Nlrc3 Knockout pelėms po HTNV infekcijos pasireiškė patologiniai inkstų pokyčiai

Kontaktas:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791

Hantaan virusas (HTNV) užkrečia žmones ir sukelia hemoraginę karštligęinkstųsindromas(HFRS). Sukūrus gerai apibūdintus HFRS gyvūnų modelius, būtų galima paspartinti vakcinos kandidatų ir terapinių agentų tyrimus ir būti naudinga priemone tiriant HFRS patogenezę. Kadangi NLRC3 atlieka keletą imunoreguliacinių vaidmenų, mes ištyrėme Nlrc3 - / - pelių jautrumą HTNV infekcijai, kad sukurtume naują HFRS modelį. Nlrc3−/− pelėms sumažėjo svoris,inkstų kraujavimas,ir kanalėlių išsiplėtimas po HTNV infekcijos, apibendrinant daugelį klinikinių žmogaus HFRS simptomų. Be to, užkrėstoms Nlrc3-/- pelėms buvo didesnis virusų kiekis serume, blužnyje ir inkstuose nei laukinio tipo C57BL/6 (WT) pelėms, o kai kurios iš jų pasireiškė daugiau hematologinių sutrikimų ir reikšmingų patologinių pokyčių keliuose organuose nei WT pelėms. Mūsų rezultatai rodo, kad HTNV užkrėstoms Nlrc3-/- pelėms gali atsirasti klinikinių simptomų ir patologinių pokyčių, panašių į HFRS sergančius pacientus, o tai rodo naują kandidatų vakcinų ir terapijos patogenezės tyrimo ir testavimo modelį.

Raktiniai žodžiai:HFRS, HTNV, NLRC3, inkstų kraujavimas, inkstų kanalėlių išsiplėtimas

ĮVADAS

Hemoraginė karštligė suinkstųsindromas (HFRS) yra ūminė intersticinė nefropatija po zoonozinio hantaviruso perdavimo iš graužikų žmonėms. Liga dažniausiai pasireiškia Azijoje ir Europoje (1, 2). Labiausiai paplitę patogenai, sukeliantys HFRS, yra Dobrava virusas (DOBV), Puumala virusas (PUUV), Seulo virusas (SEOV) ir Hantaan virusas (HTNV), kurių kiekvienas sukelia skirtingą HFRS sunkumą. Ligos požymiai skiriasi Šiaurės ir Pietų Amerikoje, kur Hantavirusinė infekcija sukelia hantavirusinį plaučių sindromą (HPS), daugiausia dėl Andų viruso (ANDV) ir Sin Nombre viruso (SNV) (3).

HFRS pasireiškia kartu su dideliu karščiavimu, hipotenzija,inkstų nepakankamumas ir kraujavimas(4). Jį galima suskirstyti į penkias klinikines stadijas: febrilinį, hipotenzinį šoką, oligurinį, diuretikų ir sveikstantį. Ūminį HTNV infekcijos epizodą, sukeliantį HFRS, dažnai lydi trombocitopenija, leukocitozė, anemija, padidėjęs kreatinino kiekis serume ir kepenų fermentų kiekis (5). Šiuos klinikinius simptomus ir požymius iš dalies galima paaiškinti tuo, kad HTNV daugiausia atakuoja inkstus ir sukelia inkstų pažeidimą, kuriam būdingas ūminis tubulointersticinis nefritas, apimantis uždegiminių ląstelių infiltraciją (6), dėl to kenkiantis daugeliui kitų organų (7).

Graužikai yra natūralūs Hantavirusų, kurie nuolat užkrečia gyvūnus, nesukeldami ligų, rezervuarai (8). Jų ekskrementai, tokie kaip seilės, šlapimas ir išmatos, tampa potencialiais teršalais, galinčiais užkrėsti žmones, kurie įkvepia nedidelius užterštų išmatų aerozolius. Hantavirusai paprastai sukelia besimptomę suaugusių BALB/c ir C57BL/6 pelių infekciją (9), tačiau mirtina neurologinė liga arba nuolatinė infekcija žindančioms ir naujagimiams pelėms (10, 11). Nors eksperimentiškai PUUV infekuotų makakų makakos (Macaca fascicularis) buvo įrodyta nefropatinių anomalijų, šiems gyvūnams pasireiškė tik lengva proteinurija, imuninių ląstelių infiltracija ir inkstų kanalėlių pažeidimai, panašiai kaip lengvas HFRS atvejis (12). Be to, žiurkėnai, užsikrėtę HTNV per nosį, sukėlė nuolatinę besimptomę infekciją, kuriai būdinga sporadinė viremija, bet didelis viruso genomo kopijų kiekis plaučiuose, smegenyse ir inkstuose. Šeškams, užsikrėtusiems didele HTNV doze švirkščiant į raumenis, kūno svoris laipsniškai mažėjo (laikui bėgant 5-12 proc.), tačiau jie buvo nepažeisti.inkstų funkcijos,viremijos nebuvimas ir viruso perdavimo į organus trūkumas. Marmozetėms HTNV injekcija į raumenis sukėlė didelį serokonversijos laipsnį ir neutralizuojančių antikūnų gamybą; nuosekliai šie gyvūnai neturėjo inkstų pažeidimo, viremijos ar viruso perdavimo į organus (13).

Nepaisant jų netobulumo, Hantaviruso patogenezei tirti buvo plačiai naudojami gyvūnų modeliai, naudojantys žiurkes ir peles (14). Yoshimatsu ir kt. parodė, kad SCID pelių užsikrėtimas HTNV sukėlė mirtiną išsekimo ligą su plaučių edema (15, 16), o neutrofilų išsekimas neleido išsivystyti plaučių edemai, tačiau būdingų hemoraginių HFRS pažeidimų nerasta (15). Shimizu ir kt. nustatė, kad HTNV, išskirta iš HFRS pacientų, gali infekuoti 6-savaitės BALB/c pelių pateles į veną, sukeldamas viremiją 6-9 dienų, pasireiškiančių ligos požymių, įskaitant laikiną svorio kritimą, plaukų raukšles, inkstų eksudaciją (17). ). Tame pačiame pelės modelyje tarp ribos buvo makroskopinis kraujavimasinkstų žievėir smegenyse, tačiau ar pastebėti histopatologiniai pokyčiai buvo susiję su sumažėjusia inkstų funkcija, nebuvo tirta. Žmogiškiems pelėms HTNV infekcija sukelia svorio mažėjimą, sumažėjusį aktyvumą, susiraukšlėjusį kailį ir plaučių pažeidimą, o tai atrodo, kad plaučiai yra pagrindinis virusinės infekcijos taikinys (18). Todėl vis dar reikalingas tinkamas HTNV infekcijos gyvūnų modelis, kuris užfiksuotų daugumą HFRS ligos požymių.

cistanche apžvalgosdėlinkstų kanalėlių išsiplėtimas

NLR yra ryškiausia tarpląstelinių įgimtų imuninių receptorių šeima ir atlieka skirtingas funkcijas reguliuojant įgimtą imunitetą. Nors geriausiai žinomi NLR (pvz., NLRP3) turi teigiamą reguliavimo funkciją uždegimo ir imuninės sistemos aktyvinimo srityje, neįprastas NLR pogrupis, apibrėžiamas kaip slopinantis NLR, pasižymi slopinančia funkcija uždegimo atsakuose. Norint suprasti NLR sukelto įgimto imuniteto slopinimo mechanizmą, buvo ištirti slopinančių NLR, tokių kaip NLRC3 ir NLRX1, ligandai (19). NLRC3 yra neigiamas reguliatorius, kuris susilpnina I tipo interferono (IFN-I) atsaką, išskirdamas ir susilpnindamas interferono genų (STING) aktyvaciją (19). NLRX1, kaip pagrindinis homeostatinis sargybinis tarp mitochondrijų biologijos ir imunologinio atsako, buvo susijęs su daugybe ligų, tiek patogenų sukeltų, tiek kitų (20). Kadangi HTNV liga pasižymi dideliu uždegimo ir imuninės sistemos aktyvavimo sutrikimu, pasirinkome Nlrc3-/- peles, kad ištirtume molekulinius ligos mechanizmus.

Šis tyrimas parodė, kad Nlrc3-/- pelių modelis primena sisteminį sužalojimą, pastebėtą pacientams, sergantiems HFRS, kuriems būdinga trombocitopenija,inkstų kanalėlių išsiplėtimas ir kraujavimas.Virusinės naštos analizė atskleidė, kad Nlrc3-/- pelėms buvo didesnis virusų kiekis keliuose audiniuose, įskaitant serumą, blužnį ir inkstus. Mūsų tyrimais nustatytas HTNV infekcijos pelės modelis, naudingas vertinant kandidatines vakcinas ir gydymo priemones.

METODAI

VVirus akcijos

HTNV padermę {{0}} padovanojo Changshou Hang (Kinijos ligų kontrolės ir prevencijos centras), kuri buvo išsaugota ir išplėsta mūsų laboratorijoje. Vero E6 ląstelės buvo naudojamos viruso dauginimui, o infekciniai titrai buvo kiekybiškai įvertinti naudojant 50 procentų audinių kultūros infekcinę dozę (TCID50) imunofluorescenciniais tyrimais (IFA). Konvertavimas tarp TCID50 ir apnašas formuojančių vienetų (PSU) buvo pagrįstas tokiu skaičiavimu: 1 PFU ≈0,7 × TCID50 (21).

kartos Nlrc3 Knockout Mouse Model

Laukinio tipo C57BL/6J pelių ir Nlrc3 knockout (Nlrc3−/−) pelių modelius sukūrė ir sukūrė Shanghai Model Organisms Center, Inc (Šanchajus, Kinija). Norint gauti Nlrc3-/- pelę, Cas9 mRNR ir sgRNR buvo paruoštos in vitro transkripcijos būdu. Dvi sgRNR, skirtos ištrinti Nlrc3 geno 2-3 egzonus: 5'- GTTGGTCTAATAAGCATCCTGGG {{10}}', 5'- TCCCATGAAACCATGTCAGAAGG -3'. C57BL / 6J pelių zigotos buvo gautos ir sušvirkštos in vitro transkribuota Cas9 mRNR ir sgRNR ir perkeltos į pseudonėščius recipientus. Gautų F0 pelių genotipas buvo identifikuotas ir patvirtintas PGR ir sekos nustatymu naudojant pradmenų poras: F-5'- GTGATGTCTGCTTACC CCGTCTCC -3'; R-5'- GCCTGTGCCGCCCTCTCA -3'. Kryžminant su C57BL / 6J pelėmis, buvo pasirinktos teigiamos F0 pelės, kad gautų F1 heterozigotines Nlrc3 išmuštas peles. PGR ir sekos analizė patvirtino gautas F1 peles. Norint gauti heterozigotines Nlrc3 - / - peles, F1 heterozigotinės pelių patelės ir patinai buvo sukryžminti atsitiktinai. Visiems tyrimams buvo naudojamos 6–8 savaičių amžiaus pelės.

Gyvūnų infekcija ir mėginių paruošimas

Iš viso 5 × 105 PFU HTNV 50 ul terpės buvo inokuliuota intraperitoniniu būdu. Kontrolinių grupių pelės gavo identiškus PBS kiekius. Buvo naudojamos nuo dvidešimt iki dvidešimt penkių Nlrc3-/- arba WT pelių. Kiekvienas pelių tipas buvo suskirstytas į penkias grupes mėginiams imti praėjus 0, 3, 6, 9 ir 12 dienų po užsikrėtimo. Kūno svoris ir analinė temperatūra buvo registruojami kasdien. Kiekvienu laiko momentu keturi ar penki gyvūnai iš abiejų grupių buvo užmigdyti bandymams. Virusologinei analizei buvo paimti švieži audinių mėginiai iš širdies, kepenų, blužnies, plaučių, inkstų ir smegenų, o po to nedelsiant užšaldyti -80 laipsnių temperatūroje. Pelės buvo perfuzuojamos šaltu PBS, o organai buvo fiksuoti 4 procentų paraformaldehidu 4 valandas histologinei ir imunohistocheminei analizei. Kraujo mėginiai buvo paimti viruso krūvio tyrimui ir įprastiniam kraujo tyrimui, o serumas buvo išskirtas biocheminei analizei.

Citokinų tyrimas

Iš viso 25 ml kiekvienos pelės serumo buvo ištirta 13 skirtingų citokinų naudojant LEGENDplex™ pelės antivirusinį atsako skydelį (13-plex) (BioLegend) pagal gamintojo instrukcijas. Aptikimui buvo naudojamas FACS Calibur citometras (Becton Dickinson Biosciences, CA). Duomenys buvo analizuojami naudojant LEGENDplex v8.{5}}. Programinė įranga.

Realaus laiko RT-PGR tyrimas

Kiekvienos pelės audinių mėginiai buvo pasverti ir panardinti į PBS ir homogenizuoti automatiniu homogenizatoriumi-TissueLyser II (QIAGEN, Vokietija), naudojant dažnį 30/s ir laiką 5 min. Visam RNR ekstrahavimui 200 ml audinių homogenatų buvo perkelta į 500 ml TRIzol reagento, po to ekstrahuojama chloroformu ir nusodinama izopropanoliu. 140 ml serumo mėginių buvo perkelta į 560 ml AVL buferį, kuriame yra nešiklio RNR (Qiagen, JK), RNR ekstrahavimui naudojant QIAamp Viral RNA Mini rinkinį (Qiagen, JK). Galiausiai RNR buvo ištirpinta vandenyje be RNazės. Siekiant nustatyti viruso RNR iš kiekvieno mėginio, buvo atliktas specifinis HTNV realaus laiko RT-PGR tyrimas. Pradmenų sekos, konkrečiai nukreiptos į HTNV segmentą, buvo priimtos taip: F-5'- GATCAGTCACAGTCTAGTCA- 3' ir R-5'- TGATTTCTTCCACCATTTTGT-3'. Vieno žingsnio TB Green PrimeScript™ RT-PCR rinkinys II (Perfect Real Time) (Takara, Japonija) buvo naudojamas qRT-PGR tyrimui. Galutinį pagrindinį mišinį (20 ml) sudarė 2 ml RNR, 5,6 ml RNase Free dH2O, 0,8 ml nukreipimo ir atvirkštinio pradmenų (10 mM), 0,8 ml PrimScript 1 Step Enzyme Mix 2 ir 10 ml 2 × One Step TB Green RT-PCR buferis 4. Naudotos ciklo sąlygos: 42 laipsniai 5 minutes, 95 laipsniai 10 sekundžių, po to sekė 40 ciklų 95 laipsnių 0 sekundžių, 65 laipsnių 15 sekundžių ir 95 laipsnių 0 sekundžių. Reakcijos buvo vykdomos ir analizuojamos LightCycler platformoje (Roche Diagnostics, JAV).

Absoliutus virusinės apkrovos kiekybinis įvertinimas

Virusiniai RNR oligonukleotidai, kaip RNR standartas, buvo gauti in vitro transkripcijos būdu iš DNR naudojant MAXIscript rinkinį (Thermo Scientific, JK), kurį sudarė 562 HTNV RNR bazės, kurioms buvo skirtas tyrimas (22), o po to buvo kiekybiškai įvertinta ultramikroplokštelės spektrofotometru ( BioTek Epoch, JAV), standartinės RNR atsargos koncentracija buvo 800 ng/mL. Norint įvertinti viruso kiekį kiekviename mėginyje, standartinė RNR buvo paruošta naudojant 10- karto praskiedimą, svyruojant nuo 1010 kopijų iki 103 kopijų vienai reakcijai. Mūsų standartinės RNR aptikimo riba yra nuo 1010 kopijų iki 101 kopijų vienai reakcijai, todėl mes nustatome šio tyrimo aptikimo slenkstį 100 genomo kopijų vienai reakcijai. Vykdomos analizės metu buvo nustatytos standartinės kreivės, kurių nuolydis buvo -3,6624, Y pertrauka 41,68 ciklo ir R2 vertė 0,9996.

Baltymų lygio analizė Western blot metodu

Audinių lizatai buvo paruošti iš pelių audinių mėginių. Baltymų koncentracijai nustatyti buvo naudojamas bicinchonino rūgšties (BCA) baltymų tyrimo rinkinys (Thermo Scientific, JK). Baltymų analizei 30 mg viso baltymo iš kiekvieno mėginio buvo įkelta į SDS-poliakrilamido gelį ir perkelta į NC membranas. Tada 5 procentų nugriebto pieno tirpalas buvo naudojamas blokavimui kambario temperatūroje 2 valandas. Tada buvo pridėtas 1:1000 praskiestas 1A8 monokloninis antikūnas prieš HTNV-NP (parengtas ir išgrynintas mūsų laboratorijoje) (23, 24) ir inkubuojamas 4 laipsnių temperatūroje per naktį. Galiausiai, membranos buvo inkubuojamos su antriniais antikūnais, HRP konjuguotu triušio anti-pelės IgG arba HRP konjuguotu pelės anti-triušio IgG kambario temperatūroje 2 valandas. Tada buvo pridėtas chemiliuminescencinis HRP substratas, kad būtų galima aptikti baltymus. Densitometrinė baltymų juostos intensyvumo analizė atlikta naudojant Image J programinę įrangą (NIH, JAV). b-aktinas buvo naudojamas kaip normalizavimo pakrovimo kontrolė.

Imunohistocheminis tyrimas

Audinių mėginiai buvo įterpti į parafiną ir supjaustyti į 4 mm, kad būtų galima dažyti imunohistochemiškai. Sekcijose deparafinuojamas ir rehidratuojamas bei inaktyvuojamos endogeninės peroksidazės. Pjūviuose 10 min. buvo paimtas antigenas citratiniame buferyje (PH=6) 95 laipsnių kampu. Tada blokavimui kambario temperatūroje 40 minučių buvo naudojamas 5 procentų normalus ožkos serumas. mAb 1A8 buvo naudojamas kaip pagrindinis antikūnas prieš HTNV NP antigeną ir inkubuojamas su audinių sekcijomis 4 laipsnių temperatūroje per naktį. Po to sekė FITC anti-pelės IgG (Invitrogen) dažymas 37 laipsnių temperatūroje 1 valandą, o po to DAPI 10 minučių kambario temperatūroje. Vaizdams gauti buvo naudojamas 3DHISTECH (Vengrija), o duomenų analizei – CaseViewer2.4.

Histologinis tyrimas

Siekiant išsaugoti ląstelių ir audinių morfologiją, audinių mėginiams fiksuoti histopatologinei analizei buvo naudojamas 4 procentų neutralus buferinis formalinas. Šie audiniai buvo apdoroti į 5 mm pjūvius ir nudažyti hematoksilinu ir eozinu (H&E). Galiausiai sekcijos buvo ištirtos šviesos mikroskopu, o vaizdus užfiksavo 3DHISTECH (Vengrija), išanalizavo CaseViewer2.4. Pažeidimų laipsnis buvo vertinamas vizualiai naudojant iš anksto nustatytą 4-balų sistemą: normaliose ribose kaip 0, minimalus kaip 1, lengvas kaip 2, vidutinis kaip 3, sunkus kaip 4.

Gyvūnų dalykų studijosVisi eksperimentai su gyvūnais buvo patvirtinti Ketvirtojo karo medicinos universiteto gyvūnų centro laboratorinių eksperimentų komiteto. (Nr.20210403).

StatistikaDuomenys buvo analizuojami naudojant GraphPad Prism 9 programinę įrangą. Jei nenurodyta kitaip, visi duomenys buvo pateikti kaip vidurkis ± standartinis nuokrypis (SD). T testai arba vienpusė ANOVA buvo naudojami, kaip nurodyta paveikslo legendose. P vertė, mažesnė nei 0,05, buvo laikoma reikšminga.

REZULTATAI

Virusinės apkrovos aptikimas įvairiuose Nlrc3−/− pelių organuose po intraperitoninės infekcijos HTNV

Norint apibūdinti Nlrc3-/- pelių jautrumą HTNV infekcijai, grupė Nlrc3-/- pelių buvo intraperitoniniu būdu užkrėsta 5×105 PFU HTNV vienai pelei, naudojant WT peles kaip kontrolę. Visi gyvūnai kasdien buvo stebimi dėl klinikinių simptomų, temperatūros ir kūno svorio pokyčių. Pelės buvo paaukotos 3, 6, 9 ir 12 dienų po užsikrėtimo (dpi), kad būtų galima išanalizuoti įvairius laboratorinius parametrus, virusų kiekį ir patologiją. Nlrc3−/− pelės pradėjo mesti svorį esant 4 dpi, o po 6 dpi buvo užfiksuotas svorio netekimas > 5 procentai jų pradinio kūno svorio. Palyginimui, WT pelėms svoris nekrito (1A pav.). Abiejose grupėse nebuvo užfiksuota karščiavimo (1B pav.). Siekiant įvertinti HTNV plitimą ir replikaciją pelėse, užkrėstose virusu, buvo surinktas serumas ir pagrindiniai organai (įskaitant širdį, kepenis, blužnį, plaučius, inkstus ir smegenis), kad būtų galima absoliučiai kiekybiškai įvertinti viruso RNR kopijų skaičių. Rezultatai parodė, kad viremija pasireiškė esant 3 dpi abiejose grupėse (Nlrc3-/- pelėms: 943 ± 140 kopijų ekvivalentų viename ml; WT pelėms: 803 ± 277 kopijų viename ml). Pažymėtina, kad WT pelių serumo virusų apkrova pasiekė aukščiausią tašką ties 3 dpi ir po to greitai sumažėjo, o Nlrc3-/- pelių viruso apkrova išlaikė vidutinį lygį iki 6 dpi, o po to palaipsniui mažėjo iki žemo 9 dpi lygio (pav. 1C). Be to, 0, 3, 6 ir 9 dienomis po užsikrėtimo mes surinkome visą HTNV užsikrėtusių pelių kraują, kad nustatytų viruso replikaciją kraujyje. Rezultatai parodė, kad viruso apkrova padidėjo 3 dpi, o vėliau sumažėjo, o tai rodo viruso replikaciją kraujo ląstelėse. Kaip parodyta 1 papildomame paveikslėlyje, viruso kopijų skaičius Nlrc3-/- pelėse buvo didesnis nei WT pelių (Nlrc3-/- pelėms: 5752 ± 502 kopijos ml; WT pelėms: 3589). ± 869 kopijų ml) esant 3 dpi. Be to, Nlrc3−/− pelių blužnyje buvo aptikta 2-kartų didesnė virusų apkrova (3033 ± 175 kopijų ekvivalentai viename mg) nei WT pelių (1520 ± 425 kopijos mg) esant 6 dpi; tas pats modelis buvo pastebėtas inkstuose su 9 dpi (Nlrc3-/- pelėms: 500 ± 87 kopijų ekvivalentai viename mg; WT pelėms: 270 ± 40 kopijų viename mg) (1C pav.). Apskritai, Nlrc3-/- pelėms buvo aptiktas nedidelis didesnis virusų kiekis nei WT pelėms.

Toliau ištyrėme HTNV nukleoproteinų (NP) lygius. Kaip parodyta 2A, C, Nlrc3-/- paveiksluose, pelėms buvo didesnis viruso antigeno kiekis nei WT pelėms blužnyje ir inkstuose. Statistinė viruso antigenų inkstuose ir blužnyje analizė parodyta atitinkamai 2B ir D paveiksluose. Nlrc3-/- pelių širdyje, kepenyse, plaučiuose ir smegenyse buvo aptiktas mažas virusinių antigenų kiekis (papildomas 2 paveikslas). Viruso NP baltymų kiekis Nlrc3-/- pelių širdyje, plaučiuose ir smegenyse buvo mažesnis nei WT pelių baltymų lygiu (papildomi 2B, F, H paveikslai), tačiau statistinė reikšmė tarp širdies ir smegenų buvo parodyta tiek mRNR. ir baltymų kiekis (papildomi 2A, E, I paveikslai). Šis atradimas rodo, kad aktyvus virusas

replikacija įvyko Nlrc3-/- pelių kraujyje, blužnyje ir inkstuose po HTNV infekcijos. Galiausiai, mes panaudojome imunofluorescenciją, kad nustatytų HTNV NP ekspresijos lygius blužnyje ir inkstuose. HTNV NP FL fluorescencijos intensyvumas buvo didesnis inkstuoseinkstųNlrc3−/− pelių kanalėliai (2E pav.) ir blužnies raudonoji minkštimas (2F pav.) nei WT pelėms esant 6 dpi ir 9 dpi. Kartu šie rezultatai rodo, kad Nlrc3-/- pelės yra jautresnės intraperitoninei HTNV infekcijai.

Įprasti Nlrc3−/− pelių kraujo tyrimai užsikrėtus HTNV

Visuotinai pripažinta, kad HFRS patologija daugiausia priklauso nuo imuninės sistemos, įskaitant imuninius kompleksus, komplemento aktyvaciją, T ląstelių atsaką (24–26) ir HTNV sukeltą citokinų gamybą (26, 27), dėl ko pažeidžiami keli organai. Be to, trombocitopenija yra dažnas klinikinis požymis užsikrėtusiems virusinės hemoraginės karštinės (VHF) virusais. Taigi, pirmiausia atlikome hematologinį tyrimą, naudodami visą kraują, paimtą iš Nlrc3-/- ir WT pelių 3, 6, 9 ir 12 dpi. Rezultatai parodė, kad WT pelių PLT skaičius sumažėjo esant 3 dpi, o po to palaipsniui atsigavo, tačiau jis toliau mažėjo Nlrc3−/− pelėms, kol pasiekė žemiausią reikšmę esant 9 dpi, žymiai mažiau nei WT esant 9 dpi (P<0.05) (figure="" 3a).="" the="" decrease="" of="" wbc="" counts="" was="" observed="" on="" 3="" dpi="" and="" then="" gradually="" recovered="" to="" normal="" levels="" in="" both="" mouse="" strains="" (figure="" 3b).="" to="" further="" dissect="" the="" subset="" changes="" in="" wbcs,="" we="" analyzed="" on="" 0,="" 3,="" 6="" dpi="" the="" number="" of="" monocytes,="" neutrophils,="" lymphocytes,="" and="" t="" cells="" by="" routine="" blood="" tests="" combined="" with="" fellow="" cytometry="" assay.="" the="" number="" of="">

žymiai padidėjo Nlrc3-/- pelėms esant 6 dpi, bet ne WT pelėms (3C pav.). Abiejų tipų pelių neutrofilai šiek tiek sumažėjo, bet atsigavo iki vidutinio lygio esant 6 dpi (3D pav.). Limfocitų skaičius žymiai sumažėjo esant 3 dpi, o WT pelėms pradėjo didėti esant 6 dpi, limfocitų skaičius išliko žemas esant 6 dpi Nlrc3-/- pelėms (3E pav.). CD3 plius CD4 plius T ląstelių ir CD3 plius CD8 plius T ląstelių santykis periferiniame kraujyje buvo nustatytas kolegų citometrijos metodu ir nustatyta, kad jis padidėjo esant 3 dpi, o po to greitai pasikeitė ties 6 dpi, o tai atitinka pokyčius, dažnai stebimus pacientams, sergantiems HFRS (pav. 3F), kurių CD4 plius T ląstelės smarkiai sumažėjo, o CD8 plius T ląstelės išlieka nepakitusios arba kompensacinės išsiplėtusios, kad susidarytų atvirkštinis CD4 / CD8 santykis. Šie radiniai leido manyti, kad intraperitoninė HTNV inokuliacija į Nlrc3-/- peles tam tikru mastu sukėlė pagrindinius HTNV užsikrėtusių pacientų klinikinius požymius, tokius kaip trombocitopenija ir atvirkštinis CD4/CD8 T ląstelių santykis.

Patologiniai pokyčiai infekuotų Nlrc3−/− pelių inkstuose rodo ryškų inkstų intersticinį kraujavimą ir inkstų kanalėlių išsiplėtimąTada patologiniai HTNV infekuotų pelių pokyčiai buvo įvertinti H&E dažymu ir nustatyta, kad jų yra visų infekuotų Nlrc3-/- pelių inkstuose, kurie pasireiškė kaip edema.inkstųkanalėlių epitelio ląstelės. Esant 6 dpi, buvo pastebėti hemoraginiai pažeidimaiinkstųmedulla (4A pav.).Inkstų kanalėlisišsiplėtimas buvo pastebėtas anksti 3 dpi, jo sunkumas pasiekė 9 dpi ir išliko iki 12 dpi, o Nlrc3-/- pelėms jis yra ryškesnis nei WT pelėms (4B, C paveikslai). Šios išvados parodė

kad ūminei nefropatijai būdingainkstų kanalėliųišsiplėtimas irinkstų intersticinis kraujavimasbuvo sukeltas HTNV užkrėstose Nlrc3-/- pelėse. Kalbant apie kitus patologinius kepenų, blužnies, plaučių pokyčius, šios dvi pelių grupės parodė panašius rezultatus. Tai daugiausia apėmė ekstrameduliarinę hematopoezę blužnyje, alveolių sienelės sustorėjimą plaučiuose ir kepenų degeneraciją (papildomi 3A – F paveikslai). Remiantis tuo, kas išdėstyta pirmiau, patologiniai požymiai, pastebėti Nlrc3-/- pelių inkstuose ūminės HTNV infekcijos fazės metu, buvo labai panašūs į klinikinius-patologinius pokyčius žmogaus HFRS atvejais.

Remdamiesi tuo, mes toliau ištyrėme susijusius pelių kraujo ir šlapimo indeksus dėl inkstų funkcinių sutrikimų. Pelės serumai buvo surinkti alanino aminotransferazės (ALT), kreatinkinazės MB frakcijos (CK-MB), karbamido, taip pat šlapimo rūgšties (UA) įvertinimui. Kaip parodyta 4D paveiksle, lyginant su kontrolinėmis WT pelėmis, Nlrc3-/- pelių UA kiekis serume buvo reikšmingai padidėjęs 3 dpi, Nlrc3-/- pelių CK-MB kiekis serume buvo reikšmingai padidėjęs 9 dpi, bet serumo lygis. ALT, UREA ir CREA nepadidėjo (1 papildoma lentelė).

InkstųĮtraukimas į HFRS, užkrėstą PUUV, apima trumpalaikę proteinuriją, mikroskopinę, bet retai matomą hematuriją ir oligurinį AKI, po kurio seka poliurija ir pasveikimas. Būdingas proteinurijos požymis sergant šia liga buvo greitas jos sumažėjimas po ūminės ligos fazės (6). Didelėje pacientų grupėje, sergančių įvairių etiologijų sukeltu ūminiu tubulointersticiniu nefritu, proteinurija nustatyta tik ketvirtadaliui pacientų, o tik 2 procentams visų pacientų nustatyta nefrozinė proteinurija (28). Mes surinkome šlapimą 0, 3, 6 dpi ir nustatėme, kad baltymų kiekis šlapime padidėjo 3 dpi, tai yra ūminė infekcijos fazė. Šlapimo baltymų koncentracija buvo žymiai padidėjusi, o vidutinė vertė buvo artima 0,3 g/l esant 3 dpi infekuotoms Nlrc3-/- pelėms ir WT pelėms (4E pav.).

Ištirti infiltruotas uždegimines ląstelesinkstųintersticinis po HTNV infekcijos, atlikome imunohistocheminį (IHC) dažymą su CD3, F4/80 ir CD11b. Rezultatai parodė, kad grupė imuninių ląstelių, teigiamų CD3, įsiskverbė įinkstųintersticinis po HTNV infekcijos (5A pav.), o mieloidinės ląstelės, turinčios teigiamą CD11b, atsirado žievės kanalėlių intersticijoje (5B pav.). Infiltruojančių CD3 plius T ląstelių ir CD11b plius mieloidinių ląstelių dalis užkrėstose Nlrc{5}}/- pelėse yra žymiai didesnė nei WT pelėse, tačiau makrofagai, kurių F4/80 yra teigiami, pasiskirstę visoje inkstų žievėje ir smegenyse ir neparodė reikšmingų skirtumas tarp šių dviejų pelių tipų (5C pav.).

HTNV infekcija sukėlė tvirtą citokinų atsaką Nlrc3−/− pelėms

Uždegiminių citokinų perprodukcija dažnai pranešama pacientams, sergantiems HFRS, ir dėl to kyla hipotezė, kad citokinų reguliavimo sutrikimas gali atlikti pagrindinį vaidmenį ligos patogenezėje. Vaheri ir kt. (8) nustatė, kad daugybę citokinų gamina įvairios ląstelės, tokios kaip makrofagai, monocitai ir limfocitai, reaguodamos į uždegimą skatinančius signalus, tokius kaip virusinė infekcija. Wang ir kt. pranešė, kad TNF-a, IL-6, IFN-g, IL-8, IP-10 ir RANTES (bet ne IL-4) koncentracija serume buvo gerokai padidėjusi HFRS sergančių pacientų (29), palyginti su kontrolinėmis grupėmis; ir kad didžiausia koncentracija paprastai buvo nustatyta karščiavimo, hipotenzijos ir oligurinės fazės metu, ypač sunkiais ir kritinio tipo HFRS atvejais. Aukštas IL-6 kiekis plazmoje buvo susijęs su sunkiuinkstųPUUV sukelto HFRS nepakankamumas ir trombocitopenija ir gali būti naudojami kaip ligos sunkumo žymuo.

Mūsų rezultatai parodė, kad HTNV infekcija padidino citokinų gamybą, įskaitant CXCL-1, CCL-5, IL-6, IL-12, TNF-a ir IFN-g. Nlrc3-/- pelių, o šių citokinų lygis pasiekė aukščiausią tašką ties 6 arba 9 dpi; Palyginimui, WT pelių citokinų atsakas buvo silpnesnis viso infekcijos proceso metu (6 pav.).

Apibendrinant, šiame tyrime nustatėme, kad po intraperitoninės HTNV inokuliacijos pelėms Nlrc3−/− sumažėja svoris,inkstų kraujavimas, ir kanalėlių išsiplėtimas. Šios savybės labiau primena klinikinius HFRS simptomus nei bet kuris kitas anksčiau paskelbtas gyvūnų modelis. Be to, Nlrc3-/- pelėms taip pat buvo didesnis virusų kiekis serume, blužnyje ir inkstuose nei WT pelėms, o Nlrc3-/- pelėms išsivystė hematologinis sutrikimas ir reikšmingi patologiniai pokyčiai keliuose organuose, todėl buvo nustatyta Nlrc3-/ HTNV infekcija. − pelės kaip naujas HFRS tyrimo modelis.

DISKUSIJA

Čia aprašytas HFRS pelės modelis rodo, kad HTNV užkrėstos Nlrc3-/- pelės yra tinkamas mažų gyvūnų modelis, kuris gali būti naudojamas vertinant HFRS vakcinas ir gydymo priemones. Nlrc3−/− pelės modelis primena sistemingą žmonių sužalojimą, kuriam būdinga trombocitopenija, limfocitopenija, padidėjęs AST (kepenų funkcijos sutrikimas), LDH, kreatinkinazės MB frakcijos ir UA kiekis serume.(inkstų funkcijos sutrikimas). Be to, Nlrc3-/- pelėms sumažėjo svoris ir pastebimasinkstų kraujavimas. Plaučiuose, blužnyje, kepenyse ir inkstuose buvo aptikta viruso dauginimosi ir histopatologinių pokyčių tiksliniuose organuose. Be to, Nlrc3-/- pelių kraujyje, blužnyje ir inkstuose buvo nustatytas šiek tiek didesnis virusinės RNR kiekis. Palyginimui, WT pelėms išsivystė lengvi histologiniai pokyčiai, nepaisant virusinės RNR aptikimo kraujyje, blužnyje ir inkstuose.

Our findings are generally in agreement with what would be expected for HTNV infection-induced HFRS and signify an improvement over previously published animal models. It has been reported that hemorrhagic fever (HF) virus infection in animal models can lead to a spectrum of diseases from asymptomatic to mild and severe and often transient viremia. A transient weight loss usually manifests mild illness, but severe disease showed more significant weight loss (>20 procentų) (30). Pavyzdžiui, žiurkėnai, užsikrėtę HTNV per nosį, sukėlė nuolatinę besimptomę infekciją, kuriai būdinga sporadinė viremija, bet didelis viruso genomo kopijų kiekis plaučiuose, smegenyse ir inkstuose. Šeškams, užsikrėtusiems didele HTNV doze švirkščiant į raumenis, kūno svoris laipsniškai mažėjo (laikui bėgant 5-12 proc.), tačiau jie buvo nepažeisti.inkstų funkcijos, viremijos nebuvimas ir viruso perdavimo į organus trūkumas. Marmozetėms HTNV injekcija į raumenis sukėlė didelį serokonversijos laipsnį ir neutralizuojančių antikūnų gamybą; nuosekliai šie gyvūnai neturėjo inkstų pažeidimo, viremijos ar viruso perdavimo į organus (13).

Kalbant apie pastebėjimą, kad hematologiniai pokyčiai, pastebėti tik vienu laiko momentu, o citokinų pokyčiai nėra reikšmingi, manome, kad juos galima paaiškinti HTNV infekcijos pobūdžiu, kuri yra panaši į daugelį kitų virusinių infekcijų, kurios pažeidžia kelis organus ir todėl dažnai. sunku rasti ilgalaikius vieno parametro pokyčius. Apskritai, mūsų išvados iš esmės atitinka turimas žinias šioje srityje. Be to, atradimas Nlrc3-/- pelių, kurios yra jautresnės HTNV infekcijai ir turi daug pokyčių, panašių į patologinius HFRS pokyčius, yra naujas indėlis į šią sritį. Visuotinai pripažįstama, kad žmogaus kraujagyslių endotelio ląstelės yra pagrindiniai hantaviruso taikiniai. , kuris sukelia įvairaus laipsnio generalizuotą kapiliarų išsiplėtimą ir edemą (31).

Viruso antigenų galima rasti įvairių audinių kapiliariniame endotelyje (hantavirusai nukreipia endotelio ląstelių pralaidumą, jautrindami ląsteles kraujagyslių pralaidumo faktoriui VEGF, o angiopoetinas 1 ir sfingozino 1-fosfatas slopina hantaviruso nukreiptą pralaidumą). Histologinė analizė parodė, kad buvo pastebėti Nlrc3-/- pelių inkstaiinkstų kanalėliųišsiplėtimas esant 9 dpi, Nlrc3-/- pelėms su sunkesniais patologiniais pokyčiais nei WT pelėms ir jos išliko 12 dpi. Nlrc3-/- pelėms buvo pastebėta inkstų kanalėlių epitelio ląstelių edema ir didelis inkstų intersticinis kraujavimas. Be to, esant 6, 9 ir 12 dpi buvo pastebėta ryški ekstrameduliarinė hematopoezė raudonojoje blužnies pulpoje, o gemalo centro išsiplėtimas ir padidėjęs daugiabranduolių milžiniškų ląstelių skaičius 12 dpi. Kepenys taip pat parodė sunkią hepatocitų degeneraciją ir išsklaidytą nekrozę 3, 6, 9 ir 12 dpi dienomis. Plaučių uždegimas ir alveolių sienelių sustorėjimas buvo stebimas 6 dpi. Šis atradimas rodo, kad HTNV infekcija turėjo reikšmingą ir ilgalaikį poveikį kepenims ir inkstams HTNV užkrėstose Nlrc3-/- pelėse. Be to, Nlrc3-/- pelės buvo ryškiosinkstų kanalėlių išsiplėtimas, intersticinis kraujavimas ir inkstų funkcijos sutrikimas po HTNV infekcijos. UA lygis serume buvo žymiai padidėjęs 3 dpi, o tai aiškus inkstų funkcijos sutrikimo požymis. Užkrėstų Nlrc3-/- pelių baltymų koncentracija šlapime buvo reikšmingai padidėjusi, o vidutinė vertė buvo artima 0,3 g/l esant 3 dpi. Tokia pati UA padidėjimo tendencija nebuvo pastebėta WT pelėms. Šie rezultatai rodo, kad mūsų modelis apibendrina daugiau patologinių žmogaus HTNV infekcijos požymių.

N baltymas (NP) gausiai gaminamas hantavirusu užkrėstose ląstelėse ir gali būti aptiktas anksti praėjus 4 valandoms po užsikrėtimo (32). Šios savybės yra pagrindinė priežastis, kodėl ELISA tikslas yra aptikti hantaviruso N baltymą ir imunofluorescencinius tyrimus, siekiant įvertinti viruso dalelių skaičių ir virusinės infekcijos progresavimą. Skirtingi metodai gali turėti įtakos gautiems rezultatams ir padarytoms išvadoms. Virusinis baltymas ir viremija yra du skirtingi virusinės infekcijos parametrai ir jie ne visada gali keistis sinchroniškai. Kiekybinės realaus laiko PGR rezultatai parodė, kad blužnyje, kur virusas galėjo būti trumpalaikis replikacija, NP lygis laikinai padidėjo 6 dpi, o po to buvo pašalintas. Kaip ir tikėtasi, viruso baltymų kaupimasis buvo pastebėtas po didžiausios viremijos, kuri pasirodė esant 3 dpi. Iš tiesų, viruso replikacija blužnyje ir inkstuose buvo palaikoma vidutinio lygio esant 9 ir 12 dpi, kartu su N baltymų sinteze (blužnis esant 9 dpi: WT pelėms: 192 ± 128 kopijos mg; Nlrc3-/- pelėms: 431 ± 1 229 kopijos mg; blužnis 12 dpi: WT pelės: 160 ± 85 kopijos mg; Nlrc3-/- pelės: 226 ± 118 kopijos mg). Tačiau HTNV NP kiekis baltymų lygiu pasiekė maksimumą 6 pi dieną ir išliko padidėjęs per 9 ir 12 dpi. Viruso RNR kopijų kinetikos ir baltymų kiekio skirtumas gali atspindėti skirtingą jų skilimą skirtinguose organuose.

Citokinų vaidmuo ligų modeliuose paprastai yra sudėtingesnis. Esant PUUV sukeltam HFRS, sunkusinkstų nepakankamumasir trombocitopenija yra susiję su dideliu plazmos IL{0}} kiekiu (33). Mūsų analizė parodė, kad HTNV infekcija padidino citokinų gamybą, įskaitant CXCL-1, CCL-5, IL-6, IL-12, TNF-a ir IFN-g. Nlrc3−/− pelėms, bet ne tiek daug WT pelėms. Verta paminėti, kad esant 9 dpi, Nlrc3-/- pelėms pasireiškė nepaprasti patologiniai blužnies ir inkstų pokyčiai, kuriuos lydėjo tvirtas citokinų atsakas. Šie radiniai rodo, kad didelis citokinų kiekis gali būti susijęs su ligos patogeneze.

Apibendrinant galima pasakyti, kad čia pateikti rezultatai rodo, kad po intraperitoninio inokuliavimo HTNV pelėms Nlrc3-/- atsiranda svorio mažėjimas, trombocitopenija, renal disfunkcija ir kraujavimas.Tai labiau primena klinikinius HFRS simptomus nei bet kuris kitas anksčiau paskelbtas gyvūnų modelis. Šis modelis gali būti naudojamas potencialioms vakcinoms ir terapijoms įvertinti bei nuodugniam HFRS patogenezės tyrimui in vivo.