese dalyvaujanti mikroRNR (miRNR) turi būti atskleista. Mes sukėlėme NRK{0}}E ląstelių pažeidimągydymas oksalatu. Laikinojo receptorių potencialo katijonų kanalo V nario pošeimos 5 (TRPV5) vaidmuo oksalato sukeltose ląstelėse buvo tiriamas naudojant TRPV5 ekspresijos transfekciją, qRT-PGR, Western blot, MTT ir kristalų adhezijos aptikimą. Nustačius uromodulino (UMOD) ekspresiją pažeistose ląstelėse, patvirtinome TRPV5 ir UMOD sąveiką koimunoprecipitacijos (CoIP) ir ląstelių paviršiaus biotinilinimo tyrimais. Buvo atliktas UMOD reguliuojančio TRPV5 patvirtinimas dėl oksalato sukeltų ląstelių gyvybingumo, kristalų sukibimo ir Ca2+ koncentracijos. Bioinformatikos analizė ir luciferazės tyrimas buvo naudojami nustatant miRNR nukreiptą UMOD. MiR-103a-3p-reguliuojančios UMOD/TRPV5 ašies vaidmuo buvo aptiktas gelbėjimo eksperimentais. Sukūrėme žiurkės modelį su etilenglikoliu (EG), kad ištirtume miR-103a-3p/UMOD/TRPV5 ašį in vivo, dažydami hematoksilinu-eozinu (H&E), Western blot ir imunohistochemija. (IHC). Padidėjęs TRPV5 reguliavimas apsaugojo NRK-52E ląsteles nuo oksalato sukelto pažeidimo, padidindamas ląstelių gyvybingumą ir slopindamas CaOx adheziją. UMOD buvo išeikvotas oksalato sukeltose ląstelėse ir teigiamai sąveikavo su TRPV5. UMOD nutildymas pakeitė TRPV per didelės ekspresijos poveikį oksalato sukeltoms ląstelėms. miR-103a-3p nukreipė į UMOD ir buvo tarpininkaujama reguliuojant UMOD/TRPV5 ašį oksalato sukeltose ląstelėse. Sumažėjęs miR-103a-3p reguliavimas sumažino EG sukeltą CaOxnusėdimas inkstų audiniuosein vivo aktyvuojant UMOD/TRPV5 ašį. miR-103a-3p nutildo pagerintą CaOx nusėdimą žiurkės inkstuose aktyvinant UMOD/TRPV5 ašį.

ŽOLELĖS FORMUOTI, SKIRTANUSODĖJIMAS INKSKTŲ AUDINIUOSE

1. Įvadas

Šlapimo akmenys, vienas iš labiausiaiDažnos urologijos ligos, atsiranda dėl per daug prisotintų kristalų nusodinimo iš šlapimo inkstuose [1]. Nors šlapimo akmenys nėra tokie agresyvūs kaip piktybiniai navikai, dėl didelio sergamumo ir pasikartojimo dažnumo šlapimo akmenys jau seniai daro rimtą poveikį žmonių sveikatai [2]. Tyrimai patvirtino, kad šlapimo akmenų atsiradimas yra daugiafaktorinis ir susijęs su genetika, medžiagų apykaita, aplinkos klimatu ir gyvenimo būdo įpročiais [3, 4]. Kalcio oksalato (CaOx) akmenys sudaro daugumą šios ligos atvejų, o dauguma pacientų, kuriems yra Ca{4}} turinčių akmenų, turi hiperkalciurijos derinį [5]. Fizikiniai ir cheminiai tyrimai patvirtino, kad CaOx įsotinimas šlapime yra susijęs su Ca2+ koncentracija ir kad padidėjęs kalcio kiekis šlapime skatina arba skatina Ca2+- turinčios inkstų akmenligės susidarymą [6]. Inkstų akmenys gali sukelti hipertenziją, lėtinę inkstų ligą ir paskutinės stadijos inkstų ligą. Tyrimai parodė, kad prevencinių priemonių, įskaitant specifines farmakologines intervencijas ir rekomendacijas dėl gyvenimo būdo bei mitybos pokyčių, galima imtis atlikus išsamų medžiagų apykaitos įvertinimą [7, 8]. Įvairūs tyrimai su žmonėmis parodė, kad dietos, kuriose vartojama daugiau daržovių ir vaisių, turi įtakos inkstų akmenligės prevencijai [9–11]. Šiuo metu turėtų būti atliktas nuodugnus hiperkalciurijos, sukeltos nenormalaus kalcio metabolizmo formuojant inkstų akmenis, molekulinio mechanizmo tyrimas.

TRPV5 yra svarbus baltymas, reguliuojantis Ca2+ pernešimą per ląstelių membranas [12]. Inkstų audiniuose TRPV5 daugiausia randamas distaliniuose vingiuotuose kanalėliuose (DCT) ir surinkimo kanalėliuose (CNT), kurie yra atsakingi už Ca2+ reabsorbcijos su šlapimu reguliavimą ir Ca2+ homeostazės palaikymą organizme [13]. . Turimi įrodymai rodo, kad sumažėjusi TRPV5 ekspresija gali būti gyvybiškai svarbus patogeninis veiksnys formuojantis hiperkalciurijai ir Ca{8}} turinčiai inkstų akmenligei [14].

1 lentelė. Pradmenų sekos, naudotos qRT-PGR.

Uromodulinas (UMOD), taip pat žinomas kaip Tamm-Horsfall baltymas, yra gausiausias glikoproteinas šlapime [15], kuris pirmiausia išreiškiamas inkstų kanalėlių epitelio ląstelėse, atliekančiose įvairias fiziologines funkcijas, tokias kaip vandens ir elektrolitų apykaitos balansas, imuniteto reguliavimas. , užkertant kelią inkstų akmenligei ir apsaugant nuo šlapimo takų infekcijų [16–18]. Šiuo metu yra nedaug pranešimų apie specifinį UMOD molekulinį mechanizmą formuojant inkstų akmenis.

MikroRNR (miRNR) yra mažų, nekoduojančių, vienagrandžių RNR molekulių, kurių ilgis yra apie 20–22 nukleotidų, klasė, plačiai paplitusi žinduoliuose [19]. Subrendusios miRNR gali reguliuoti tikslinių genų ekspresiją po transkripcijos, visiškai arba iš dalies komplementariai prisijungdamos prie tikslinės mRNR 3′-UTR, dėl to suardoma arba slopinama baltymų transliacinė sintezė [20]. Kadangi miRNR smarkiai veikia žmogaus fiziologinę veiklą, tokią kaip augimas ir vystymasis, ląstelių apoptozė ir metabolizmas, manoma, kad jos turi didelį pažadą ligų prevencijai ir gydymui [21]. Pastaraisiais metais tyrimai, susiję su miRNR vaidmeniu inkstų akmenų atsiradimui ir vystymuisi, tapo karšta tema [22, 23].

Todėl šis tyrimas ištyrė ryšį tarp UMOD ir TRPV5 užkertant kelią inkstų akmenų susidarymui ir išaiškino miR-103a-3p vaidmenį nukreipiant ir reguliuojant UMOD, padedant geriau suprasti inkstų akmenų patogenezę ir naujų idėjų apie ligos prevenciją ir valdymą.

2. Medžiaga ir metodai

2.1. Ląstelių kultūra ir gydymas oksalatu.

Epitelioidinių žiurkių inkstų ląstelių linija NRK{{0}}E (GNR 8) buvo gauta iš Kinijos tipų kultūros kolekcijos centro (CCTCC) (Šanchajus, Kinija). Kultivavimui paruoštas DMEM (12800017, Gibco, JAV), sumaišytas su distiliuotu vandeniu, 7,5 % NaHCO3 tirpalu (25080094, Gibco, JAV) ir 5 % vaisiaus galvijų serumu (FBS) (BC-SE-FBS02, Bio channel, Kinija). ląstelės inkubatoriuje (37 laipsnių C ir 5 % CO2). Po subkultūros ląstelės buvo indukuojamos atskiestu oksalatu (0,75 mmol/L, 135623, Sigma Aldrich, JAV) 48 valandas (h), kaip aprašyta anksčiau [24]. 2.2. Ląstelių transfekcija. Molekulinio mechanizmo tyrimui naudojama TRPV5-per daug ekspresuojanti plazmidė (Bes-mR-001007572, Ber sinBio, Guangdžou, Kinija), UMOD per daug ekspresuojanti plazmidė (Bes-mR-001278605, BersinBio, Guangdžou, Kinija), maža trukdanti RNR prieš UMOD (siUMOD) (5′-CTCTTT TATCACACTTGATATGA-3′, GenePharma, Šanchajus, Kinija), miR-103a-3p inhibitorius (GenePharma, Šanchajus, Kinija) ir miR-103a-3p mimic (BersinBio, Guangdžou, Kinija) buvo skirtingai transfekuotos NRK- 52E ląstelėse ir buvo nustatyti atitinkami valdikliai. Prieš transfekciją NRK-52E ląstelės buvo kultivuojamos 6-šulinėlių plokštelėje (2 × 106 ląstelės šulinėlyje). Kol buvo pasiekta apie 80 % ląstelių susiliejimo, TRPV5-per daug ekspresuojanti plazmidė, UMOD per daug ekspresuojanti plazmidė, siUMOD, miR-103a-3p inhibitorius arba mimika buvo transfekuota į NRK-52E ląstelės, naudojant lipoic time 2000 (11668019, Invitrogen, JAV) pagal gamintojo protokolą. Po to transfekuotos NRK- 52E ląstelės gavo kiekybinę realaus laiko polimerazės grandininę reakciją (qRT-PGR) ir Western blot kokybei įvertinti, tada buvo apdorotos oksalatu.

2.3. RNR ekstrahavimas ir qRT-PGR.

Bendra RNR ir miRNR iš NRK{0}}E ląstelių buvo išgauta naudojant Cell RNA Kit (19231ES50, Yeasen, Kinija) ir MolPure® Cell/Tissue miRNA Kit (19331ES50, Yeasen, Kinija). Tada HiScript II vieno žingsnio RT-PCR rinkinys (P612-01, „Vazyme“, Kinija) buvo naudojamas reaguojant su ekstraktu pagal naudojimo instrukcijas. Stiprinimo sąlygos buvo nustatytos taip: 50 ° C 30 min., 94 ° C 3 min., po to 30 ciklų (94 ° C 30 s, 60 ° C 30 s ir 72 ° C 40 s). ir 72 laipsnių C 5 min. qRT-PGR buvo atlikta ABI 7500 sistemoje (Applied Biosystems, JAV). Santykinės mRNR ekspresijos buvo analizuojamos 2−ΔΔCt metodu [25], normalizuojant -aktiną arba U6. Visos pradmenų sekos parodytos 1 lentelėje.

2.4. Western Blot.

Bendras baltymų kiekis iš mėginių (NRK-52E ląstelių ir žiurkės inkstų audinių) buvo lizuojamas naudojant RIPA lizės buferį (R0010, Solarbio, Kinija) ir kiekybiškai įvertintas BCA baltymų tyrimo rinkiniu (BI-WB005, Sbjbio, Kinija). Vienodas kiekis baltymų buvo atskirtas 10% natrio dodecilsulfato-poliakrilamido gelio elektroforeze (P0690, Beyotime, Kinija) ir perkeltas ant PVDF membranų (AR0136- 02, Boster, Kinija). Po apdorojimo blokuojančiu buferiu (P0252, Beyotime, Kinija), membranos buvo inkubuojamos su anti-TRPV5 (ab137028, 83 kDa, 1/10000), anti-UMOD (ab207170, 110 kDa, 1/1000) ir anti{ {20}}aktino (ab8226, 42 kDa, 1/1000) antikūnų 4 °C temperatūroje per naktį. Tada antriniai antikūnai, įskaitant anti-triušio IgG (ab97051, 1/2000) ir anti-pelės IgG (ab205719, 1/2000), buvo naudojami membranoms inkubuoti 2 valandas kambario temperatūroje. Santykinis baltymų blotų aptikimas buvo atliktas naudojant iBright Imaging System (CL750, Invitrogen, JAV), naudojant ECL buferį (WBKlS0100, Millipore, JAV) vizualizacijai. - Aktinas buvo vidinė kontrolė.

2.5. Ląstelių gyvybingumo tyrimas.

Ląstelių suspensijos buvo paruoštos, kaip aprašyta šiame tyrime [24]. NRK-52E ląstelės buvo pasėtos į 96-šulinėlių auginimo plokšteles, kurių tankis buvo 5000 ląstelės/šulinėlyje ir 10 μL metiltiazolildifenilo. tetrazolio bromido (MTT) tirpalas (40201ES72, Yeasen, Kinija) buvo naudojamas ląstelėms apdoroti kiekviename šulinyje 37 ° C temperatūroje 4 valandas, po to buvo apdorotas SDS-HCL. Ląstelių gyvybingumui įvertinti optinio tankio (OD) vertė esant 570 nm bangos ilgiui buvo išmatuota mikroplokštelių skaitytuvu (VL0L00D0, Thermo Fisher, JAV).