Per pastaruosius kelis dešimtmečius mokslininkai padarė didelę pažangą gerindami sveikatą ir pailgindami gyvenimo trukmę

Prašau susisiektioscar.xiao@wecistanche.comDaugiau informacijos

ĮVADAS

Lęšio epitelio ląstelės (LEC) sudaro vienasluoksnį ląstelių sluoksnį, dengiantį priekinę lęšio kapsulę ir tęsiasi iki pusiaujo lęšio lanko [1, 2]. Normali LEC konstrukcija ir funkcija yra būtinos norint palaikyti viso lęšio skaidrumą ir metabolinę homeostazę [3]. Vis daugiau įrodymų rodo, kad LEC senėjimas gali sukelti lęšio baltymų, įskaitant fermentus ir kristalinus, modifikaciją, denatūravimą ir agregaciją, o tai galiausiai lemia lęšio drumstimą ar net kataraktą [3-5]. Su amžiumi susijusi katarakta (ARC) išlieka pagrindine regėjimo sutrikimų ir aklumo priežastimi, o tai labai paveikia vyresnio amžiaus žmonių gyvenimo kokybę [6]. Šiuo metu nėra veiksmingų ARC progresavimo prevencijos strategijų. Todėl būtina sukurti farmakologinę intervenciją, kuri galėtų pagerinti lęšiuko skaidrumą ir atitolinti ARC progresavimą.

Per pastaruosius kelis dešimtmečius mokslininkai padarė didelę pažangą gerindami sveikatą ir pailgindami gyvenimo trukmę, taikydami keletą genetinių, dietinių ir farmakologinių intervencijų [7]. Metforminas (MET) yra vienas iš plačiai ištirtų senėjimą stabdančių medžiagų. Esminiai tyrimai rodo, kad MET gali palengvinti senėjimą ir pratęsti sveiką gyvenimo trukmę įvairiose gyvūnų modelių sistemose. MET gali ne tik pailginti Caenorhabditis elegans gyvenimo trukmę, bet ir pagerinti jo sveikatą bei gyvybingumą [8]. MET gali sumažinti su amžiumi ir oksidaciniu stresu susijusį DNR pažeidimo kaupimąsi Drosophila vidurinės žarnos kamieninėse ląstelėse, kad pailgėtų jų gyvenimo trukmė [9]. Ankstesni tyrimai taip pat rodo, kad lėtinis mažų dozių MET vartojimas pagerina pelių sveikatą ir gyvenimo trukmę [10]. Be to, nauji įrodymai rodo, kad cukriniu diabetu sergantys pacientai, gydomi MET, išgyvena, net lyginant su diabetu nesergančiais kontroliniais pacientais [11].

Norėdami sužinoti daugiau, spustelėkite čia

Be MET gyvenimo trukmę skatinančio aktyvumo įvairiuose modelio organizmuose, MET yra nukreiptas į kelis ląstelių signalų perdavimo būdus, kad pagerintų su amžiumi susijusias ligas. Įrodyta, kad MET moduliuoja autofagiją daugiausia aktyvindamas adenozino monofosfato (AMP) aktyvuotą baltymų kinazę (AMPK) ir užkerta kelią neurodegeneracijai bei neurouždegimui, kad vaidintų neuroprotekcinį vaidmenį sergant Parkinsono liga [12]. Panašiai MET pagerina su amžiumi susijusius pokyčius kepenų sinusoidinėje endotelio ląstelėje per AMPK ir endotelio azoto oksido kelius [13].cistanche dosage redditBe to, lėtinis AMPK aktyvinimas MET užkerta kelią kardiomiopatijai, padidindamas diabetu sergančių OVE26 pelių autofagiją [14]. Be to, MET palengvina su amžiumi susijusį širdies ir kraujagyslių sistemos pablogėjimą, nes sustiprina autofagiją ir riboja kalorijas [15]. Be to, gydymas MET gali slopinti su amžiumi susijusią aterosklerozę ApoE-7-pelėms ir triušiams, kurią sukelia riebi dieta, žymiai užkertant kelią aterosklerozinių apnašų kalcifikacijai, sumažinant didelio jautrumo C reaktyviojo baltymo kiekį ir slopinant branduolinio faktoriaus kappa B(NF-kB) kelias kraujagyslėse [16-18].

Remiantis šiais stebėjimais, šiame tyrime buvo bandoma ištirti, ar MET gali atitolinti ARC senėjimą ir pagrindinį molekulinį mechanizmą. Mūsų išvados yra tokios: (i) lėtinis gydymas mažomis dozėmis MET atitolino natūraliai senų pelių LEC senėjimą, taip slopindamas lęšio neskaidrumą; (i) AMPK kelias buvo inaktyvuotas, o senstančiose LEC buvo sutrikęs autofaginis srautas; (i) ) lėtinis gydymas mažomis dozėmis MET atitolino LEC senėjimą natūraliai senoms pelėms, aktyvuodamas AMPK kelią ir sustiprindamas autofagiją. Mūsų išvados patvirtina numanomą senėjimą stabdantį MET vaidmenį ir pateikia pakankamai įrodymų, kad MET gali būti galimas ARC gydymo būdas.

REZULTATAI

LEC senėjimas buvo susijęs su ARC natūraliai senoms pelėms

Buvo išsamiai ištirti keli galimi ARC mechanizmai, įskaitant senėjimo poveikį.cistanche ekstrakto privalumai,Tačiau ryšys tarp LEC senėjimo ir ARC in vivo lieka neaiškus. Iškėlėme hipotezę, kad LEC senėjimas gali sukelti ARC in vivo . Todėl mes sukūrėme ARC pelės modelį. Mūsų rezultatai atskleidė, kad natūraliai senų pelių (vyresnių pelių) lęšiuko skaidrumas buvo žymiai mažesnis, palyginti su kontroline grupe (jaunos pelės) (1a pav.). Kaip parodyta 1b pav., kataraktos dažnis natūralaus amžiaus grupėje buvo 95,23 proc. H&E dažymo tyrimas parodė, kad kontrolinės grupės LEC buvo apvalios formos ir išdėstyti reguliariai, o normalių LEC tankis buvo palyginti didelis, o natūraliai senų pelių LEC buvo plokščios formos ir išsidėstę netolygiai, o jų tankis. senstantys LEC buvo žymiai sumažėję (1c pav.). Be to, SA- -Gal dažymas parodė, kad senstančių LEC santykis buvo padidėjęs natūraliai senoms pelėms (1d pav.). Be to, išanalizavome su senėjimu susijusių žymenų baltymų ekspresiją naudodami IHC dažymą ir Western blot analizę. IHC dažymas atskleidė, kad p21 ir p53 ekspresija padidėjo natūraliai senų pelių LEC, palyginti su jaunomis pelėmis (1e, f pav.). Be to, mes taip pat nustatėme, kad p21 ir p53 baltymų ekspresija buvo didesnė natūraliai senų pelių lęšių kapsulėse nei jaunų pelių lęšių kapsulėse (1g pav.). Šie rezultatai rodo, kad natūraliai senų pelių LEC senėjimas buvo susijęs su ARC.

Cistanche gali kovoti su senėjimu

Lėtinis mažų dozių MET vartojimas pagerino lęšiuko skaidrumą ir sumažino LEC senėjimą Prieš išbandydami metformino poveikį ARC, nustatėme, ar lėtinis mažų dozių MET vartojimas yra saugus pelėms. Po 10 mėnesių gydymo MET 28 pelės (18 natūralaus amžiaus grupėje ir 10 MET grupėje) mirė dėl natūralių priežasčių. Mes nustatėme, kad gyvos pelės abiejose grupėse buvo sveikos, o abiejų grupių kūno svoris ir organų svoris nebuvo reikšmingi (1 lentelė). Todėl šie rezultatai parodė, kad tyrime naudota metformino dozė buvo saugi gyvūnams ir gali būti naudojama tolesniems eksperimentams.

Vėliau buvo skiriamas lėtinis mažos dozės MET, siekiant įvertinti, ar MET gali slopinti lęšio neskaidrumą ir palengvinti su amžiumi susijusį LEC senėjimą natūraliai senoms pelėms. Kaip ir tikėtasi, MET grupės lęšio skaidrumas labai pagerėjo, lyginant su lęšio skaidrumu natūralaus amžiaus grupėje (2a pav.). Be to, morfologiniai stebėjimai patvirtino, kad MET grupės lęšyje sumažėjo neskaidrumas. Kataraktos dažnis natūralaus amžiaus grupėje buvo 95,23 proc., o MET grupėje – 1900 proc. (2b pav.). H&E dažymo tyrimas parodė, kad LEC tankis MET grupėje buvo žymiai didesnis. nei natūraliai senų pelių (2c pav.). Be to, MET grupės LEC buvo gana apvalios formos, palyginti su natūraliai senų žmonių grupe (2c pav.). SA- -Gal dažymas parodė, kad senstančių LEC santykis reikšmingai sumažėjo MET grupėje, palyginti su natūraliai senų žmonių grupe (2d pav.). IHC analizė atskleidė, kad p21 ir p53 ekspresija MET grupės LEC sumažėjo labiau nei natūraliai senų žmonių (2e, f pav.). Panašiai Western blot analizė atskleidė, kad p21 ir p53 baltymų ekspresija buvo labai sumažinta MET grupės lęšių kapsulėse, palyginti su natūraliai senų žmonių grupe (2g pav.). Šie rezultatai parodė, kad lėtinis mažų dozių MET vartojimas gali pagerinti lęšio skaidrumą ir palengvinti LEC senėjimą.

Lėtinis mažų dozių MET vartojimas sumažino natūraliai senų pelių LEC senėjimą dėl AMPK aktyvinimo. Didžiulis duomenų kiekis patvirtina išvadą, kad AMPK aktyvavimo pakanka pailginti modelio organizmų gyvenimo trukmę ir padidinti jo, kaip ilgaamžiškumo tikslo, patrauklumą [19, 20]. . Atsižvelgdami į šią teoriją, įvertinome AMPK kelio raišką pelių LEC. Santykinis FAS mRNR lygis buvo sumažintas natūraliai senų žmonių grupėje ir padidėjo MET grupėje (3a pav.). Kaip parodyta 3b, c pav., fosforilinto AMKa (Thr172) ir fosforilinto ACC (Ser79) ekspresija buvo sumažinta natūraliai senų pelių LEC, palyginti su jaunų pelių. Tačiau fosforilinto AMKa (Thr172) ir fosforilinto ACC (Ser79) ekspresija buvo didesnė MET grupės LEC, palyginti su natūraliai senstančia grupe. Be to, Western blot analizė atskleidė, kad fosforilinto AMKa (Thr172) ir fosforilinto ACC (Ser79) baltymų ekspresija buvo žymiai sumažinta natūraliai senų žmonių lęšių kapsulėse, o fosforilinto AMKa (Thr172) ir ACC (fosforilinto) baltymų ekspresijos lygis. Ser79) buvo padidėjęs MET grupės lęšių kapsulėse (3d pav.). Šie duomenys atskleidė, kad AMPK kelias buvo inaktyvuotas natūraliai senų pelių LEC. Be to, lėtinis mažų dozių MET vartojimas sumažino LEC senėjimą natūraliai senoms pelėms aktyvinant AMPK.

Lėtinis mažų dozių MET vartojimas atkūrė autofaginį srautą, kad sumažintų LEC senėjimą natūraliai senoms pelėms Ankstesni tyrimai parodė, kad autofagija gali atlikti svarbų vaidmenį kovojant su neigiamu senėjimo poveikiu [21, 22]. Norėdami toliau analizuoti molekulinius ir ląstelinius lęšio pokyčius po gydymo MET, nustatėme LC3 ir p62 ekspresiją, nes jie yra plačiai pripažįstami kaip autofagijos lygio biomarkeriai. Kaip parodyta 4a pav., santykinis p62 mRNR ekspresijos lygis buvo žymiai padidintas natūraliai senų žmonių grupėje, palyginti su kontroline grupe; tačiau santykinis p62 mRNR ekspresijos lygis MET grupėje buvo žymiai sumažintas, palyginti su natūraliai senų žmonių grupe.cistanche ČingischanasBe to, IHC dažymas atskleidė, kad su mikrotubuliais susijusio baltymo 1 lengvosios grandinės 3 (LC3-II/l) ir p62 kiekis padidėjo natūraliai senų pelių LEC. Be to, mūsų rezultatai parodė, kad LC3-II/l ir p62 lygiai buvo labai sumažėję MET grupės LEC (4b, c pav.). LC3-ll ir p62 baltymų kiekis buvo žymiai padidėjęs natūralaus amžiaus grupės lęšių kapsulėse (4d pav.). Apskritai, mes spėliojome, kad natūraliai senų pelių LEC buvo sutrikęs autofaginis srautas ir jį galima atkurti lėtiniu mažų dozių MET skyrimu, siekiant palengvinti natūraliai senų pelių LEC senėjimą.

DISKUSIJA

Negydoma katarakta yra pagrindinė aklumo priežastis visame pasaulyje, kuriai būdingas kristalinio lęšiuko neskaidrumas [23]. Epidemiologiniai tyrimai parodė, kad amžius yra dominuojantis kataraktos, žinomos kaip ARC, rizikos veiksnys, o vienintelis gydymas yra chirurginis pašalinimas [24]. Ankstesni tyrimai parodė, kad LEC senėjimas yra pagrindinė ARC priežastis [25]. Iki šiol nebuvo veiksmingų terapinių agentų, kurie slopintų lęšio drumstumą ir susilpnintų LEC senėjimą be nepageidaujamo šalutinio poveikio. Šio tyrimo tikslas buvo įvertinti LEC senėjimo molekulinį biologinį pagrindą ir normalių LEC apsaugos nuo senėjimo mechanizmą. Mūsų rezultatai atskleidė, kad AMPK inaktyvacija ir autofagijos sutrikimas buvo susiję su LEC ir ARC senėjimu. Be to, mes nustatėme, kad MET gali apsaugoti LEC nuo senėjimo ir slopinti objektyvo drumstumą aktyvuodamas AMPK ir sustiprindamas autofagiją.

Senėjimas yra pagrindinis biologinis procesas, kurį lydi bendras audinių funkcijos sumažėjimas. Ilgėjant gyvenimo trukmei, su amžiumi susiję sutrikimai, tokie kaip ARC, tampa rimta sveikata

klausimais [26]. Buvo pranešta, kad LEC senėjimas yra susijęs su ARC atsiradimu ir vystymusi [5]. Mūsų rezultatai atskleidė, kad natūraliai senų pelių LEC buvo plokščios formos ir išsidėstę netolygiai, o LEC tankis labai sumažėjo (1c, d pav.). Be to, su senėjimu susijusių genų (p21 ir p53) ekspresija buvo padidinta natūraliai senų pelių LEC (1e, f, g pav.). Mūsų rezultatai reiškė, kad LEC senėjimas buvo susijęs su ARC atsiradimu ir vystymusi. Todėl norint pagrįsti naujas gydymo strategijas, gali prireikti tikslaus supratimo apie molekulinius mechanizmus, kuriais grindžiamas LEC senėjimas.

MET yra plačiausiai pasaulyje skiriamas geriamieji hipoglikeminiai vaistai nuo 2 tipo cukrinio diabeto. Nauji įrodymai rodo, kad MET turi teigiamą poveikį sveikatai, o ne tik su glikemijos pagerėjimu [27]. Patvirtinta, kad MET mechanizmai yra svarbūs nukreipiant pagrindinius biologinio senėjimo kelius, tokius kaip AMPK aktyvinimas, autofagijos stiprinimas, uždegimo slopinimas ir antioksidacinis poveikis [28]. Žmonėms MET klinikinėje praktikoje naudojamas daugiau nei 60 metų; jis pasižymi aukštu saugumo profiliu ir yra unikalioje padėtyje, kad galėtų įsikišti į keletą svarbių takų, atsakingų už senėjimą ir su amžiumi susijusias ligas. Tačiau niekada nebuvo pranešta apie MET poveikį ARC ir šio poveikio reguliavimo mechanizmą. Todėl mūsų tyrime lėtinis mažų dozių MET skyrimas natūraliai senoms pelėms pagerino lęšio skaidrumą (2a pav.) ir sumažino LEC senėjimą in vivo (2 pav.).

Plačiai pripažįstama, kad MET suaktyvina AMPK kelią, kuris yra galimas MET mechanizmas, turintis anti-senėjimo poveikį [29]. AMPK, ląstelių energijos jutiklis, vaidina lemiamą vaidmenį reguliuojant ląstelių energijos balansą [30]. Keletas tyrimų parodė, kad AMPK yra kelių kelių ir procesų, susiejančių energetiką su ilgaamžiškumu, integratorius ir tarpininkas. Savo tyrime nustatėme, kad AMPK inaktyvacija buvo senstančių LEC ypatybė natūraliai senoms pelėms (3 pav.). Vėliau buvo įrodyta, kad MET stimuliuoja AMPK kelią, kad būtų išvengta LEC senėjimo (3 pav.). Kaip nustatytas AMPK aktyvatorius, MET vaidmuo senėjimo prevencijoje paprastai priskiriamas jo poveikiui moduliuoti pasroviui skirtus signalizacijos kelius, tokius kaip autofagijos atkūrimas, Sirt1 ir Foxo1 aktyvinimas ir mTOR slopinimas [31, 32]. Mūsų tyrimas pateikė naują įrodymų liniją, pabrėžiančią AMPK funkcijos, suaktyvintos MET, svarbą užkertant kelią ARC atsiradimui.

Kaip minėta aukščiau, AMPK bendrauja su daugybe būdų ir baltymų, kad padarytų senėjimą stabdantį poveikį, įskaitant autofagijos padidėjimą. Autofagija, atsirandanti kaip pagrindinis ilgaamžiškumo užtikrinimo procesas, sulaukė didelio susidomėjimo kaip galimas su amžiumi susijusių ligų gydymo tikslas. Autofagija yra skystas, daugiapakopis sudėtingas biologinis procesas. Visas autofagijos procesas vadinamas autofaginiu srautu, kuris plačiai naudojamas autofagijos lygiui atspindėti. Kaip autofagijos indikatorius, LC3-Il yra glaudžiai prijungtas prie autofagosominės membranos, kurią skaido lizosomų fermentai.cistanche gyvenimo pratęsimasPanašiai p62, autofagijai būdingas substratas, paprastai suskaidomas autofagolizosomoje, o jo ekspresija netiesiogiai atspindi autofagijos lygį. Šiame tyrime mūsų išvados reiškė, kad senstančiose LEC autofagijos lygis aiškiai sumažėjo (4 pav.), o MET pakeitė su amžiumi susijusį autofagijos sutrikimą (4 pav.). Senėjimą stabdantis MET molekulinis mechanizmas priskiriamas pagrindinei AMPK funkcijai ląstelėse, nes jis paprastai sustiprina autofagiją aktyvindamas AMPK [33]. Be to, įrodyta, kad MET tiesiogiai padidina autofagiją, taip prisidedant prie senėjimo prevencijos [34]. Tačiau norint išsiaiškinti pagrindinius mechanizmus, reikia išsamesnių tyrimų, įrodančių, kad MET padidina autofagiją per nepriklausomą arba priklausomą AMPK kelią.

Buvo įrodyta, kad ARC paplitimas nebuvo susijęs su lytimi Azijos kilmės populiacijose [35, 36]. Todėl mes nemanėme, kad seksas yra veiksnys, galintis turėti įtakos ARC. Mūsų tyrimas turėtų būti aiškinamas atsižvelgiant į pirmiau minėtus apribojimus.

IŠVADA

Apibendrinant, mes įrodėme, kad AMPK kelio inaktyvavimas ir su amžiumi susijęs autofagijos sutrikimas gali prisidėti prie LEC senėjimo ir ARC atsiradimo. Be to, mūsų eksperimentų duomenys atskleidė, kad MET veiksmingai atitolino LEC senėjimą ir ARC susidarymą aktyvindamas AMPK kelią ir padidindamas autofagiją. Mūsų išvados yra pagrindinė tolesnio molekulinių mechanizmų, naudingų MET vaidmeniui ARC senėjimo proceso metu, tyrimo kryptis ir bus informatyvūs intensyvesniems tyrimams, susijusiems su naujų ARC atsiradimo ir vystymosi strategijų kūrimu.

MEDŽIAGOS IR METODAI Reagentai

MET buvo nupirktas iš Bristol-Myers Squibb Company (Kinija). Antikūnai prieš p21 (ab188224), p53 (ab131442), fosforilintą AMKa (p-AMPK) (Thr172) (ab133448), AMPKa1 (ab32047), -2actin (ab32047), -2. SQSTM1/p62 (3340-1) buvo gauti iš Abcam (MA, JAV). Antikūnai prieš LC3 (12741) ir fosfoacetil-CoA karboksilazę (p-ACC) (Ser79) (3661) buvo įsigyti iš Cell Signaling Technology ( MA, JAV).

Gyvūnai ir gydymas

3 ir 8 mėnesių amžiaus C57BL6J pelių patinai buvo įsigyti iš Beijing Vital River Laboratory Animal Technology Co. Ltd. (Pekinas, Kinija). Pelės buvo laikomos kontroliuojamose temperatūros (temperatūra, 20-25 laipsnis ir santykinė drėgmė, 55 ± 15 proc.) sąlygomis su 12 valandų šviesos / tamsos ciklu, laisva prieiga prie maisto ir vandens. Visas procedūras ir protokolus, atliekamus su gyvūnais, patvirtino Harbino medicinos universiteto etikos komitetas.

Pelės buvo suskirstytos į šias tris grupes: (i) kontrolinė grupė, kurioje jaunos pelės (3 mėnesių amžiaus, kūno svoris =29.72±1,66 g, n =40) gavo standartinį išgrynintą pelių racioną ir vandenį. ad libitum; Kai pelėms buvo 10 mėn., 120 pelių atsitiktinai buvo suskirstytos į dvi grupes: natūralaus amžiaus grupę ir MET grupę. (i) natūralaus amžiaus grupė (vyresnės pelės, 20 mėnesių, kūno svoris =32.98±1,93 g, n=60) gavo standartinę išgrynintą pelių dietą ir vandenį ad libitum; (ii) MET grupė ( 20 mėnesių amžiaus, kūno svoris =31.21±2,81 g,n=60) buvo palaikomas standartine išgryninta pelių dieta ir vandeniu, kol pelėms sukaks 10 mėnesių; po to buvo pradėtas gydymas. MET grupės pelės 10 mėnesių buvo šeriamos maistu, papildytu 0,1 procento MET (Bristol Myers Squibb, Kinija) ir vandeniu.

lęšių ir lęšių kapsulių izoliavimas

Pelės buvo eutanazuotos per gimdos kaklelio išnirimą. Iš visų eksperimentinių gyvūnų iš karto buvo išpjauta visa akis ir patalpinta į sterilų fiziologinį tirpalą. Regos nervas buvo uždėtas aukštyn ir fiksuojamas pincetu. Tada į akį patenkančiame regos nerve buvo padarytas pjūvis, o sklera atitraukta atgal, kad būtų atskleistas lęšiukas.cistanche nzVėliau pincetu švelniai pašalinome ciliarinius kūno fragmentus, pritvirtintus prie lęšio pusiaujo plokštumos. Nedelsiant buvo padarytos šviežio lęšio nuotraukos, o objektyvas greitai pritvirtintas 4 procentų paraformaldehidu kambario temperatūroje. Visos lęšio kapsulės buvo greitai nuplėštos nuo likusio lęšio, greitai užšaldytos skystame azote ir laikomos 80 ° C temperatūroje tolesniems eksperimentams.

Hematoksilinas ir eozinas (H&E)

Šviežias lęšis buvo nedelsiant pritvirtintas 4 procentų paraformaldehidu kambario temperatūroje ir įterptas į parafiną. Histologiniam tyrimui audiniai buvo supjaustyti 4- μm griežinėliais. Po deparafinavimo ir rehidratacijos paruoštos parafino sekcijos buvo dažytos hematoksilino (H) tirpalu 8 minutes, po to 5 panardinimai į 1 procento rūgštinį etanolį (1 procentas HCl 70 procentų etanolyje).

ir nuplauti distiliuotu vandeniu. Vėliau sekcijos buvo nudažytos eozino (E) tirpalu 3 minutes, po to dehidratuojamos rūšiuotu alkoholiu ir nuvalomos ksilenu. Morfologiniai pokyčiai buvo stebimi mikroskopu (Nikon, Eclipse, Japonija).

Su senėjimu susijusios -galaktozidazės (SA- -Gal) tyrimas Su senėjimu susietas -galaktozidazės (SA- -Gal) aktyvumas buvo matuojamas naudojant SA- -Gal dažymo rinkinį (Sigma, CS{). {12}}030). Remiantis gamintojo instrukcijomis, audinių sekcijos po kelių procedūrų buvo plaunamos fosfatiniu buferiniu tirpalu (PBS) 5 minutes (tris kartus) ir inkubuojamos SA- -gal dažymo tirpale (pH 6,0). 37 laipsniai be CO2 24 val. Vaizdai buvo užfiksuoti šviesos mikroskopu („Nikon“, „Eclipse“, Japonija). SA- -gal-teigiamų ląstelių procentas buvo įvertintas kaip vidutinis teigiamų ląstelių skaičius / vidutinis visų ląstelių skaičius.

Kiekybinė realaus laiko polimerazės grandininė reakcija (gRT-PCR) Visa RNR iš pelių lęšio kapsulių buvo ekstrahuota naudojant TRlzol reagentą. Atvirkštinė transkripcija buvo atlikta naudojant „ExScript RT Reagent Kit“ („Invitrogen“). Kiekybinė atvirkštinės transkripcijos polimerazės grandininės reakcijos (qRT-PCR) analizė buvo atlikta naudojant SYBR Green Supermix.

rinkinys (Takara, Tokijas, Japonija), su -aktinu kaip endogenine kontrole. Buvo tiriamos kelių tikslinių genų transkripcijos, įskaitant FAS (pirmyn, 5'-TTGCTGGCACTACAGAATGC-3' ir atvirkštinė, 5'-AACAGCC TCAGAGCGACAAT-3'), p62 (pirmyn,5'-GGCGCACTACCGCGATGAGGA-3' 10}} ir atvirkštinis,5'-TGTTCCCGCCGGCACTCCTT-3') ir -aktinas (pirmyn, 5'-TCGTGGGCCGCCCTAGGCAC-3'ir atgal,5'-TGGCCTTAGGGTTC AGGGGGG-3' santykinis). buvo kiekvieno geno ekspresijos lygiai

metodas. normalizuotas į -aktiną ir apskaičiuotas naudojant 2-△△ct r imunohistocheminį (IHC) dažymą. Imunohistocheminei (IHC) analizei buvo panaudotos 5 reprezentatyvios kiekvienos iš 10 lęšių vienoje grupėje. įvertinti p21, p53, p-AMPK, p-ACC, LC3 ir p62 ekspresiją. Po to, kai paruošti mėginiai buvo inkubuojami 60 laipsnių temperatūroje 2 valandas, jie buvo praleidžiami per ksileną ir rūšiuojamą alkoholį, kad būtų pašalintas parafinas. Vėliau mėginiai 30 min virinami 0,1 M citrinų rūgštyje (pH 6,1) ir atšaldomi iki kambario temperatūros. Tris kartus nuplovus PBS, mėginiai buvo mirkomi 0, 3 procento H O, kad būtų slopinamas endogeninis peroksidazės aktyvumas. Vėliau buvo pridėti pirminiai antikūnai ir per naktį atšaldomi 4 °C temperatūroje. Atitinkami antriniai antikūnai buvo inkubuojami 1 valandą 37 °C temperatūroje. Po plovimo PBS mėginiai buvo inkubuojami diaminobenzidine (DAB), kol atsirado norimas dėmės intensyvumas. Imunitetų ląstelių vaizdai buvo užfiksuoti naudojant Nikon Eclipse mikroskopą (Nikon, Eclipse, Japonija).

Western blot analizė

Bendras baltymų kiekis iš pelių lęšio kapsulių buvo ekstrahuotas naudojant radioimunoprecipitacijos tyrimo (RIPA) buferį su proteazės inhibitorių kokteiliu (Pierce, JAV), o baltymų koncentracijai nustatyti buvo naudojamas bicinchonino rūgšties (BCA) rinkinys (Thermo Fisher Scientific, JAV). . Bendras baltymas (40 µg) buvo ištirtas naudojant natrio dodecilsulfato-poliakrilamido gelio elektroforezę (SDS-PAGE) ir elektroforetiškai perkeltas ant polivinilideno difluorido filtro (PVDF) membranų (Millipore, Vokietija). Membranos buvo inkubuojamos per naktį su pirminiu antikūnu 4 °C temperatūroje. Kitą dieną membranos buvo inkubuojamos su atitinkamais antriniais antikūnais 1 valandą 37 °C temperatūroje. Imunoreaktyvios juostos buvo vizualizuotos naudojant chemiliuminescencinio substrato metodą su Super Signal West Pico. rinkinys (Pierce Biotechnology, JAV). Buvo atlikti trys nepriklausomi eksperimentai.

Statistinė analizė

Duomenys buvo išreikšti kaip vidurkis±standartinis nuokrypis (SD). Statistinė analizė buvo atlikta naudojant GraphPad Prism 7.{1}} programinę įrangą ir Microsoft Excel. Baltymai buvo kiekybiškai įvertinti naudojant Image J programinę įrangą. Eksperimentinių duomenų statistiniam reikšmingumui apskaičiuoti buvo naudojamas Stjudento t testas ir dispersijos analizė (ANOVA). Skirtumai su P reikšme<0.05 were="" considered="" statistically="" significant.="" all="" experiments="" were="" repeated="" independently="" at="" least="" three="">

DUOMENŲ PRIEINAMUMAS

Šiame paskelbtame straipsnyje pateikiami duomenų rinkiniai, naudojami ir analizuoti šio tyrimo metu.

Šis straipsnis ištrauktas iš www.nature.com/cddiscovery