Obakunonas susilpnina kepenų fibrozę, sustiprindamas antioksidacinį GPx-4 poveikį ir slopindamas EMT

Prašau susisiektioscar.xiao@wecistanche.comDaugiau informacijos

Santrauka:Obakunonas, limonino triterpenoidas, ekstrahuotas iš Phellodendronchinense Schneid arba Dic-tamnus dasycarpusb Turcz augalo, sukelia įvairius farmakologinius poveikius, tokius kaip priešuždegiminis, antinavikinis, antioksidacinis ir anti-plaučių fibrozės poveikis. Tačiau antifibrozinis oba kūgio poveikis ir išsamus kepenų fibrozės mechanizmas lieka neaiškus. Kepenų fibrozė yra sekinanti liga, kelianti grėsmę žmonių sveikatai. Transformuojantis augimo faktorius (TGF)-/P-Smad yra pagrindinis fibrozės kelias, pasireiškiantis epitelio-mezenchiminėmis transformacijomis (EMT) ir kolageno nusėdimu, kartu su pernelyg dideliu laisvųjų radikalų kiekiu. Nrf{12}} veikia kaip pagrindinis antioksidacinis reguliatorius, skatinantis įvairių su antioksidantais susijusių genų išraišką. Glutationo peroksidazė-4(GPx-4) yra glutationo peroksidazės šeimos narė, kuri tiesiogiai slopina fosfolipidų oksidaciją, kad sumažintų oksidacinį stresą. Šiame tyrime siekėme ištirti stuburo vaidmenį pelių kepenų fibrozės modelyje, kurį sukelia anglies tetrachloridas (CCl4), ir kepenų žvaigždžių ląstelėse (LX2 ląstelių linija), užkrėstose TGF-. Obakunonas parodė stiprų gerinantį poveikį kepenų fibrozei tiek aktyvuotame LX2, tiek pelių kepenų audiniuose su sumažėjusiu -SMA, kolageno1 ir vimentino kiekiu. Obakunonas taip pat nepaprastai slopino TGF-/P-Smad signalus ir EMT procesą. Tuo tarpu obakunonas padarė stiprų antioksidacinį poveikį, nes sumažino reaktyviųjų deguonies rūšių (ROS) kiekį abiejuose modeliuose. Antioksidacinis stuburo poveikis buvo priskirtas GPx-4 ir Nrf-2 aktyvavimui. Be to, terapinis stuburo poveikis LX2 ląstelėms buvo žymiai sumažintas in vitro ir naudojant GPx-4 antagonistą RSL3, lygiagrečiai su pakartotiniu ROS lygiu.puritanai vitaminas cTaigi parodome, kad stuburas gali susilpninti kepenų fibrozę, sustiprindamas GPx-4 signalą ir slopindamas TGF-/P-Smad kelią ir EMT procesą.

Raktiniai žodžiai:stuburas;kepenų fibrozė; EMT;kepenų žvaigždžių ląstelės; GPx-4;TGF- ;oksidacinis stresas

Norėdami sužinoti daugiau, spustelėkite čia

1. Įvadas

Lėtinį hepatitą dažniausiai sukelia virusinis hepatitas, nealkoholinė steatozė, alkoholinis hepatitas ir autoimuninis hepatitas. Nuolatinis kepenų pažeidimas gali baigtis kepenų fibroze ar net kepenų vėžiu, kuris mirtinai paveikė žmonių sveikatą [1]. Kepenų fibrozė yra žaizdos negyjančio atsako tipas esant nuolatiniams pažeidimo veiksniams, kuriam būdingas per didelis ekstraląstelinės matricos (ECM) kaupimasis ir randų susidarymas [2]. Kepenų žvaigždžių ląstelės (HSC) normaliomis sąlygomis paprastai būna ramybės būsenoje, jos nenormaliai suaktyvėjo dėl lėtinio kepenų pažeidimo ir pasižymėjo dideliu ECM [3], vadinamų miofibroblastais [4], proliferacija ir sekrecija. HSC aktyvavimo mechanizmo supratimas yra labai svarbus kuriant naujus gydymo būdus kepenų fibrozei gydyti.

Transformuojantis augimo faktorius (TGF-) skatina uždegiminius atsakus, skatindamas interleukino-1 (IL-1) ir interleukino-6(IL-6) ekspresiją monocituose [5]. Be to, jis sukelia vėžio metastazes per epitelio-mezenchiminę transformaciją (EMT) ir naviko imuninį pabėgimą [6-8]. EMT reiškia dinamišką fiziologinį procesą, kurio metu epitelio ląstelės praranda savo poliškumą ir virsta mezenchiminėmis ląstelėmis, tokiomis kaip fibroblastai ir miofibroblastai, todėl išsivysto fibrozė [9]. EMT atsiradimas visada yra susijęs su sumažėjusiu E-kadherino reguliavimu ir mezenchiminių ląstelių žymenų, tokių kaip N-kadherinas ir sraigė, reguliavimu [10]. TGF- -Smad aktyvacija yra vienas iš pagrindinių tarpląstelinių EMT ir miofibroblastų susidarymo būdų [11].

Oksidacinis stresas laikomas viena iš pagrindinių fibrozės priežasčių, kai susidaro per daug reaktyviųjų deguonies rūšių (ROS)[12]. Didelis ROS lygis sukelia struktūrinę žalą biomolekulėms, tokioms kaip baltymai, lipidai ir DNR, galiausiai sukelia ląstelių pažeidimus ir skatina fibrozę [13]. Esant oksidaciniam stresui, Nrf{2}}Keep-1 dimeras yra disocijuotas, branduolinis kvėpavimo faktorius-2(Nrf-2) pernešamas į branduolį ir skatina įvairių antioksidaciniai fermentai, jungdamiesi su antioksidaciniais atsako elementais (ARE), sumažina ROS kiekį[14]. Glutationo peroksidazė-4 (GPx-4) ​​veikia kaip antioksidacinis baltymas, pasižymintis glutationo peroksidazės aktyvumu, daugiausiai atsakingas už fosfolipidų oksidacijos ir ROS gamybos slopinimą ferroptozės procese [15].SistancheTyrimai su pelėmis parodė, kad fibrozė paūmėja praradus Nrf{0}} arba GPx-4 [16,17].

Cistanche gali kovoti su senėjimu

Šiuo metu yra keletas vaistų, skirtų kepenų fibrozei gydyti, įskaitant tuos, kurie turi priešuždegiminių [18], antioksidantų [19] ir peroksisomų proliferatorių aktyvuotų receptorių (PPAR) agonistų [20]. Neseniai atliktame tyrime prof. Yu nustatė, kad pacientų, sergančių kepenų ciroze, lipidų oksidacijos lygis yra didesnis nei sveikų kontrolinių klinikinių mėginių [21]. Kai kurie antioksidantai, tokie kaip resveratrolis[19] ir ursolio rūgštis |13], parodė gerą poveikį fibrozei. Šie įrodymai kartu rodo, kad antioksidacija yra perspektyvi kovos su fibroze strategija.

Pirfenidonas (PFD) yra piridino vaistas nuo idiopatinės plaučių fibrozės (IPF), o daugelio tyrimų metu jis taip pat turi gerą gydomąjį poveikį kepenų fibrozei [22, 23]. Taigi šiame tyrime PFD pasirinktas kaip teigiamas kontrolinis vaistas. Obakunonas (Oba) yra natūralus limonoidinis junginys, išgaunamas iš rūtinių augalų, tokių kaip Phellodendri ir Dictamnus-dasycarpus [24], pasižymintis įvairiomis biologinėmis savybėmis, pvz., priešuždegiminėmis |25, antioksidacinėmis [26] ir priešnavikinėmis savybėmis [27]. Naujausi pranešimai atskleidė, kad Oba yra stiprus Nrf-2 agonistas, kuris veiksmingai sumažino plaučių fibrozę dėl CCL4 indukcijos ir oksidacinį MDA-MB-231 ląstelių pažeidimą, kurį sukelia H, O2. Dar svarbiau, kad Oba nėra toksiška pelėms [28]. Tačiau nepranešama apie Oba poveikį kepenų fibrozei, ypač apie GPx-4, tarpininkaujančią antifosfolipidų oksidacijai, TGF- -Smad signalus ir EMT procesą. Čia mes ketiname ištirti Oba poveikį kepenų fibrozei ir apibrėžti pagrindinius molekulinius mechanizmus.

2. Rezultatai

2.1. Oba slopinamas TGF- -sukeltas Lx-2 aktyvinimas

Since the activated HSCs (aHSCs)played a critical role in liver fibrosis [3], we first observed the effects of Oba on liver fibrosis in aHSCs. In this experiment, we used the Cell Counting Kit-8(CCK8) to detect the toxicity of Oba on LX-2 cells, a type of human HSCs line. We found that LX-2 cells survival was not significantly affected by Oba at the concentration range of 10 to 160 uM during 24/48/72 h treatment (Figure 1A). Then, the LX-2 cells were stimulated with 10 ng/mL TGF-β for 24 h and then treated with Oba or not. the protein expression of α-Smooth muscle actin (α-SMA) was effectively inhibited at concentrations of >20 uM Oba. Įdomu tai, kad padidėjus Oba koncentracijai, a-SMA slopinimo poveikis reikšmingai nepadidėjo (1B pav.).kas yra cistancheTaigi kitam eksperimentui pasirinkome 20 μM koncentraciją, o PFD buvo teigiama kontrolė. Oba veiksmingai slopino -SMA, kolageno -1, vimentino ir jungiamojo audinio augimo faktoriaus (CTGF) baltymų kiekį (1C pav.) aHSC[3,4]. Be to, Oba sumažino -SMA, kolageno -1 ir vimentino mRNR ekspresijos lygius (1D pav.). Imunofluorescencijos rezultatai dar labiau patvirtino, kad teigiamus -SMA dažymosi signalus akivaizdžiai sumažino Oba (palyginti su TGF- grupės, nes raudonųjų kraujo kūnelių skaičius sumažėjo po gydymo Oba) Lx{11}} (1E pav.). Šie rezultatai rodo, kad Oba daro gerą Lx-2 aktyvinimo slopinimo poveikį.

2.2. Oba slopinami TGF-/Smad signalai, EMT procesas ir sukeltas priešuždegiminis poveikis

Siekiant apibrėžti molekulinius mechanizmus, kuriais grindžiamas minėtas antifibrozės poveikis, buvo stebimi TGF receptorių, P-Smad ir -SMA baltymų ekspresijos lygiai, kuriuos Oba reikšmingai slopino aHSC (2A pav.). Be to, baltymas buvo sumažintas N-kadherino ir sraigės ekspresijos lygis, o E-kadherino baltymų ekspresijos lygis buvo skatinamas (2B pav.), o tai rodo, kad EMT kelias taip pat buvo užblokuotas [3]. Be to, nustatėme, kad Oba sumažino IL-6 lygį (2C pav.).Anti-senėjimo cistancheNorėdami toliau įvertinti Oba poveikį uždegimui, pirmiausia stimuliavome HepG-2 ląsteles (žmogaus hepatoceliulinės karcinomos ląstelių linijos tipą) 20 nmol CCl4, po to apdorojome 20 uM Oba. Šie rezultatai parodė, kad Oba gali sumažinti IL-6 mRNR ir baltymų ekspresijos lygius CCl4-stimuliuojamame HepG-2 (2D pav.). Apskritai, oba pasižymėjo daugybe antifibrozės efektų. slopindamas TGF-/Smad signalus ir EMT procesą, taip pat priešuždegiminį.

2.3. Oba anti-fibrozės poveikis priklausė nuo padidinto antioksidacinio pajėgumo aktyvavus GPXx-4

In order to further define the underlying molecular mechanisms of Oba in aHSCs, we discovered that Oba activated the Nrf-2/Keap-1 pathway and reduced the protein expressions of Nox-2 (Figure 3A).In addition, we found that Oba increased the protein expression level of GPx-4(Figure 3B). To validate the importance of the GPx-4-mediated signal, RSL3, which is an inhibitor of GPx-4 [29], was selected to deal with Lx-2. Examination by using the CCK8 （Figure 3C）revealed that at concentrations of RSL3>{0}},75 μM, Lx-2 ląstelių gyvybingumas buvo žymiai sumažėjęs; todėl buvo pasirinktas 0.75-μM RLS, kad įsiterptų į GPx-4 raišką. Western blot rezultatai parodė, kad pridėjus RSL3 į aHSC, GPx-4 baltymo ekspresija sumažėjo ir visi profibrotiniai žymenys, įskaitant -SMA ir vimentiną, buvo reikšmingai pakeisti, o tai rodo GPx -4 svarbą tarpininkaujant Oba antifibrozei (3D pav.). Tuo tarpu Oba akivaizdžiai sumažino aHSC ROS lygį ROS fluorescenciniais detektoriais, o šį efektą, matyt, blokavo RSL3 (pav.). Šie duomenys parodė, kad GPx -4 tarpininkaujantis mažesnis fosfolipidų ROS lygis buvo pagrindinė antifibrozės priemonė. Obos signalas.

2.4. Oba susilpnina CCl4-sukeltą pelių kepenų fibrozę

CCl4-sukelta kepenų fibrozė yra vienas iš dažniausiai naudojamų pelių modelių kepenų fibrozei tirti [3]. Histologiniu lygiu Oba žymiai palengvino kepenų patologiją, o tai patvirtina pagerėjusios kolageno nuosėdos, nurodytos naudojant Masson dažymą ir anti-SMA dažymą. (4A-D pav.). Tada buvo nustatytas alanino transaminazės (ALT) / aspartato transaminazės (AST) kiekis serume, siekiant ištirti kepenų pažeidimo lygį, palyginti su CCL4 pelėmis, mažos dozės Oba grupė ir PFD grupė žymiai sumažino ALT lygį (p<0.05)(figure 4e).="" expectedly,="" oba="" inhibited="" the="" protein="" expression="" levels="" of="" collagen-1,="" ctgf,="" and="" α-sma="" in="" mouse="" fibrotic="" livers,="" which="" were="" consistent="" with="" the="" immunohistologic="" results="" (figure="" 4f).="" these="" in-vivo="" results="" illustrated="" that="" oba="" significantly="" improved="" the="" ccl4-induced="" mouse="" liver="">

2.5. Oba pagerino GPx-4 raišką, sumažino uždegimą, su EMT susijusią baltymų ekspresiją ir sumažino lipidų oksidacijos lygį sergant CCl4-sukelta kepenų fibroze

Kaip parodyta 5A paveiksle, Oba slopino IL-6 baltymų ekspresiją ir EMT atsiradimą pelių fibrozinėse kepenyse su mažesniu sraigių ir N-kadherino kiekiu, bet didesniu E-kadherino kiekiu. Be to, po gydymo vidutinėmis ir didelėmis Oba dozėmis akivaizdžiai padidėjo Nrf{4}} ir GPx-4 baltymų ekspresija (5B pav.).cistanche benefíciosImunohistocheminio dažymo (IHC) rezultatai parodė, kad, palyginti su modelio grupe, GPx -4 teigiamų ląstelių (rudųjų) skaičius didelės ir vidutinės dozės Oba grupėse žymiai padidėjo (5C, E pav.). Toliau išbandėme oksidacinio streso lygį pelių kepenyse ir nustatėme, kad, lyginant su kontrole, modelio grupės ROS fluorescencijos intensyvumas buvo akivaizdžiai didesnis. Kita vertus, po gydymo Oba ROS lygis žymiai sumažėjo (5D pav., F).

3. Diskusija

Fibrozė yra pavojinga liga pasaulyje. Nepriklausomai nuo etiologijos, įskaitant virusinę infekciją, alkoholinį ar nealkoholinį hepatitą ir autoimunines reakcijas, dėl lėtinio kepenų pažeidimo atsiranda fibrozė [1]. HSC aktyvacija yra pagrindinis kepenų fibrozės įvykis. HSC aktyvuojami dėl įvairių fibrogeninių faktorių ir ECM nuosėdų susidarymo [2, 3]. Pranešama, kad su TGF- - susijusi kanoninė Smad aktyvinimo signalizacija, EMT procesas ir su IL-6- susijęs lėtinis uždegimas yra susiję su pirmiau minėtais procesais [3,4]. Norėdami įvertinti Oba antifibrozinį poveikį kepenų fibrozei, pirmiausia mes sutelkiame dėmesį į jo poveikį Lx-2 aktyvacijai, kurią sukelia TGF-, o tada patikriname jo antifibrozinį poveikį in vivo naudojant CCl4-sukeltas kepenų fibrozės pelių modelis.

Oba yra natūralus limonoidinis junginys [24], o jo biologinis poveikis daugiausia apima priešuždegiminį [25], antioksidacinį [26] ir priešnavikinį [27] poveikį. Neseniai buvo nustatyta, kad Oba yra stiprus ir veiksmingas Nrf{6}} agonistas ir veikia pelėms nuo plaučių fibrozės [28]. Tačiau vis dar trūksta įrodymų apie jo poveikį prieš kepenų fibrozę ir susijusius molekulinius mechanizmus. Čia Oba slopino pernelyg didelę -SMA, kolageno 1 ir CTGF ekspresiją Lx-2 modeliuose, stimuliuotuose TGF-. Oba taip pat veiksmingai slopina patobulintą EMT signalizaciją.

Patvirtinta, kad oksidacinis stresas yra svarbus fibrozės veiksnys [12]. Reaktyviosios deguonies rūšys (ROS) yra bendras terminas, apibūdinantis oksiduotas molekules arba jonus, turinčius biologinį aktyvumą, o įvairių ROS perteklius hepatocituose gali sukelti jo mirtį ir sukelti kepenų fibrozę [13]. Priešingai, ramybės būsenos HSC suaktyvėja po kepenų ląstelių pažeidimo, o per didelis ROS sustiprina daugiau HSC aktyvacijos ir baigiasi kepenų fibroze [12]. Todėl perdėto oksidacinio streso slopinimas tampa veiksmingu fibrozės gydymo būdu.

Nrf{0}} yra svarbus antioksidacinio streso reguliatorius, aktyvuotas fosforilintas Nrf-2 yra perkeliamas į branduolį, kad būtų skatinamas pasroviui esančių antioksidantų baltymų GST, HO1[15] reguliavimas. Pranešama, kad daugelis natūralių cheminių Nrf2 aktyvatorių, tokių kaip tret-butilhidrochinonas ir kurkuminas, turi antifibrozės poveikį. Tarp visų antioksidacinių baltymų glutationo peroksidazė-4(GPx-4) yra glutationo peroksidazių šeimos (GPx1-8) narė ir palengvina redokso pusiausvyrą, sumažindama glutationo [ 30-32]. Įrodyta, kad didesnė glutationo peroksidazės -7 raiška slopino nealkoholinę suriebėjusią kepenų ligą, mažindama ROS gamybą [33]. GPx-4 sumažino fosfolipidų peroksidą ant lipidų membranos, kad apsaugotų ląsteles nuo oksidacinio pažeidimo J15]. Kazuya Tsubouchi ir kt. nustatė, kad GPx-4 ekspresija sumažėja pelių plaučių fibrozės audiniuose, kuriuos sukelia bleomicinas, o fibrozė yra sunkesnė, kai išmušamas GPx-4 genas. Be to, lipidų peroksidacija ir TGF-/P-Smad kelias labai sustiprėja plaučių fibroblastuose, kai išeikvojamas GPx-4 genas [17]. Pastaruoju metu daugiau įrodymų patvirtino, kad fosfolipidų kilmės ROS dalyvauja specialioje ląstelių mirtyje, vadinamoje ferroptoze. GPx-4 inhibitorius RSL3 taip pat naudojamas kaip ferroptozės induktorius [21,34].

Atlikdami eksperimentus nustatėme, kad Oba išnaudojo antioksidacinį pajėgumą padidindama Nrf-2 ir GPx-4 bei sumažindama Nox-2 reguliavimą. Pažymėtina, kad Oba antifibrozinis poveikis buvo žymiai susilpnėjęs, kai GPx-4 geną slopino RSL3, GPx-4 inhibitorius. Nuosekliai buvo apšviestas ir sumažintas ROS lygis gydant Oba. Šie in vitro stebėjimai labai patvirtino, kad GPx-4-tarpininkaujantis antifosfolipidinis ROS buvo labai svarbus apsauginiam Obos poveikiui.

Siekiant patvirtinti aukščiau pateiktus Oba gydymo nuo fibrozės rezultatus LX2 ląstelėse, taip pat buvo ištirta CCl4- sukelta pelių kepenų fibrozė. CCl4 yra hepatotropinių nuodų tipas, dėl mikrosominio fermento P450 tarpininkaujamo skilimo susidaro labai reaktyvūs laisvieji radikalai, kurie sunaikina ląstelės membranos vientisumą, o tai savo ruožtu sukelia kepenų funkcijos sutrikimus ir sužalojimus, kurie galiausiai išsivysto į kepenų fibrozę [35]. Mūsų eksperimente Oba parodė gerą gydomąjį poveikį CCl sukeltai kepenų fibrozei. Sumažėjęs AST kiekis sumažino kepenų pažeidimą, sumažėjo kolageno skaidulų pluoštų plotas, sumažėjo a-SMA, CTGF, kolageno -1, sraigės, N-kadherino ir IL{10. }} buvo sumažintos. Nors antioksidacinis signalas, Nrf-2 ir GPx-4 baltymų ekspresija taip pat buvo padidėjusi, aukštesnis ROS lygis sumažėjo. Šie rezultatai dar labiau patvirtino Oba antifibrozinį poveikį in vitro ir susijusią signalizaciją, ypač EMT slopinimą ir Nrf{16}} bei GPx-4 antioksidacinį poveikį.

Apibendrinant padarėme išvadą, kad Oba įvairiais mechanizmais palengvino TGF{0}}sukeliamą HSC aktyvaciją ir CCl4-sukeliamą kepenų fibrozę. Pirma, Oba slopino klasikinį TGF-/Smad kelią, EMT ir IL-6 gamybą. Antra, jis demonstravo puikų antioksidacinį pajėgumą, pagerindamas Nrf-2 ir GPx-4 išraiškas. GPx-4tarpininkaujamas anti-fosfolipidinis ROS daugiausia prisidėjo prie jo antifibrozės poveikio. Todėl Oba gali būti cheminis regentas fibrozės profilaktikai ir gydymui.

Oba parodė tam tikrą gydomąjį poveikį CCl{0}}sukeltai kepenų fibrozei C57 pelėms. Oba galėjo sumažinti fibrozės baltymų biomarkerių, tokių kaip: -SMA, CTGF ir kt., ekspresiją. Tuo tarpu Oba sumažino I-6, E-kadherino ir tt baltymų ekspresiją. Įdomu buvo tai, kad Mid-Oba rodo geresnių rezultatų, palyginti su mažu Oba ir dideliu Oba, santykinės šių baltymų ekspresijos požymių, nors tai nėra statistiškai reikšminga. Tačiau jame nurodyta, kad optimali dozė gali būti kritinis veiksnys šiame procese, ir mes išnagrinėsime šį reiškinį kitame eksperimente. Be to, mes nustatėme, kad mažesnis ROS ir kepenų fibrozės laipsnis su aukštyn reguliuojančiomis Nrf{10}} ir GPx-4 išraiškomis. Taigi manome, kad Oba galėtų palengvinti kepenų fibrozę reguliuodama Nrf{12}} ir GPx-4. Tačiau PFD gali turėti geresnį terapinį poveikį nei Oba tiek in vivo, tiek vitro. Tačiau Oba buvo geresnis nei PFD dėl antioksidacinio poveikio, tai padidina galimybę rasti naują vaistą, turintį anti-kepenų fibrogeninį poveikį iš antioksidacinės pusės, ir šiek tiek prisideda prie žmonių sveikatos.

4. Medžiagos ir metodai

4.1. Cheminės medžiagos ir reagentai

Oba (nr. B20553, grynumas didesnis arba lygus 98 proc.) ir RSL3 (nr. S81241, grynumas didesnis nei 98 proc.) buvo įsigyti iš YUANYE Bio-Technology Co., Ltd. (Šanchajus, Kinija) ir ištirpinti dimetilsulfokside (DMSO) (nr. R21950; YUANYE) iki atitinkamai 72,64 mg/ml ir 6 mmol koncentracijos. Sterilizavus filtrą, gautas tirpalas buvo laikomas -20 C laipsnių temperatūroje. Tirpalas buvo įpiltas į auginimo terpę, kad būtų pasiekta galutinė DMSO koncentracija<1%. tgf-β="" was="" purchased="" from="" peprotech="" china="" (suzhou,="" china).="" ccl4="" was="" purchased="" from="" jiangsu="" qiangsheng="" chemical="" (jiangsu,="" china).="" a="" ros="" fluorescence="" probe="" kit="" was="" purchased="" from="" applygen(beijing,="" china).="" trizol,="" sybr="" premix="" ex="" taq="" reagents,="" revertaid="" first="" strand="" cdna="" synthesis="" kit,="" ripa,="" bca="" protein="" assay="" kit,="" and="" sds-page="" kit="" were="" purchased="" from="" thermo="" fisher="" scientific(waltham,="" ma,="" usa).="" the="" cell="" counting="" kit-8="" (cck8)was="" purchased="" from="" saint-bio="" (shanghai="" china).="" the="" primers="" were="" designed="" and="" synthesized="" by="" tsingke="" (xi'an,="" china).dapi,="" goat="" anti-mouse="" igg="" h&l(alexa="" fluor="" 594)(ab150120),="" anti-alpha="" smooth="" muscle="" actin="" antibody(ab7817),="" anti-vimentin="" antibody="" (ab20346),="" anti-il-6="" antibody="" (ab233706),anti-collagen-1="" antibody="" (ab34710),anti-smad3="" (phospho)="" antibody="" (ab52903),="" and="" anti-nox2/gp91phox="" antibody(ab80508)="" were="" purchased="" from="" abcam(cambridge,="" ma,="" usa).="" e-cadherin="" polyclonal="" antibody="" (20874-1-ap),="" n-cadherin="" polyclonal="" antibody="" (22018-1-ap),="" gpx4="" antibody="" (14432-1-ap),β-actin="" polyclonal="" antibody(20536-1-ap),="" nrf2="" polyclonal="" antibody="" (16396-1-ap),="" and="" keap1="" polyclonal="" antibody="" (10503-2-ap)="" were="" purchased="" from="" proteintech="" (rosemount,="" min,="" usa).ctgf="" polyclonal="" antibody(wl02602)="" and="" snail="" polyclonal="" antibody="" (wlo1863)were="" purchased="" from="" wanleibio="" (shenyang,="">

4.2. Ląstelių kultūros ir eksperimentinis dizainas

Žmogaus kepenų žvaigždžių ląstelių linija Lx-2 ir žmogaus kepenų vėžio ląstelių linija Hepg-2 (visos gautos iš Ketvirtojo karo medicinos universiteto Farmacijos departamento, Kinija) buvo auginamos Dulbecco modifikuotoje erelio terpėje ( DMEM), papildyta 10 procentų galvijų vaisiaus serumo ir 1 procento penicilino (Thermo Fisher Scientific) ir streptomicino (Thermo Fisher Scientific), o po to palaikoma 37 C temperatūroje drėgnoje atmosferoje, kurioje yra 5 procentai CO2 ir 95 procentai oro. Norint įvertinti Oba poveikį Lx-2 ląstelių gyvybingumui, Lx-2 buvo padengta 1 × 10* ląstelių/šulinėlių 96-šulinėlių plokštelėje ir inkubuojama 24 valandas prieš pridėjimą. Obos. Tada Lx-2 buvo apdorotas skirtingomis Oba koncentracijomis (10, 20, 40, 80 ir 160 wM) ir kultivuojamas 24, 48 arba 72 val. Ląstelių gyvybingumas buvo patikrintas CCK8. Oba poveikis Lx-2 aktyvacijai, Lx-2 buvo iš anksto kultivuojamas terpėje be serumo 12 valandų, po to stimuliuojama TGF- (10 ng/mL, 24 val.) ir apdorojama Oba arba PFD. Norint įvertinti Oba poveikį uždegimui, Hepg-2 buvo stimuliuojamas CCl4 (20 nm, 8 h) ir apdorotas 20 μM Oba. Kultūros pabaigoje ląstelės buvo surinktos ir paveiktos Western blot ir realaus laiko qPCR analizė.

4.3. Gyvūnai ir eksperimentinis dizainas

C57 pelių patinai, sveriantys 20± 0,5 g (Ketvirtojo karo medicinos universiteto laboratorinių gyvūnų centras), buvo laikomi tinkamomis sąlygomis – 25 ± 2 laipsnių temperatūra ir 12-h šviesos/tamsos ciklas. nemokama prieiga prie vandens ir maisto. Kiekvienas šio tyrimo eksperimentas buvo atliktas pagal Ketvirtojo karo medicinos universiteto gyvūnų priežiūros komiteto patvirtintus protokolus. C57 pelės buvo atsitiktinai paskirstytos į 6 grupes (n=6 kiekvienoje grupėje) taip: i) netikra kontrolinė grupė, i) modelio grupė, ii) didelė Oba grupė (CCl4 plius 6 mg/kg Oba), io ) vidutinė Oba grupė (CCl4 plius 3 mg/kg Oba), ø) mažo Oba kiekio grupė (CCl4 plius 1,5 mg/kg Oba) ir vi) PFD grupė (CCl4) PFD. Pavyzdinė grupė buvo gydoma CCl4 (30) proc. CCl4/alyvuogių aliejaus, 5 ml/kg intraperitoninės injekcijos) tris kartus per savaitę 6-savaitę, kad sukeltų kepenų fibrozę. Kitos grupės buvo šeriamos skirtingomis Oba arba PFD dozėmis ir vienodais kiekiais CCil4 intraperitonine infekcija. 6-savaitės laikotarpis. C57 buvo sušvirkštas lygus alyvuogių aliejaus, o ne CCl4, naudojant ipas a fiktyvią kontrolę. Kiekvienas šiame straipsnyje aprašytas eksperimentas buvo atliktas pagal Ketvirtojo karo medicinos universiteto gyvūnų komiteto patvirtintus protokolus. Priežiūra.

4.4. Vakarų blotingas

C57 kepenys arba kultivuotos ląstelės buvo homogenizuotos arba lizuotos RIPA buferyje, naudojant audinių sluoksniavimo aparatą arba ląstelių grandymą (Service, KZ-2). Baltymų koncentracija buvo matuojama naudojant BCA Protein Assay Kit. Lizatas buvo centrifuguojamas (4 laipsniai, 12, 000 aps./min., 5 min.), o supernatantas buvo surinktas. Operacijos etapai buvo atlikti taip, kaip buvo pranešta anksčiau [14]. Mėginiai buvo nuskaityti naudojant chemiliuminescencinę vaizdavimo ir analizės sistemą (Beijing Sage Creation Science Co, MiniChemi 610).

4.5. Realaus laiko qPCR analizė

C57 kepenys arba kultivuotos ląstelės buvo homogenizuotos arba lizuojamos Trizol reagentu, naudojant audinių sluoksniavimo aparatą, kad būtų išgauta visa RNR. Visa RNR buvo atvirkštiniu būdu perrašyta į cDNR, naudojant RevertAid pirmosios krypties cDNR sintezės rinkinį. -aktinas buvo naudojamas vidinei nuorodai. RT-qPCR buvo atlikta naudojant 7500 realaus laiko qPCR sistemą (Applied Biosystems) su SYBR Premix Ex Taq reagentais. Naudoti žmogaus genų pradmenys buvo išvardyti 1 lentelėje.

Šis straipsnis ištrauktas iš Molecules 2021, 26, 318. https://doi.org/10.3390/molecules26020318 https://www.mdpi.com/journal/molecules