Bu-Shen-Huo-Xue ekstrakto neuroprotekcinis poveikis nuo didelės gliukozės sukeltos apoptozės PC12 ląstelėse

Daugiau informacijos:ali.ma@wecistanche.com

Shao-Yang Zhao, Xin Dong, Peng-Fei Tu, Ke-Wu Zeng, Xue-Mei Wang

1Tradicinės ir Vakarų medicinos integracijos tyrimų studija, pirmoji ligoninė, Pekino universitetas, Pekinas, Kinija.

2Valstybinė pagrindinė natūralių ir biomimetinių vaistų laboratorija, Farmacijos mokslų mokykla, Pekino universitetas, Pekinas, Kinija.

Pabrėžia

Didelio gliukozės (HG) sukeltas neurotoksiškumas yra susijęs su patologijadiabetikamsencefalopatija (DE). Mūsų tyrime rodomas Bu-Shen-Huo-Xue ekstraktas (BSHX), daugiažolių formulė.neuroprotekcinisaktyvumas HG sukeltose PC12 ląstelėse ir galimi mechanizmai gali būti susiję su reaktyviųjų deguonies rūšių (ROS) susidarymo slopinimu, taip pat su mitochondrijų sukeltos kaspazės ir JNK / p38 MAPK signalizacijos keliais. Šis tyrimas yra perspektyvus agentas DE gydymui klinikiniais tikslais.

Spustelėkite, kad pamatytumėte cistanche ekstrakto naudą ir Cistanche inkstams

Cistancheyra gerai žinoma tonizuojanti žolė, galinti maitinti ir apsaugotiinkstus. Tradicinės kinų medicinos teorijojeCistancheyra geriausia žolėinkstus.Cistancheyra daug echinakozido, akteozido ir flavonoidų. Šie veiksmingi ingredientaiCistanchegali sumažintiinkstasląstelių apoptozę ir padidėjimąinkstasląstelių proliferacija. Todėl,Cistancheyranatūralus inkstų papildas.

Abstraktus

Tikslas: Ištirti Bu-Shen-Huo-Xue (BSHX) ekstrakto, daugiažolių formulės, neuroprotekcinį poveikį prieš didelės gliukozės (HG) sukeltą neurotoksiškumą PC12 ląstelėse. Metodai: atliktas ląstelių gyvybingumo tyrimas, laktato dehidrogenazės (LDH) tyrimas, reaktyviųjų deguonies rūšių (ROS) aptikimas, Hoechst 33258, akridino apelsino (AO) / etidžio bromido (EB) dvigubas dažymas ir mitochondrijų membranos potencialo (MMP) tyrimas. Be to, Bax, Bcl-2, kaspazė-3, suskaidyta kaspazė-3, PARP, suskaidyta PARP, citochromas c ir mitogeno aktyvuotos baltymų kinazės (MAPK) buvo aptiktos Western blot metodu. Rezultatai: BSHX ekstraktas padidino ląstelių gyvybingumą ir sumažino LDH nutekėjimą priklausomai nuo koncentracijos HG sukeltose PC12 ląstelėse. Be to, BSHX ekstraktas sumažino tarpląstelinės ROS lygį, padidino mitochondrijų membranos potencialą, reguliavo Bax ir Bcl -2 ekspresiją ir slopino citochromo c išsiskyrimą iš mitochondrijų. Be to, BSHX ekstraktas susilpnino kaspazės -3 ir PARP aktyvavimą ir slopino c-Jun N-galinės kinazės (JNK) ir p38 MAPK fosforilinimą. Išvada: BSHX ekstraktas turėjo reikšmingą neuroprotekcinį poveikį HG sukeltai apoptozei PC12 ląstelėse. Šis poveikis gali būti susijęs su ROS susidarymo slopinimu, taip pat su mitochondrijų sukeltų kaspazės ir JNK / p38 MAPK signalizacijos takų slopinimu.

Raktiniai žodžiai:diabetinė encefalopatija, tradicinė kinų medicina, Bu-Shen-Huo-Xue ekstraktas,neuroprotekcinis, didelis gliukozės kiekis

Santrumpa: AO: akridino apelsinas; BSHX: Bu-Shen-Huo-Xue; DE: diabetinė encefalopatija; DM: cukrinis diabetas; DMSO: dimetilsulfoksidas; EB: etidžio bromidas; ERK: Ekstraląstelinės reguliuojamos baltymų kinazės; HG: didelis gliukozės kiekis; JNK: c-Jun N-galo kinazė; LDH: laktato dehidrogenazė; MAPK: mitogeno aktyvuotos baltymų kinazės; MWP: Wu-Zi-Yan-Zong receptas; MTT: 3-[4, 5-dimetiltiazol-2-il] 2, 5-difeniltetrazolio bromidas; PBS: fosfatinio buferio fiziologinis tirpalas; PBST: fosfatiniu buferiniu tirpalu, 0,1 proc. Tween 20; ROS: reaktyviosios deguonies rūšys; T2DM: 2 tipo cukrinis diabetas; TCM: tradiciniai kinų medicina

Fonas

Pastaraisiais metais diabetinė encefalopatija (DE), cukrinio diabeto (DM) komplikacija, pasireiškianti centrinėje nervų sistemoje (CNS), sulaukė didelio dėmesio. DE gali būti siejama su keliais rizikos veiksniais, tokiais kaip diabeto amžius, trukmė ir glikemijos kontrolė [1, 2]. Klinikinės DE apraiškos yra morfologiniai ir fiziologiniai smegenų pokyčiai ir dėl to atsirandantys pažinimo sutrikimai. Hiperglikemija, oksidacinis stresas ir lėtinis uždegimas gali būti svarbios patogeninės DE priežastys [3]. Nors vis daugiau eksperimentų parodė, kad ilgalaikė ilgalaikė hiperglikemija gali pagreitinti smegenų senėjimą, tiksli DE patogenezė nėra ištirta.

Apoptozė yra užprogramuota ląstelių mirtis, kurią kontroliuoja genai, siekiant išlaikyti mikroaplinkos stabilumą. Apoptozėje dalyvaujantys baltymai apima Bcl-2 šeimą, kaspazes, p53 ir kt. Bcl-2 šeima skirstoma į dvi kategorijas: viena skatina ląstelių mirtį, pvz., Bax, o kita – atspari apoptozei. pvz., Bcl-2. Jie gali reguliuoti apoptozę per kaspazės signalizacijos kelią, kuris yra negrįžtamo baigtinio kaspazės hidrolizės substrato kaskadinė amplifikacijos reakcija [4-6]. Be to, tyrimai parodė, kad didelės gliukozės (HG) sukelta apoptozė yra susijusi su mitochondrijų disfunkcija, DNR pažeidimu ir per dideliu reaktyviųjų deguonies rūšių (ROS) gamyba [7]. Diabetu sergančių pelių tyrimas parodė, kad adenozino 5'-monofosfato (AMP) aktyvuota baltymų kinazė (AMPK), intraląstelinis energijos ir streso receptorius, gali slopinti ROS sukeltą apoptozę. Be to, vis daugiau įrodymų parodė, kad mitogeno aktyvuotų baltymų kinazių (MAPK) slopinimas gali būti naudingas slopinant neuronų apoptozę. Kita ataskaita parodė, kad c-Jun N-galo kinazė (JNK), ekstraląstelinės reguliuojamos baltymų kinazės (ERK), p38 MAPK signalizacijos keliai gali reguliuoti neuronų apoptozę [8, 9].

Remiantis tradicinės kinų medicinos teorija,inkstasesencijos trūkumas ir kraujo sąstingis laikomi pagrindine DE patogeneze. Todėl maitinimosi strategijainkstusir aktyvuojantis kraujas dažniausiai naudojamas DE klinikiniams tikslams. Ankstesni tyrimai galėjo patvirtinti, kad modifikuotas Wu-Zi-Yan-Zong receptas (MWP), receptas, skirtas maitinti.inkstus, gali pagerinti pažinimo sutrikimus ir apsaugoti neuronus, mažindamas A toksiškumą [10, 11]. Bu-Shen-Huo-Xue (BSHX) receptas, į kurį dedama dėlės pagal MWP, yra specialiai sukurtamaitintiinkstusir aktyvuoti kraują. Neseniai atlikti tyrimai parodė, kad BSHX receptas gali pagerinti DM pacientų atminties pablogėjimo sindromą, o tai rodo galingas neuroprotekcines savybes [12]. Tačiau išsamus BSHX farmakologinis mechanizmas lieka neaiškus. Šiame tyrime siekiame stebėti apsauginį BSHX ekstrakto poveikį HG sukeltoms PC12 ląstelėms ir ištirti galimus molekulinius mechanizmus.

Metodai

Medžiagos ir reagentai

Visos žolelės buvo įsigytos iš Kang Ren Tang Chinese Medicine Co., Ltd. (Pekinas, Kinija) ir patvirtintos farmakognosisto dr. PF Tu pagal Kinijos farmakopėją (KLR farmakopėjos komisija, 2010 m.). 3- [4, 5-Dimetiltiazol-2-il] 2, 5-difeniltetrazolio bromidas (MTT) buvo iš Sigma Chemical Co. (Saint Louis, MO, JAV). Laktato dehidrogenazės (LDH) tyrimo rinkinys buvo įsigytas iš Nanjing Jiancheng Bioinžinerijos instituto. (Nandzingas, Jiangsu, Kinija). Akridino apelsino (AO) / etidžio bromido (EB) dvigubų dėmių rinkinys ir Hoechst 33258 buvo gauti iš Solar Co., Ltd. (Pekinas, Kinija). Mitochondrijų membranos potencialo tyrimo rinkinys su JC-1, 2, 7-dichlorfluoresceino diacetatu (DCFH-DA) buvo įsigytas iš Beyotime Institute of Biotechnology (Šanchajus, Kinija). Pirminiai antikūnai prieš kaspazę-3, suskaidytą kaspazę-3, PARP, suskaidytą PARP, citochromą C, Bax, Bcl-2, p38, p-p38, ERK, p-ERK, JNK, p -JNK ir -tubulinas buvo gauti iš Cell signaling Technology (Bostonas, MA, JAV).

BSHX ekstrakto paruošimas

BSHX susideda iš septynių vaistinių komponentų (1 lentelė). BSHX ekstrakto paruošimui: Tsizi (Cuscuta Chinensis Lam.), Gouqi (Lycium barbarum L.), Fupenzi (Rubus chingii Hu), Wuweizi (Schizandra Chinensis (Turcz.) Baill.), Cheqiancao (Plantago Asiatica L.), Shuizhi Hirudo nipponica Whitman.) ir Yinyanghuo (Epimedium brevican Maxim.) buvo sumaišyti santykiu 8:8:4:1:2:1:8 ir panardinti į bendrą 10 kartų (v/w) distiliuotą vandenį 30 min. , po to virinama 1 val. ir vėl virinama 1 val. bendrame 5 kartus (v/w) distiliuotame vandenyje. Supernatantai buvo sujungti ir išdžiovinti liofilizuojant. Galutinis džiovintas ekstraktas sudarė 25 procentus (m/m) žalių žolelių svorio, o čekio pavyzdys buvo deponuotas Šiuolaikiniame tradicinės kinų medicinos tyrimų centre, Pekino universiteto sveikatos mokslų centre, Pekine, Kinijoje.

Ląstelių kultūros

Žiurkių feochromocitomos ląstelių linijos (PC12 ląstelės) buvo gautos iš Pekino sąjungos medicinos koledžo ląstelių banko (Pekinas, Kinija) ir auginamos Dulbecco modifikuotoje erelio terpėje (DMEM) (Macgene, Pekinas, Kinija), papildytos 10 procentų galvijų vaisiaus serumu (Biowest, Prancūzija). ) ir 1 proc. penicilino-streptomicino (100×, Macgene, Pekinas, Kinija) drėgname inkubatoriuje, kuriame yra 95 procentai oro ir 5 procentai CO2 37 laipsnių temperatūroje.

Mėginio apdorojimas

Preliminariame bandyme PC12 ląstelės buvo apdorotos tik BSHX ekstraktu (20, 50, 100 mg/l) 48 valandas, kad būtų įvertintas citotoksiškumas. BSHX ekstrakto neuroprotekcinio poveikio nuo didelio gliukozės (HG) sukelto neurotoksiškumo analizei PC12 ląstelės buvo kartu apdorotos BSHX ekstraktu (20, 50, 100 mg/l) ir HG (75 mM) 48 valandas, po to buvo atliktas MTT tyrimas. ląstelių gyvybingumui. Visi kiti tyrimai buvo atlikti tomis pačiomis sąlygomis, kai BSHX ekstrakto koncentracija buvo nuo 20 iki 100 mg/l.

Ląstelių gyvybingumo tyrimas

PC12 ląstelės buvo pasėtos į 96-šulinėlių plokšteles, kurių tankis buvo 3,5 × 103 ląstelės vienoje duobutėje. Po 48 valandų inkubacijos su BSHX ekstraktu (su arba be HG), supernatantas buvo pašalintas ir pridėtas MTT tirpalas (0, 5 mg / ml). Po inkubacijos 37 laipsnių temperatūroje 4 valandas, MTT tirpalas buvo pašalintas ir ląstelės buvo ištirpintos dimetilsulfokside (DMSO) kratant 5 minutes. Optinis tankis (OD) buvo matuojamas esant 570 nm, naudojant mikroplokštelių skaitytuvą. Ląstelių gyvybingumas (procentais )=[OD (gydymas) – OD (tuščias)]/ [OD (neapdorota kontrolė) – OD (tuščia)] × 100 procentų .

LDH tyrimas

PC12 ląstelės buvo kultivuojamos ir stimuliuojamos gydyti HG ir BSHX ekstraktu, kaip aprašyta anksčiau. Tada iš ląstelių išsiskyręs LDH buvo aptiktas naudojant komercinį LDH rinkinį pagal gamintojo instrukcijas. Sugertis matuota esant 450 nm. LDH (U/L)=[OD (gydymas) – OD (tuščias)] / [OD (standartinis) – OD (tuščias)] × 0,2 (mmol/L) × 1000.

Hoechst 33258 dažymas ir AO/EB dažymas

Dažant Hoechst 33258, ląstelės buvo fiksuotos 4 procentais paraformaldehidu 30 min. Tada ląstelės tris kartus plaunamos fosfatiniu buferiniu fiziologiniu tirpalu (PBS) ir inkubuojamos su Hoechst 33258 darbiniu tirpalu (1 ug/ml) tamsoje 30 min. kambario temperatūroje. Vaizdai buvo užfiksuoti naudojant fluorescencinį mikroskopą (IX73, Olympus, Japonija), kai sužadinimo bangos ilgis yra 352 nm / emisijos bangos ilgis 461 nm. Norėdami dažyti AO/EB, išimkite terpę iš 96-šulinėlių plokštelių ir įpilkite AO/EB mišinio (100 ug/mL AO ir 100 ug/mL EB mišinio) 5 minutes tamsoje kambario temperatūroje. Tada ląstelės buvo plaunamos PBS 3 kartus. Ląstelės buvo vizualizuotos naudojant fluorescencinį mikroskopą, kai sužadinimo bangos ilgis yra 490 nm / emisijos bangos ilgis 530 nm AO dažymui ir sužadinimo bangos ilgis 520 nm / emisijos bangos ilgis 590 nm EB dažymui.

Intraląstelinis ROS aptikimas

Intraląsteliniam ROS aptikimui PC12 ląstelės buvo pasėtos į 5 × 105 tankio šulinėlių plokšteles ir 24 valandas apdorotos HG ir BSHX ekstraktu. Po 24 valandų inkubacijos PC12 ląstelės buvo plaunamos serumo neturinčia Dulbecco modifikuota erelio terpe 3 kartus ir supilamos į 10 μΜ 2', 7'-dichlorfluoresceino diacetatą (DCF-DA), kuris oksiduojamas iki fluorescencinio 2', 7'-dichlorfluoresceino. (DCF) hidroperoksidais, 37 laipsnių temperatūroje 30 minučių tamsoje. Tada ląstelės 3 kartus plaunamos šaltu PBS ir resuspenduojamos PBS. Tarpląstelinis ROS lygis buvo aptiktas išmatuojant vidutinį fluorescencijos intensyvumą srauto citometrija (BD FACSCaliburTM, JAV). Sužadinimo / emisijos bangos ilgiai buvo 488/525 nm. Viename pavyzdyje buvo suskaičiuota mažiausiai 10,{23}} įvykių. Vertės buvo išreikštos kaip vidutinė absorbcija, normalizuota pagal kontrolinės vertės procentinę dalį.

Mitochondrijų membranos potencialo tyrimas

Mitochondrijų depoliarizacija buvo įvertinta naudojant komercinį JC-1 tyrimo rinkinį. Po apdorojimo HG ir BSHX ekstraktu ląstelės buvo inkubuojamos su JC -1 darbiniu tirpalu (1 ×) 37 laipsnių temperatūroje 15 minučių tamsoje. Tada pašalinkite supernatantą ir 2 kartus nuplaukite ląsteles JC-1 buferiniu tirpalu (1 ×). Ląstelės buvo vizualizuotos naudojant fluorescencinį mikroskopą, kai JC-1 monomero sužadinimo bangos ilgis yra 460 nm/emisijos bangos ilgis 530 nm (aptiktas ląstelėse su depoliarizuotomis mitochondrijomis), o sužadinimo bangos ilgis 520 nm/emisijos bangos ilgis JC-1 590{nm. }} polimeras (esantis poliarizuotose mitochondrijose). Buvo laikoma, kad ląstelės, turinčios žalią (monomerinę) fluorescenciją, turi depoliarizuotų mitochondrijų; buvo manoma, kad ląstelės, turinčios raudoną (polimerinę) fluorescenciją, turi normalias mitochondrijas.

Western blot analizė

PC12 ląstelės buvo surinktos ir lizuotos šaltame RIPA buferyje su 1 × kokteilio proteazės inhibitoriumi. Supernatantas buvo surinktas centrifuguojant dideliu greičiu 12, 000 aps./min. 10 min. 4 laipsnių temperatūroje. Baltymų koncentracija buvo nustatyta Bradfordo tyrimu. Citozolio ir mitochondrijomis praturtintos frakcijos buvo išskirtos naudojant Mitochondria Isolation Kit (Pierce, Rockford, JAV) citochromo c analizei. Kitų baltymų atveju visi ląstelių lizatai buvo atskirti SDS-PAGE (10 proc. -15 proc.) ir perkelti į polivinilideno fluorido (PVDF) membranas. Tada polivinilidenfluorido membranos buvo užblokuotos 5 procentų neriebiu pienu ir per naktį inkubuojamos su nurodytais pirminiais antikūnais 4 laipsnių temperatūroje. Membranos tris kartus plaunamos PBST (fosfatiniu buferiniu tirpalu, 0, 1 procento Tween 20) ir 2 valandas inkubuojamos su antriniais antikūnais kambario temperatūroje. Tada membranos dar tris kartus buvo plaunamos PBST ir vizualizuotos naudojant patobulintą chemiliuminescencinį substratą ir nuskaitytos naudojant „Kodak Digital Imaging System“ („Gel Logic 2200Pro“, „Kodak“, JAV).

Statistinė analizė

Visos reikšmės išreiškiamos kaip vidurkis ± standartinis nuokrypis (SD). Vidutinių reikšmių skirtumų reikšmingumas buvo nustatytas vienpuse dispersijos analize (ANOVA), naudojant Statistical Package for Social Sciences (SPSS 16.0 programinę įrangą). P < 0,05,="" palyginti="" su="" kontroline="" grupe,="" buvo="" laikomas="" statistiškai="">

Rezultatai

BSHX ekstraktas apsaugo PC12 ląsteles nuo HG sukelto ląstelių pažeidimo

Norėdami ištirti, ar BSHX ekstraktas gali apsaugoti PC12 ląsteles nuo HG įžeidimo, mes apdorojome PC12 ląsteles įvairiomis BSHX ekstrakto koncentracijomis (20, 50 ir 100 mg / l) 48 valandas HG (75 mM) sąlygomis. Įvertinus ląstelių gyvybingumą naudojant MTT tyrimą, paaiškėjo, kad HG pažeidimas žymiai sumažino PC12 ląstelių gyvybingumą (ląstelių gyvybingumas buvo maždaug 56,9 ± 6,7 proc.) ir kad gydymas BSHX ekstraktu reikšmingai užkirto kelią ląstelių žūčiai priklausomai nuo koncentracijos. Ląstelių gyvybingumas padidėjo iki 87,8 ± 9,2 proc., kai ląstelės buvo kartu apdorotos BSHX ekstraktu (100 mg/L) (1A pav.). Laktato dehidrogenazė (LDH) išsiskiria iš pažeistų ląstelių, todėl gali būti naudojama ir kaip toksiškumo ląstelėms indikatorius. Remiantis MTT tyrimo rezultatais, mes nustatėme, kad HG pažeidimas žymiai padidino LDH išsiskyrimą iš PC12 ląstelių ir kad gydymas BSHX ekstraktu užkirto kelią LDH išsiskyrimui priklausomai nuo koncentracijos (1B pav.). Šie rezultatai rodo, kad BSHX ekstraktas padidina ląstelių gyvybingumą. HG sukeltose PC12 ląstelėse.

BSHX ekstraktas slopina PC12 ląstelių apoptozę per kaspazės -9/3- priklausomą kelią

Norėdami nustatyti BSHX ekstrakto poveikį ląstelių apoptozei, kaip jautrų apoptozės tyrimą naudojome DNR dažus Hoechst 33258. Normalių ląstelių branduoliai, nudažyti Hoechst 33258, rodė vienodą mėlyną fluorescenciją, o apoptozinėse ląstelėse, kurios branduolinio chromatino debesies piknoze, buvo hiperchromatinių ir tankių fluorescencinių dalelių. Apoptozės procentas buvo apskaičiuotas pagal apoptozinių ląstelių skaičių ir bendrą ląstelių skaičių. Mūsų duomenys atskleidė, kad HG (75 mM) įžeidimas smarkiai padidino apoptozinių ląstelių dalį (51,7 ± 4,3 proc.), o gydymas BSHX ekstraktu žymiai apsaugojo nuo HG sukeltos apoptozės PC12 ląstelėse (2A pav.). Šiuos rezultatus dar labiau patvirtino AO / EB dvigubo dažymo analizė. AO patenka ir į normalias, ir į apoptotines ląsteles ir skleidžia žalią fluorescenciją, o EB patenka tik į apoptotines ląsteles ir skleidžia raudoną fluorescenciją [13]. AO/EB tyrimas parodė, kad apoptozinių ląstelių procentas reikšmingai padidėjo po HG (75 mM) pažeidimo (47,8,7 ± 2,6 proc.) ir sumažėjo po BSHX ekstrakto apdorojimo PC12 ląstelėse (2B pav.), o tai rodo, kad BSHX ekstraktas gali veiksmingai slopina HG sukeltą PC12 ląstelių apoptozę.

Tada ištyrėme BSHX ekstrakto poveikį kaspazės -3/PARP keliui, svarbiam su mitochondrijomis susijusiai apoptozei [14]. Western blot atskleidė, kad HG (75 mM) įžeidimas reikšmingai padidino aktyvių kaspazės -3 ir PARP formų ekspresiją ir sumažino bendros kaspazės-3 ir PARP raišką PC12 ląstelėse, ir šis poveikis buvo žymiai priešingas. gydant BSHX ekstraktu (2C pav.), o tai rodo, kad BSHX ekstraktas veiksmingai apsaugojo PC12 ląsteles nuo apoptozės, reguliuojant nuo mitochondrijų priklausomą kaspazės -3/PARP kelią.

BSHX ekstraktas slopina tarpląstelinę ROS gamybą HG sukeltose PC12 ląstelėse

Kadangi HG gali sustiprinti tarpląstelinio ROS susidarymą [15], mes išbandėme tarpląstelinio ROS lygį, kad nustatytų, ar BSHX ekstraktas gali slopinti ROS susidarymą. PC12 ląstelėse, kurios 48 valandas buvo veikiamos 75 mM HG, vidutinis fluorescencijos intensyvumas padidėjo 3{2}} kartus, palyginti su kontroline medžiaga. Priešingai, bendras gydymas BSHX ekstraktu reikšmingai sumažino vidutinį fluorescencijos intensyvumą iki maždaug 0.76-, 0.{{10}} ir 0.{101} {12}} kartos modelio grupės, o tai rodo, kad BSHX ekstraktas gali slopinti HG sukeltą ROS gamybą (3A, B pav.).

BSHX ekstraktas palaiko mitochondrijų homeostazę HG sukeltose PC12 ląstelėse, reguliuodamas Bax ir Bcl-2 ekspresiją

Mitochondrijų membranos potencialas yra svarbus mitochondrijų funkcijos parametras, naudojamas kaip ląstelių sveikatos rodiklis. JC-1 yra lipofilinis, katijoninis dažiklis, kuris gali selektyviai patekti į mitochondrijas ir, didėjant membranos potencialui, grįžtamai pakeisti spalvą iš žalios į raudoną. Sveikose ląstelėse, turinčiose didelį mitochondrijų membranos potencialą, JC-1 spontaniškai sudaro kompleksus, žinomus kaip J agregatai su intensyvia raudona fluorescencija. Kita vertus, apoptozinėse ląstelėse, turinčiose mažą mitochondrijų membranos potencialą, JC-1 išlieka monomerinės formos, kuri rodo tik žalią fluorescenciją [16, 17]. Todėl žalios fluorescencijos ir raudonos fluorescencijos santykis gali atspindėti mitochondrijų depoliarizaciją. Mūsų tyrime ląstelių su depoliarizuotomis mitochondrijomis (žalia fluorescencija) skaičius žymiai padidėjo po HG (75 mM) 48 valandas, ir šis padidėjimas buvo panaikintas naudojant BSHX ekstraktą priklausomai nuo koncentracijos (4A pav.).

Toliau aptikome citochromo c, kuris yra pagrindinis aktyvacijos kaspazės priklausomo apoptozės kelio veikėjas, mitochondrijų ir citoplazmų pasiskirstymą. Mes nustatėme, kad HG (75 mM) įžeidimas 48 valandas sukėlė dramatišką citochromo c perkėlimą iš mitochondrijų į citoplazmą, ir šis perkėlimas buvo žymiai apsaugotas naudojant BSHX ekstraktą (4B pav.), o tai rodo, kad BSHX ekstraktas gali slopinti citochromas c iš mitochondrijų.

Be to, Bcl-2 šeimos baltymai yra svarbūs įvairių apoptozinių takų reguliatoriai. Bcl-2 gali slopinti ląstelių apoptozę, kurią sukelia įvairūs citotoksiniai veiksniai, ir yra citochromo c išsiskyrimo iš mitochondrijų į citoplazmą inhibitorius. Tačiau Baxas, kaip Bcl-2 šeimos narys, yra proapoptozės veiksnys. Kai sukeliama apoptozė, Baxas migruoja iš citoplazmos į mitochondrijas ir sunaikina mitochondrijų vientisumą [5, 18]. Mūsų tyrime Bcl-2 baltymų lygis buvo sumažintas, o Bax buvo padidintas HG (75 mM) įžeidimu 48 valandas. Šis poveikis, priklausomai nuo koncentracijos, buvo pakeistas naudojant BSHX ekstraktą (4C pav.). Visi aukščiau pateikti rezultatai rodo, kad BSHX ekstraktas apsaugojo PC12 ląsteles nuo HG sukeltos mitochondrijų depoliarizacijos, reguliuodamas Bax ir Bcl ekspresiją-2.

BSHX ekstrakto poveikis ląstelių apoptozei per JNK / p38 MAPK signalizacijos kelius

Kai kurie tyrimai parodė, kad padidėjusi ROS gamyba buvo susijusi su MAPK takų aktyvavimu, sukeliančiu ląstelių apoptozę9 [19, 20]. Taigi mes ištyrėme BSHX ekstrakto poveikį mitogeno aktyvuotos baltymų kinazės (MAPK) signalizacijos keliui, kad nustatytume, ar BSHX ekstraktas gali susilpninti HG sukeltą apoptozę. Kaip parodyta 5 paveiksle, HG (75 mM) įžeidimas 48 valandas padidino c-Jun NH2-galinės kinazės (JNK) ir p38 fosforilinimą PC12 ląstelėse, kuriuos reikšmingai slopino BSHX ekstraktas priklausomas būdas. Tačiau panašus rezultatas nebuvo pastebėtas naudojant ekstraląstelinės reguliuojamos baltymų kinazės (ERK) MAPK. Rezultatai rodo, kad BSHX ekstraktas gali slopinti HG sukeltą ląstelių apoptozę per JNK / p38 MAPK signalizacijos kelius.

Diskusija

Diabetinė encefalopatija (DE) yra dažna 2 tipo cukrinio diabeto (T2DM) komplikacija. Tai gali sukelti smegenų pažinimo sutrikimą ir yra svarbus 2 tipo cukriniu diabetu sergančių pacientų mirtingumo ir negalios rizikos veiksnys visame pasaulyje [3]. Taigi labai svarbu ištirti DE mechanizmą, taip pat jo prevencijos ir gydymo strategijas.

Kinijoje tradiciniai kinų vaistai (TCM) buvo naudojami DM gydyti daugelį metų ir parodė gydomąjį poveikį. Kai kurie klinikiniai tyrimai rodo, kad TCM, pagrįsti maitinančiais inkstus ir aktyvuojančiomis kraujo strategijomis, gali sumažinti gliukozės kiekį kraujyje, skatinti kraujotaką ir pagerinti smegenų pažinimo sutrikimus. BSHX receptas yra šių TCM atstovas. Mūsų preliminarus klinikinis tyrimas parodė, kad BSHX receptas gali veiksmingai pagerinti gliukozės, homocisteino (HCY) ir didelio jautrumo C reaktyviojo baltymo (hs-CPR) kiekį serume ir pagerinti diabetu sergančių pacientų, kuriems yra lengvas pažinimo sutrikimas (MCI), pažinimo funkciją. [12]. Tačiau iki šiol trūksta įrodymų, patvirtinančių efektyvumą ir farmakologinį mechanizmą.

Šiame tyrime mes nustatėme, kad BSHX ekstraktas gali susilpninti HG sukeltą ląstelių gyvybingumo sumažėjimą, matuojant MTT, LDH tyrimu. Norėdami toliau ištirti apsauginį BSHX ekstrakto poveikį ląstelių gyvybingumui, mes ištyrėme apoptozę Hoechst 33258 ir AO / EB dažymo analize. Rezultatai parodė, kad BSHX ekstraktas gali žymiai sumažinti HG sukeltą apoptozę. Kaip apoptozės žymuo, kaspazė-3 ir PARP žymiai padidėjo po gydymo HG, tačiau šių proapoptotinių faktorių aktyvavimą slopino BSHX ekstraktas priklausomai nuo koncentracijos. Pirmiau pateikti rezultatai parodė, kad BSHX ekstraktas turėjo apsauginį poveikį PC12 ląstelių pažeidimams, kuriuos sukelia HG.

ROS susidaro vykstant ląstelių oksidaciniam fosforilinimo procesui, o jo gamybos padidėjimas arba antioksidacinių sistemų pažeidimas gali sukelti oksidacinį stresą ląstelėse [21]. Tyrimai parodė, kad didelis gliukozės kiekis gali sukelti tarpląstelinės ROS kaupimąsi ir galiausiai aktyvų apoptotinį signalizacijos kelią. O bendras diabeto komplikacijų mechanizmas yra oksidacinis stresas [22, 23]. Mūsų rezultatai parodė, kad didelis gliukozės kiekis gali sukelti ROS padidėjimą PC12 ląstelėse, o tai atitiko ankstesnius tyrimus [24]. Spėjama, kad didelės gliukozės toksiškumas ląstelėms gali būti pasiektas dėl ROS sukeltos apoptozės. Mitochondrijos yra pagrindinės tarpląstelinės ROS gamybos vietos ir pagrindinis ROS atakos organas [25]. Patologinėmis sąlygomis spartus ROS padidėjimas gali sukelti mitochondrijų disfunkciją, mitochondrijų membranos potencialo žlugimą ir galiausiai sukelti ląstelių apoptozę [26]. Taigi mes nustatėme mitochondrijų vientisumą. Mūsų rezultatai parodė, kad didelis gliukozės kiekis žymiai sumažino mitochondrijų membranos potencialą, padidino Bax/Bcl-2 santykį, kuris kontroliavo mitochondrijų pralaidumo pereinamųjų porų (MPTP) perjungimą, ir skatino citochromo c nutekėjimą, o BSHX ekstraktas galėjo. pakeisti šiuos pakeitimus. Tai rodo, kad BSHX ekstrakto neuroprotekcija nuo HG sukeltų PC12 ląstelių gali atsirasti išlaikant mitochondrijų vientisumą.

MAPK signalizacijos kelias taip pat vaidina svarbų vaidmenį ląstelių apoptozėje. JNK, ERK ir p38 MAPK yra labiausiai tiriami MAPK šeimos nariai. Pagrindinis jų veikimo būdas yra fosforilinti specifines vietas, taip reguliuojant ląstelių apoptozę [8, 27, 28]. Be to, tyrimai parodė, kad per didelė ROS gamyba gali sukelti p38MAPK fosforilinimą [29-31], o ROS gali sukelti MAPK kelių aktyvavimą arba tarpininkauti jai [32]. Keli ląstelių dirgikliai, taip pat lygiagrečiai skatinantys ROS gamybą, gali suaktyvinti MAPK kelius kelių tipų ląstelėse [32, 33]. Galimi MAPK aktyvinimo ROS mechanizmai gali apimti MAPK fosfatazių, kurios palaiko kelią neaktyvioje būsenoje, inaktyvavimą ir skilimą [19]. Kita vertus, siekiant dar labiau patvirtinti, ar MAPK keliai buvo suaktyvinti dėl ROS generavimo, ląstelės buvo iš anksto apdorotos antioksidantais (pvz., NAC, ROS šalintuvu), kad būtų išvengta ROS kaupimosi. Ir rezultatai parodė, kad MAPK aktyvacija buvo beveik slopinama po ląstelių stimuliavimo ląstelių dirgikliais [32, 33], o tai rodo, kad MAPK takų ROS inaktyvacija yra susijusi. Be to, tyrimai parodė, kad kai ląstelės buvo gydomos specifiniu JNK inhibitoriumi SP600125, kardiotoksino III sukelta apoptozė gali būti užblokuota [34]. Ankstesnis mūsų tyrimas parodė, kad modifikuotas Wu-Zi-Yan-Zong receptas (MWP) gali slopinti ERK/p38 MAPK aktyvavimą A aktyvuotose BV2 mikroglijose [10]. Tačiau šiame tyrime mes nustatėme, kad BSHX ekstraktas gali slopinti JNK ir p38 MAPK fosforilinimą, ir mes nepasiekėme to paties rezultato su p-ERK. Mes spėjame, kad dėlės BSHX ekstrakte atlieka skirtingą vaidmenį. Rezultatai rodo, kad kitas apsauginis BSHX ekstrakto mechanizmas nuo apoptozės HG sukeltose PC12 ląstelėse gali būti reguliuojamas JNK / p38 MAPK signalizacijos kelius.

Išvada

BSHX ekstraktas, daugiažolių formulė, rodo neuroprotekcinį poveikį PC12 ląstelėms nuo HG pažeidimo. BSHX ekstraktas veiksmingai slopino HG sukeltą PC12 ląstelių apoptozę, sumažindamas tarpląstelinį ROS susidarymą, išlaikydamas mitochondrijų membranos vientisumą ir blokuodamas kaspazės-3 ir JNK/p38 MAPK signalizacijos kelius (6 pav.). Apskritai, mūsų išvados rodo, kad BSHX ekstraktas yra perspektyvus agentas gydant DE klinikiniais tikslais.

Autoriaus indėlis

Sugalvojo ir sukūrė eksperimentus: Zeng KW, Wang XM. Atliko eksperimentą: Zhao SY. Išanalizavo duomenis: Zhao SY, Zeng KW ir Wang XM. Reagentai / medžiagos / analizės įrankiai: Zhao SY, Dong X, Tu PF, Zeng KW ir Wang XM. Parašė paterį: Zhao SY.

Nuorodos

1 Riederer P, Korczyn AD, Ali SS ir kt. Diabeto smegenys ir pažinimas. J Neural Transm, 2017, 124: 1-24.

2. Hamed SA. Smegenų pažeidimas cukriniu diabetu: įrodymai, mechanizmai ir gydymo pasekmės. Ekspertas Rev Clin Phar 2017, 10: 409-428.

3. Testa R, Bonfigli AR, Prattichizzo F ir kt. „Metabolinės atminties“ teorija ir ankstyvas hiperglikemijos gydymas diabeto komplikacijų prevencijai. Nutr 2017, 9: 437-445.

4. Ly JD, Grubb DR, Lawen A. Mitochondrijų membranos potencialas (Δψm) apoptozėje; atnaujinimas. Apoptosis 2003, 8: 115-128.

5. Aouacheria A, Baghdiguian S, Lamb HM, Huska JD, Pineda FJ, Harwick J M. Mitochondrijų dinamikos ir gyvybės ar mirties įvykių susiejimas per Bcl-2 šeimos baltymus. Neurochem Int 2017, 109: 141-161.

6. Bernardi P, Scorrano L, Colonna R ir kt. Mitochondrijos ir ląstelių mirtis. Mechanistiniai aspektai ir metodologiniai klausimai. Vasaris J 1999, 264: 687-701.

7. Yang L, Wu L, Du S ir kt. 1, 25- (OH) 2D3 slopina didelę gliukozės sukeltą apoptozę ir ROS gamybą žmogaus pilvaplėvės mezotelio ląstelėse per MAPK/P38 kelią. Mol Med Rep 2016, 14: 839-844.

8. Tabakman R, Jiang H, Schaefer E ir kt. Nervų augimo faktoriaus išankstinis apdorojimas susilpnina deguonies ir gliukozės trūkumo sukeltą c-Jun aminogalo kinazės 1 ir streso suaktyvintų kinazių p38 ir p38 aktyvavimą ir suteikia neuroprotekciją feochromocitomos PC12 modelyje. J Mol Neurosci 2004, 22: 237-250.

9. Zou W, Zeng J, Zhuo M, Xu W, Sun L, Wang J ir kt. Kaspazės-3 ir p38 mitogeno aktyvuotos baltymų kinazės dalyvavimas kobalto chlorido sukeltame apoptozėje PC12 ląstelėse. J Neurosci Res 2002, 67: 837–843.

10. Yu Q, Song FJ, Chen JF ir kt. Modifikuoto Wu-Zi-Yan-Zong recepto priešuždegiminis poveikis amiloidų stimuliuojamame BV2 mikroglijoje per NF-κB ir ERK/p38 MAPK signalizacijos kelius. Evid-Based Compl Alt 2017, 2017: 1-10.

11. Zeng KW, Zhang T, Fu H ir kt. Modifikuotas Wu-Zi-Yan-Zong receptas, tradicinė kinų daugiažolių formulė, slopina lipopolisacharidų sukeltus neurouždegiminius procesus žiurkių astrocituose per NF-κB ir JNK/p38 MAPK signalizacijos kelius. Phytomed 2012, 19: 122-129.

12. Fu H, Lin WW, Wang H ir kt. Bushen Huoxue recepto poveikis 2 tipo diabeto lengvo pažinimo sutrikimo gydymui. Chin J Integr Trad West Med 2017, 37: 661-665.

13. Baskić D, Popović S, Ristić P ir kt. Cikloheksimido sukeltos apoptozės žmogaus leukocituose analizė: Fluorescencinė mikroskopija naudojant aneksino V / propidžio jodidą, palyginti su akridino apelsinu / etidžio bromidu. Cell Biol. Int 2006, 30: 924–932.

14. Galluzzi L, Lópezsoto A, Kumar S ir kt. Kaspazės sujungia ląstelių mirties signalus su organizmo homeostaze. Imunitetas, 2016, 44: 221-231.

15. Hamed S, Brenner B, Roguin A. Azoto oksidas: pagrindinis veiksnys, lemiantis endotelio progenitorinių ląstelių disfunkciją sergant cukrinio diabeto tipu-2. Cardiovasc Res 2011, 91: 9-15.

16. Perelman A, Wachtel C, Cohen M ir kt. JC-1: Alternatyvūs sužadinimo bangos ilgiai palengvina mitochondrijų membranos potencialo citometriją. Cell Death Dis 2012, 3: e430.

17. Perry SW, Norman JP, Barbieri J ir kt. Mitochondrijų membranos potencialo zondai ir protonų gradientas: praktinis naudojimo vadovas. Biotech 2011, 50: 98-115.

18. Chipuk JE, Green D R. Kaip BCL-2 baltymai skatina mitochondrijų išorinės membranos pralaidumą? Trends Cell Biol, 2008, 18:157-164.

19. Son Y, Cheong YK, Kim NH ir kt. Mitogeno aktyvuotos baltymų kinazės ir reaktyviosios deguonies rūšys: kaip ROS gali suaktyvinti MAPK kelius? J Signal Transduct 2011: 792639.

20. Zhang L, Zhang Z, Chen F ir kt. Aromatiniai podofilotoksino heterocikliniai esteriai turi anti-MDR aktyvumą žmogaus leukemijos K562 / ADR ląstelėse per ROS / MAPK signalizacijos kelią. Eur J Med Chem 2016, 123:226-235.

21. Kanninen K, White AR, Koistinaho J ir kt. Glikogeno sintazės kinazės{1}} taikymas siekiant terapinės naudos kovojant su oksidaciniu stresu sergant Alzheimerio liga: Nrf2-ARE kelio dalyvavimas. Int J Alzheimers Dis 2011, 2011: 985085.

22. Babižajevas MA, Strokovas IA, Novikovas V. V. ir kt. Oksidacinio streso vaidmuo diabetinėje neuropatijoje: laisvųjų radikalų rūšių susidarymas glikacijos reakcijoje ir genų polimorfizmai, koduojantys antioksidacinius fermentus genetiniam jautrumui diabetinei neuropatijai I tipo diabetu sergančių pacientų populiacijoje. Cell Biochem Biophys, 2015, 71: 1425-1443.

23. Volpe C, Villardelfino PH, Dos PA ir kt. Ląstelių mirtis, reaktyviosios deguonies rūšys (ROS) ir diabetinės komplikacijos. Cell Death Dis 2018, 9: 119-127.

24. Chen K, Zhang M, Chen BD ir kt. Ginkgolidas B slopina apoptozę didelės gliukozės stimuliuojamose žmogaus bambos venų endotelio ląstelėse. Kinijos farmakologinis biuletenis, 2017, 33: 378-383.

25. Goldsteins G, Keksa-Goldstein V, Ahtoniemi T ir kt. Kenksmingas superoksido dismutazės vaidmuo mitochondrijų tarpmembraninėje erdvėje. J Biol Chem 2008, 283: 8446-8452.

26. Cowan KJ, Storey KB. Mitogeno aktyvuotos baltymų kinazės: nauji signalizacijos keliai, veikiantys ląstelių atsakuose į aplinkos stresą. J Exp Bio 2003, 206: 1107.

27. Wu N, Lin X, Zhao X ir kt. MiR-125b veikia kaip onkogenas glioblastomos ląstelėse ir slopina ląstelių apoptozę per nuo p53 ir p38MAPK nepriklausomus kelius. Brit J Cancer 2013, 109: 2853.

28. Shi L, Yu X, Yang H ir kt. Pažangūs glikacijos galutiniai produktai sukelia žmogaus ragenos epitelio ląstelių apoptozę generuodami reaktyviąsias deguonies rūšis ir aktyvuodami JNK ir p38 MAPK kelius. Plus One 2013, 8: e66781.

29. Chung H, Kim E, Lee DH ir kt. Grelinas slopina apoptozę pagumburio neuronų ląstelėse deguonies ir gliukozės trūkumo metu. Endokrinologija 2007, 148: 148.

30. Palanivel K, Kanimozhi V, Kadalmani B. Verrucarin A pakeičia ląstelių ciklą reguliuojančius baltymus ir sukelia apoptozę per reaktyviosios deguonies rūšies priklausomą p38MAPK aktyvavimą žmogaus krūties vėžio ląstelių linijoje MCF-7. Naviko biologija, 2014, 35: 10159.

31. Hua X, Chi W, Su L ir kt. ROS sukeltas oksidacinis pažeidimas, susijęs su grybelinio keratito patogeneze per p38 MAPK aktyvavimą. Sci Rep 2017, 7: 10421.

32. Mccubrey JA, Lahair MM, Franklin RA. Reaktyviųjų deguonies rūšių sukeltas MAP kinazės signalizacijos takų aktyvavimas. Antioxid Redox Signal 2006, 8: 1775-1789.

33. Torres M, Forman H J. Redokso signalizacija ir MAP kinazės keliai. Biofactors 2003, 17: 287-296.

34. Chien CM, Yang SH, Yang CC, Chang LS, Lin SR. Kardiotoksinas III sukelia c-jun N-galo kinazės priklausomą apoptozę HL-60 žmogaus leukemijos ląstelėse. Cell Biochem Funct 2008, 26: 111-118.