Baktericidinio / pralaidumą didinančio baltymo (BPIFA1), reguliuojančio žinduolių įgimtą imuninį atsaką, molekulinė evoliucija 1 dalis

Santrauka:

Baktericidinis / pralaidumą didinantis baltymas, pagrindinis žinduolių įgimtos imuninės sistemos veiksnys, dalyvauja natūralioje imuninėje apsaugoje nuo invazinių bakterijų. BPIFA1 aktyviai prisideda prie šeimininko gynybos įvairiais mechanizmais, tokiais kaip antibakterinė, paviršinio aktyvumo medžiaga, kvėpavimo takų paviršiaus skysčių kontrolė ir imunomoduliacinė veikla. Tačiau evoliucijos istorija ir BPIFA1 geno atrankos jėgos žinduoliams adaptacinės evoliucijos metu yra menkai suprantamos. Šiame tyrime buvo tiriamas žmonių BPIFA1 genas, palyginti su kitų žinduolių rūšių genu, siekiant įvertinti selektyvų slėgį, susidariusį dėl prisitaikančios evoliucijos. Norėdami įvertinti, ar įvyko teigiama atranka, naudojome keletą skirtingų galimybių testų (M1 prieš M2 ir M7 prieš M8).

Teigiamai atrinktų vietų proporcijos buvo reikšmingos, o BPIFA1 baltymo loginė reikšmė buvo 93,63. Atrankos serveris buvo naudojamas tame pačiame duomenų rinkinyje, siekiant pakartotinai patvirtinti teigiamą konkrečių svetainių pasirinkimą, naudojant mechaninio ir empirinio derinio modelį, taip suteikiant papildomų įrodymų, patvirtinančių teigiamos atrankos išvadas. Buvo įtikinamų įrodymų apie teigiamus atrankos signalus žinduolių rūšių BPIFA1 genuose, kurie buvo reikšmingesni atrankos ženklams ir signalų kūrimui.

BPIFA1 baltymas, taip pat žinomas kaip LPLUNC1 arba su nosiaryklės karcinoma susijęs genas 6 (NAG6), yra baltymas, labai ekspresuojamas viršutiniuose kvėpavimo takuose ir burnos ertmėje. BPIFA1 baltymas yra glaudžiai susijęs su imunitetu.

Tyrimai parodė, kad BPIFA1 baltymas turi antibakterinį ir imunomoduliacinį poveikį. BPIFA1 baltymas gali prisijungti prie invazinės Escherichia coli ir sunaikinti jos ląstelių membraną, taip atlikdamas antibakterinį vaidmenį. Be to, BPIFA1 baltymas atlieka imunomoduliacinį vaidmenį, aktyvuodamas Toll-like receptorių (TLR) 4 ir TLR2 kelius, skatindamas uždegiminius atsakus, apoptozę ir imuninių ląstelių aktyvavimą.

Ryšys tarp BPIFA1 baltymo ir kvėpavimo takų ligų taip pat buvo plačiai ištirtas. Pavyzdžiui, tyrimai parodė, kad BPIFA1 baltymo ekspresijos lygis sergant kvėpavimo takų ligomis, tokiomis kaip bronchinė astma ir lėtinė obstrukcinė plaučių liga (LOPL), yra glaudžiai susijęs su ligos sunkumu. Ypač esant infekcinėms sąlygoms, BPIFA1 baltymo ekspresijos lygis gali būti žymiai padidintas, taip dalyvaujant kvėpavimo sistemos imuninio atsako ir floros pusiausvyros reguliavime.

Todėl negalima ignoruoti BPIFA1 baltymo vaidmens imuninėje sistemoje, o jo ryšį su kvėpavimo takų ligomis ir infekcijomis reikia toliau nuodugniai ištirti. Todėl imuniteto stiprinimui turime skirti ypatingą dėmesį. Cistanche turi didelį poveikį imuniteto gerinimui. Mėsoje esantys polisacharidai gali reguliuoti žmogaus imuninės sistemos imuninį atsaką, pagerinti imuninių ląstelių atsparumą stresui ir stiprinti imunines ląsteles. baktericidinis poveikis.

Spustelėkite, kad sužinotumėte apie visą maistą

Mes atlikome tikimybių testus, lygindami įvairius modelius, pagrįstus dN / dS santykiais, kad atpažintume konkrečius kodonus esant teigiamam atrankos slėgiui. Mes nustatėme teigiamai parinktas vietas BPIFA1 baltymų LBP-BPI domene žinduolių genome, įskaitant lipidus surišantį domeną, turintį labai didelį selektyvumą DPPC. BPIFA1 aktyvuoja viršutinių kvėpavimo takų įgimtą imuninę sistemą, reaguodamas į daugybę genetinių signalų žinduolių genome. Šios išvados pabrėžia imunoreguliacinio poveikio evoliucinę pažangą, kuri vaidina svarbų vaidmenį žinduolių rūšių antibakterinėje ir antivirusinėje gynyboje.

Raktiniai žodžiai:

BPIFA1; baktericidinis; Imuninė sistema; molekulinė evoliucija; teigiama atranka.

1. Įvadas

Baktericidinį pralaidumą didinantis baltymas (BPI) yra labai efektyvus antimikrobinis baltymas, kuris suriša ir neutralizuoja lipopolisacharidus, išsiskiriančius iš išorinės bakterijų membranos [1]. Yra žinoma, kad BPI raukšlių turintis šeimos A nario 1 (BPIFA1) genas turi įtakos vietinei imuninei sistemai, ir šis poveikis gali turėti įtakos mikroorganizmų augimui ir invazijai [2]. Vienas iš galimų mechanizmų, kuriais grindžiamas šis ryšys, yra BPIFA1 gebėjimas padidinti bakterijų įsisavinimą fagocitinėse ląstelėse ir jų gebėjimą jas sunaikinti [3].

Nors jų sekų panašumas yra minimalus, BPI turi du domenus, turinčius tą pačią struktūrinę raukšlę [1, 4]. Invazinės gramneigiamos bakterijos sukelia integruotą šeimininko atsaką, kurį palengvina lipopolisacharidą surišantis baltymas (LBP). LBP yra endotoksiną surišantis baltymas, glaudžiai susijęs ir suderintas su BPI [5]. BPIFA1 kontroliuoja gleivinės mikrobiotą ir pradinį interferono signalizavimą. SPLUNC1 (anksčiau žinomas kaip BPIFA1) yra baltymų raukšlių turintis šeimos narys, pasižymintis antibakterine, paviršinio aktyvumo medžiaga ir imunomoduliuojančia veikla – visa tai prisideda prie šeimininko apsaugos. Kvėpavimo sistema yra pagrindinė jos išraiškos vieta [6]. SPLUNC1, žmogaus PLUNC geno homologas, turi tokį patį ekspresijos modelį viršutiniuose kvėpavimo takuose ir nosiaryklės srityse kaip ir pelės homologas. Antibakterinį poveikį gramneigiamoms bakterijoms rodo užkoduotas antimikrobinis baltymas [5]. Esant nesmulkialąsteliniam plaučių vėžiui, jis gali būti potencialus molekulinis žymeklis mikrometastazei nustatyti. Keli transkripto variantai buvo atrasti dėl alternatyvaus 3' neverčiamo regiono sujungimo; tačiau suprantamas tik trijų iš šių nuorašo variantų viso ilgio pobūdis [7].

Tiek pelėms, tiek žmonėms būdingas didelis BPIFA1 geno ekspresijos lygis viršutinėje trachėjos dalyje, tačiau ši ekspresija mažėja tolstant nuo trachėjos, iki minimumo pasiekdama pagrindinio stiebo bronchų išsišakojimą ir tampa neaptinkama plaučių periferijoje. [8]. Išsamūs genų ekspresijos tyrimai su pelėmis ir žmonėmis nepadėjo aptikti BPIFA1 periferiniame plaučių audinyje [9]. Išskyrus labai žemą BPIFA1 mRNR ekspresijos lygį pelės užkrūčio liaukoje, žiurkės širdyje ir uoslės gleivinėje, BPIFA1 nėra ekspresuojamas jokiuose organuose ar audiniuose už graužikų kvėpavimo sistemos ribų [10]. Nėra jokių požymių, kad BPIFA1 mRNR yra bet kuriame iš šių žmogaus audinių: širdyje, kepenyse, smegenyse, skrandyje, plonojoje žarnoje, placentoje, skeleto raumenyse, kasoje, blužnyje, normaliuose limfmazgiuose, periferiniuose limfocituose, prostatoje, sėklidėse ar kiaušidės [11].

BPIFA1 mRNR ekspresija atitinka pasiskirstymo modelį, kuris yra labai panašus į embriono ir suaugusiųjų audinius. Šis modelis stebimas abiejų tipų audiniuose [1]. Per didelis BPIFA1 ekspresija transgeninėse pelėse sukūrė alveolinius makrofagus su sustiprinta anglies nanovamzdelių opsonizacija ir fagocitoze kontroliuojamo kvėpavimo takų uždegimo modelyje [12]. Be to, buvo įrodyta, kad komensalinės gramneigiamos nanobakterijos kartu su BPIFA1 lokalizuojasi nosiaryklės vėžio audinių epitelio ląstelėse [13]. Mėginiai buvo paimti iš pacientų, kuriems anksčiau buvo nustatyta nosiaryklės karcinoma. Neseniai atlikto tyrimo rezultatai rodo, kad BPIFA1 ir nebakterinio LPS sąveika gali sušvelninti organizmo uždegiminį atsaką, kurį sukelia ne bakterinė LPS. [1].

Jo antibakterinio poveikio diapazonas ir jo struktūros išsaugojimas oru kvėpuojantiems stuburiniams reiškia, kad BPIFA1 išsivystė taip, kad užtikrintų esmines šeimininko apsaugos galimybes [14]. Tačiau dėl savo buvimo proksimaliniuose kvėpavimo takuose ir aukšto lygio bazinėmis sąlygomis BPIFA1 gali būti būtinas. Taip yra todėl, kad gyvūnuose yra daug antimikrobinių efektorių [15]. Todėl atrodo, kad BPIFA1 turi didžiausią poveikį siekiant išvengti infekcijos ir ją išvalyti prieš patogenų invaziją. Dėl šių funkcijų galima išvengti bakterinių infekcijų kvėpavimo sistemoje, kurios gali signalizuoti apie imuniteto suaktyvėjimą ir pagerėjusį kitų kvėpavimo takų funkcijų reguliavimą [15].

Manoma, kad prisitaikančius pokyčius, reaguojančius į aplinkos poreikius, riboja biofiziniai veiksniai, tačiau jokia evoliucijos teorija negali numatyti vietovių, kuriose vyksta prisitaikantys pokyčiai, struktūrinių aspektų [16]. Taip yra todėl, kad biofiziniai apribojimai riboja pakeitimų tipus, kurie leidžiami baltymų funkcijai palaikyti [17]. Teigiama atranka gali būti labiau paplitusi tose baltymų dalyse, kuriose tikimasi, kad mutacijos turės mažesnį poveikį nei kitose baltymo dalyse, nors tai nebuvo įrodyta (pvz., alosterinės reguliavimo vietos) [18]. Tačiau tikimasi, kad funkciniai regionai išliks iš esmės konservuoti evoliucijos metu, nors adaptyvūs pokyčiai yra susiję su greitu palankių mutacijų fiksavimu [19]. Baltymų sekų molekulinei evoliucijai didelę įtaką daro natūralios atrankos procesas.

Naujausi genomo sekos nustatymo ir patikimų išvadų nustatymo metodai filogenetiniu ir populiacijos lygiu leido greitai ir patikimai įvertinti natūralios atrankos nulemtus evoliucijos greičius ir adaptacijas [20]. Tiek filogenetiniu, tiek populiacijos lygiu buvo atlikta daug darbo kuriant išvadų metodus. Be to, didėjantis baltymų struktūrinių ir funkcinių duomenų prieinamumas leido tyrėjams ištirti struktūrinių ir funkcinių suvaržymų poveikį baltymų sekų evoliucijai ir adaptacijai [16]. Dėl struktūrų ir funkcijų nustatytų apribojimų įvairių baltymų ir vietų tame pačiame baltyme evoliucijos ir prisitaikymo greitis skiriasi [19].

Didžioji dalis ląstelės funkcijų yra glaudžiai susipynusios su genų ekspresijos reguliavimo tinklais, kurie leidžia organizmams toleruoti didesnį infekcijų lygį arba sušvelninti tų infekcijų poveikį [21]. Dauguma komponentų, sudarančių ląstelių fiziologiją, yra glaudžiai susiję su šiomis genų ekspresijos reguliavimo sistemomis, kurios dažnai yra senos evoliucinės adaptacijos [22]. Šie mechanizmai sukėlė didelį susidomėjimą tyrimais, kuriuose buvo naudojamas ribotas modelių rūšių, apie kurias yra prieinama genetinė informacija, rinkinys [23]. Tačiau mažai žinoma apie mechanizmus, kurie paskatino šių sistemų evoliuciją arba kaip jos prisitaikė prie įvairių aplinkos sąlygų vystantis.

Šiuo tyrimu siekiama ištirti BPIFA1 geno evoliucinę kilmę, atskleisti jo fizikines ir chemines savybes ir taikyti lyginamąją genomiką, kad būtų galima įvertinti geną įvairiose žinduolių rūšyse. Atlikome nuodugnius lyginamuosius baktericidinio / pralaidumą didinančio baltymo (BPIFA1) geno, kuris reguliuoja žinduolių įgimtą imuninį atsaką, tyrimus, kad geriau suprastume, kaip šie genai veikia. Yra tikimybė, kad selektyvus spaudimas turės reikšmingos įtakos prisitaikymo evoliucijai. Šiame tyrime tiriame šių genų istoriją įvairiose stuburinių gyvūnų rūšyse, taip pat kaip genetinė įvairovė ir natūrali atranka turėjo įtakos šios genų šeimos raidai laikui bėgant.

2. Medžiagos ir metodai

2.1. Sekos paieška ir analizė

BPIFA1 geno aminorūgščių ir koduojančių nukleotidų sekos 34 žinduolių rūšyse, įskaitant žmones kaip etalonines rūšis šiame tyrime, buvo surinktos iš GenBank (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank, pasiekiama 20 d. 2021 m. rugsėjo mėn.), ir jie buvo suderinti naudojant MEGA 6 programinės įrangos įrankį Clustal Omega [24]. Didžiausios tikimybės metodas buvo naudojamas MEGA 6 programinėje įrangoje, siekiant sukurti BPIFA1 geno filogenetinį medį. Šis medis buvo sukurtas remiantis evoliuciniais genų ryšiais. „Bootstrap“ testas apskaičiavo vidutinį pakeitimų skaičių vienoje vietoje ir vidutinį šakos ilgį, taikydamas didžiausios tikimybės metodą su 1000 pakartojimų, kad būtų galima nustatyti taksonominį grupavimą. Šis metodas buvo naudojamas topologijai parinkti sudėtingesnėms log-tikimybės reikšmėms [25, 26]. Rūšių pavadinimai ir prisijungimo numeriai, naudojami tiriant BPIFA1 geną, pateikti papildomoje S1 lentelėje.

2.2. Atrankos analizė

Didžiausios tikimybės metodai buvo naudojami lyginant kiekvienos kodono vietos dN/dS santykį, siekiant nustatyti specifinius kodonus žinduolių BPIFA1 genų sekose, kurioms taikoma teigiama atranka [27, 28]. Analizei buvo panaudotas PAML [29] ir DATA MONKEY žiniatinklio serverio DATA MONKEY (https://www.datamonkey.org, pasiekiamas 2021 m. rugsėjo 29 d.) [30] vykdomas CODEML, o rezultatai buvo nustatyti naudojant kodonų, kurie buvo daug didesni nei 1 kodonams, kurių atranka buvo teigiama. Pradinis šio tyrimo žingsnis buvo nustatyti, ar įvyko teigiama atranka, naudojant didžiausio tikimybės santykio testą.

Ši analizė nustatė, kad yra vietų, kurių dN/dS santykis didesnis nei vienas. Šiame tyrime mes palyginome diskretišką (bendrą) modelį, kuris atliko šią funkciją, su nuliniu modeliu, kuris uždraudė svetainių, kurių reikšmė didesnė nei 1, atsiradimą [31]. Analizės buvo palygintos naudojant tikimybių žurnalo (2∆l) skirstinį su df=4. Nulinė hipotezė (M7) teigė, kad pasiskirstymą riboja reikšmės 0 ir 1. Alternatyvus modelis (M8) su dviem parametrais, omega (ω) ir beta ( ), leidžia išvesti reikšmę iš duomenų rinkinį, kuris gali būti didesnis nei 1 [27]. Analizė, naudojant fiksuoto poveikio tikimybę (FEL), vienos tikimybės protėvių skaičiavimą (SLAC) ir atsitiktinio poveikio tikimybę (REL), nustatė, kad BPIFA1 genas buvo teigiamai atrinktas, kai buvo lyginamos pasaulinės sinoniminių ir nesinoniminių skirtumų vertės kiekvienoje vietoje. [32].

Antrasis etapas buvo panaudoti didžiausią tikimybę, kad būtų galima rasti aminorūgščių pozicijas, kurios buvo teigiamos atrankos objektas evoliucijos metu. Šiam tikslui pasiekti buvo panaudota Bayes teorema, numatanti vietų, kurioms taikoma teigiama atranka, užpakalines tikimybes. Teigiama atranka buvo pastebėta veikiant aminorūgščių vietose, o užpakalinė tikimybė svyravo nuo 95 iki 99 procentų [33]. Aminorūgščių likučiams, kurių vertė buvo didesnė už vieną, buvo atlikta atrankinė procedūra. Šveicarijos modelis ir Phyre 2 (http://www.sbg.bio.ic.ec.k/pyre/html, pasiekiami 2021 m. rugsėjo 28 d.) yra žiniatinklio programos, rodančios palankiai parinktų aminorūgščių vietas baltymų struktūrose. [34].

Numatėme evoliucinio nukleino rūgščių ir aminorūgščių išsaugojimo vietą baltyme naudodami ConSurf įrankį (http://consurftest.tau.ac.il, pasiekiamas 2021 m. rugsėjo 28 d.), kuris buvo pagrįstas filogenetiniu ryšiu tarp sekų. 35]. Išlyginto BPIFA1 kodono seka buvo ištirta Selecton 2.2 versijoje (http://secton.tau.ac.il, pasiekiama 2021 m. rugsėjo 28 d.), kuri leidžia nustatyti skirtingus įvairių kodonų santykius suderintose sekose. Šie santykiai buvo išmatuoti naudojant Bajeso išvadų metodą, atliekant įvairius tikimybės testus. Tai buvo atlikta siekiant patvirtinti teigiamai atrinktus kodonus [36]. Be to, atrankos rezultatai buvo rodomi įvairiomis spalvomis, nurodant įvairius atrankos kriterijus.

2.3. Rekombinacijos analizė

Norėdami rasti rekombinacijos įrodymų, atlikome modelio atrankos procedūrą, pagrįstą statistine tikimybe, kuri gali perskaityti daugybę sekų derinimo, ieškant lūžio taškų ir aptikti tikėtiną rekombinantinę DNR. Šis metodas naudojo genetinį algoritmą kelių sekų derinimui ieškoti rekombinacijos lūžio taškų, kad būtų pasiektas tikslas. GARD metodas yra lengvai suvokiamas, lengvai išplečiamas ir labai lygiagretinamas. Išsamūs modeliavimo eksperimentai parodė, kad metodas beveik visais atvejais lenkia kitus dabartinius įrankius, ypač dėl tikslumo.

Norint ištirti rekombinacijos įrodymus, pirmiausia buvo įvertintos nukleotidų sekos, siekiant nustatyti haplotipus (Na) ir įvertinti polimorfines vietas (S), vidutinį nukleotidų skirtumų skaičių (K) ir nukleotidų įvairovę (π), naudojant DnaSP 5.10 programinę įrangą [37]. ]. Lūžio taškų aptikimas ir rekombinantinių signalų įvertinimas nukleotidų sekose buvo atliktas naudojant Datamonkey žiniatinklio serverio internetinį GARD įrankį [38]. Be to, naudojant GARD sekų rekombinacijai tikrinti, užtikrinama, kad metodai, skirti nustatyti teigiamą atranką, turi priimtinų statistinių savybių.

2.4. Baltymų ir baltymų sąveikos analizė

Didelis susidomėjimas buvo nukreiptas į tyrimą, kaip baltymų ir baltymų sąveika išsaugoma iš vienos rūšies į kitą. Kadangi eksperimentiškai identifikuojant ir patvirtinant sąveikos duomenis yra keletas kliūčių, būtų įdomu suprasti PPI, perkeltą iš rūšies, kuri buvo įrodyta kitose rūšyse [39]. STRING duomenų bankas yra nemokamas bioinformatikos šaltinis, kuriame yra informacijos, apibūdinančios, kaip baltymai sąveikauja vienas su kitu keliuose keliuose. Linijų, jungiančių kiekvieną baltymo mazgą, skaičius ir tarpų reikšmės yra naudojami tarpiniams mazgams, atstovaujantiems baltymams, kurie atlieka svarbų biologinį vaidmenį ir yra glaudžiai susiję vienas su kitu, identifikuoti. Tinklas buvo sukurtas naudojant STRING, o tinklui rodyti buvo panaudota programinė įranga Cytoscape (http://www.cytoscape.org, pasiekiama 2021 m. rugsėjo 29 d.) [40]. Nustačius BPIFA1 baltymų ir baltymų sąveiką tarp imuninių baltymų ir bendros ekspresijos analizę naudojant STRING 9.1 versiją (http://www.string-db.org, gauta 2021 m. rugsėjo 29 d.), galėjome toliau nustatyti, kaip veikia BPIFA1 molekuliniu lygiu.

2.5. BPIFA1 baltymo struktūrinė analizė

Šioje analizėje mes sukūrėme žmogaus BPIFA1 baltymo kristalinę struktūrą naudodami homologijos modeliavimą su internetiniais įrankiais, tokiais kaip Šveicarijos modelis (http://swissmodel.expasy. org, pasiekiamas 2021 m. rugsėjo 29 d.) [41], I-TESSAR [42] ir Phyre2 (http://www.sbg. bio1.ic.ac.uk/phyre2/html, pasiekta 2021 m. rugsėjo 29 d.) [43]. Surinktam tiksliniam baltymui sumažinti buvo naudojamas konjuguoto gradiento metodas ir Gintaro jėgos laukas UCSF Chimera 1.10.1 programinėje įrangoje. Be to, numatomos struktūros stereocheminėms savybėms įvertinti buvo naudojamas ProSA žiniatinklio serveris [22].

For more information:1950477648nn@gmail.com