1 dalis Cistanches Herba cheminė ir genetinė diskriminacija, pagrįsta UPLC-QTOF/MS ir DNR brūkšniniu kodavimu
Mar 03, 2022
Kontaktai: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 El. paštas:audrey.hu@wecistanche.com
Abstraktus
Cistanches Herba(Rou Cong Rong), žinomas kaip "Dykumos ženšenis", turi nuostabų gydomąjį poveikį stiprumui ir maitinimui, ypač stiprinant inkstus, kad sustiprintų yang. Tačiau dvi augalinės kilmės Cistanches Herba, Cistanche deserticola ir Cistanche tubulosa skiriasi savo farmakologiniu poveikiu ir cheminiais komponentais. Siekiant atskirti Cistanches Herba augalinę kilmę, šiame tyrime pirmiausia buvo panaudota kombinuota cheminių ir genetinių metodų sistema – UPLC-QTOF/MS technologija ir DNR brūkšninis kodavimas. Rezultatai parodė, kad buvo gauti trys galimi žymenų junginiai (kampneozido II, cistanozido C ir cistanozido A izomeras), kad būtų galima atskirti dvi kilmes PCA ir OPLS-DA analizėmis. DNR brūkšninis kodavimas leido tiksliai atskirti dvi kilmes. NJ medis parodė, kad dvi kilmės susibūrė į du kladus. Mūsų išvados rodo, kad dvi Cistanches Herba kilmės medžiagos turi skirtingą cheminę sudėtį ir genetinius variantus. Tai pirmasis dviejų Cistanches Herba kilmės įvertinimas, o radinys palengvins kokybės kontrolę ir klinikinį pritaikymą.
Įvadas
Cistanches Herba(Rou Cong Rong), žinomas kaip „dykumos ženšenis“, kilęs iš džiovintų sultingų stiebų.Cistanche deserticolaYC Ma irCistanche tubulosa(Schrenk) Perukas pagal Kinijos farmakopėją (2010 m. leidimas) ir yra populiarus dėl to, kad tonizuoja inkstus-yin, suteikia gyvybingumo ir atpalaiduoja žarnyną. Šiuo metu,Cistanches Herbadaugiausia paplitęs sausringose ir šiltose dykumose šiaurės vakarų Kinijoje, ypač Sindziango ir Vidinės Mongolijos provincijose. Tačiau dvi ištakosCistanches Herbaskiriasi savo farmakologiniu aktyvumu ir cheminiais komponentais. Tu ir kt. ištyrė trijų Cistanche rūšių nuovirą (C. deserticola, C. tubulosa, Cistanche salsa) ir tai nustatėC. tubulosaparodė mažiausią poveikį Yang trūkumo pelės modelyje [1]. Zhang ir kt. palygino farmakologinį aktyvumą tarpC. deserticola, C. tubulosa,irC. salsa,ir nustatė, kad šios rūšys turėjo medicininių funkcijų, tokių kaip nuovargio ir hipoksijos tolerancija, bet ne tokiu pačiu mastu [2]. Ankstesni tyrimai pranešė apie cheminį komponentą ir nurodė cheminio komponento ir sudėties skirtumus pagal augalinę kilmęCistanches Herba[3]. Kalbant apie klinikinį pritaikymą ir apyvartą rinkoje, kaip toniką,C. tubulosaJaponijoje tradiciškai buvo naudojamas kaip kraujotaką skatinanti priemonė ir gydant impotenciją, nevaisingumą, lumbago, kūno silpnumą [4–8]. Todėl labai svarbu atskirti dvi kilmesCistanches Herbakokybės kontrolei ir klinikiniam pritaikymui. Tačiau nėra mokslinių tyrimų, skirtų diskriminacijai dėl dviejų priežasčiųCistanches Herba. Daugelis ištirtų metodų, įskaitant mikroskopiją, ultravioletinių ir infraraudonųjų spindulių aptikimą, paprastų sekų kartojimo metodą, buvo naudojami genčiai nustatyti.Cistanches, bet ne tik dėl dviejų kilmės ypač [9–20]. Čia mes kartu panaudojome cheminius ir molekulinius metodus, kad atskirtume dvi Cistanches Herba kilmes, UPLC QTOF/MS (itin efektyvią skysčių chromatografiją kartu su kvadrupolio skrydžio laiko masės spektrometrija) ir DNR brūkšninį kodavimą. UPLC-QTOF/MS suteikia informaciją greičiau ir efektyviau, palyginti su kitais būdais. Dėl didelio UPLC-QTOF/MS selektyvumo ir jautrumo jis buvo pritaikytas tiek kiekybinei, tiek kokybinei analizei, taip pat metabolitų analizei ir sudėtingų junginių identifikavimui tradicinėje kinų medicinoje [21–22]. Pagrindinių komponentų analizė (PCA) ir ortogonalioji projekcija į latentinę struktūrą diskriminacinė analizė (OPLSDA) taip pat yra sukurta siekiant nustatyti galimus žymenų junginius. DNR brūkšninis kodavimas, paprastesnė ir universalesnė molekulinių žymenų technologija, naudoja DNR fragmentą rūšims ar gentims nustatyti. Tai objektyvu, tikslesnė ir lengviau atliekama nei tradiciniai identifikavimo metodai ir kitos molekulinių žymenų technologijos. Be to, DNR brūkšninis kodavimas buvo sėkmingai pritaikytas identifikuoti gyvūnus ir augalus, įskaitant vaistinius augalus [23–26]. Šio tyrimo tikslas – sukurti mokslinių metodų sistemą, kombinuotą UPLC-QTOF/MS ir DNR brūkšninį kodavimą, skirtą dviejų augalų kilmės diskriminacijai.Cistanches Herba.
Cistanuoja visas šaknis
Medžiagos ir metodai
Etikos pareiškimas Patvirtiname, kad lauko tyrimai neapėmė nykstančių ar saugomų rūšių. GPS koordinatės buvo įtrauktos į pavyzdinę informaciją, žr. 1 lentelę.
Augalinės medžiagos ir reagentai
Sultingi Cistanches Herba stiebai buvo paimti iš laukinių dykumų regionų Vidinėje Mongolijoje, Činghajaus provincijose, Sindziango Uigūro autonominiame regione, Kinijos Liaudies Respublikoje (1 lentelė) 2012 m. gegužės mėn. Visi tyrimo mėginiai buvo paimti laukinių dykumų regionuose, o ne privačioje žemėje, kur nereikėjo jokių specialių leidimų. Botanines stiebų tapatybes patvirtino daktaras Linfangas Huangas. Vaučerių pavyzdžiai buvo deponuoti Vaistinių augalų plėtros institute. UPLC analizei buvo naudojamas didelio efektyvumo skysčių chromatografijos (HPLC) acetonitrilas (Merck KGaA, Darmštatas, Vokietija) ir skruzdžių rūgštis (Tedia, JAV). Dejonizuotas vanduo buvo išgrynintas naudojant Milli-Q sistemą (Millipore, Bedford, MA, JAV). Visos kitos cheminės medžiagos buvo analitinės kokybės.
Mėginio paruošimas
Cistanches Herba mėginiai (1.{1}} g, 65-tinklelis) buvo perkelti į 50- ml kūginę kolbą ir įpilta 50 ml 70 procentų metanolio. Po 30 minučių mirkymo ultragarsu (35 kHz) buvo atlikta 30 minučių kambario temperatūroje. Po centrifugavimo 10, 000 aps./min. greičiu 10 min., supernatantas buvo laikomas 4 uC temperatūroje ir filtruojamas per 022- mm membraną prieš įpurškiant į UPLC-QTOF/MS sistemą analizei.
UPLC-QTOF/MS
UPLC analizei buvo naudojamos šios sistemos/parametrai: Waters Acquity sistema (Waters) su dvejetainiu tirpiklio tiekimo siurbliu, automatiniu mėginių ėmikliu ir PDA detektoriumi, prijungtu prie Waters Empower 2 duomenų stoties; ultragarsu (250 W, 50 kHz, Kunshan Ultrasonic Instrument Co., Džedziangas, Kinija); ir elektroninio analitinio balanso modelis AB135-2 (Mettler Toledo., Greifensee, Ciurichas, Šveicarija). Naudota „Waters Acquity UPLC BEH C18“ kolonėlė (1,7 mm, 2,16100 mm, „Waters“) ir „Waters C18“ apsauginė kolonėlė (ta pati medžiaga, vandenys), palaikoma 30 °C temperatūroje. Judanti fazė buvo 0,1 procento skruzdžių rūgšties vandeninis tirpalas (A) ir acetonitrilas (B) su gradiento programa tokia: 0–3 min., 10–22 procentai B; 3–4 min., 22–23 procentai B; 4–6 min., 23–35 proc. B; 6–8 min., 35–37 proc. B; 8–11 min., 37–42 proc. B; 11–12 min., 42–48 procentai B; 12–15 min., 48–50 procentų B, kai srautas yra 0,3 ml/min. Injekcijos tūris buvo 5 ml.
UPLC / MS analizė buvo atlikta naudojant QTOF Synapt G2 HDMS sistemą (Waters, Mančesteris, JK), turinčią elektropurškimo jonizacijos (ESI) šaltinį, veikiantį neigiamų jonų režimu. N2 buvo naudojamas kaip desolvatavimo dujos. Desolvatacijos temperatūra buvo nustatyta 45{{10}}uC esant 800 l/h srautui, o šaltinio temperatūra buvo nustatyta 120 uC. Kapiliarinė ir kūgio įtampa buvo nustatyta atitinkamai 2500 ir 40 V. Duomenys buvo renkami nuo 50 iki 1200 Da su 0.{11}} s nuskaitymo laiku ir 0.{13}} s skenavimo delsa per 15- min analizės laiką. Argonas buvo naudojamas kaip susidūrimo dujos, esant 7,06661023 Pa slėgiui. Visi MS duomenys buvo surinkti naudojant LockSpray sistemą, siekiant užtikrinti masės tikslumą ir atkuriamumą. Leucino-enkefalino [MH]-jonas, esant m/z 554,2615, buvo naudojamas kaip užrakto masė esant neigiamam ESI režimui.
Duomenų analizė
Buvo analizuojami Cistanches Herba mėginių UPLC-QTOF/MS duomenys, siekiant nustatyti galimus diskriminuojančius kintamuosius. ES neapdorotų duomenų smailių radimas, derinimas ir filtravimas buvo atliktas naudojant Marker Lynx programų tvarkyklę, 4.1 versiją (Waters, Man chester, JK). Naudoti šie parametrai: sulaikymo laikas (tR) 0–15 min., masė 50-1200 Da, sulaikymo laiko tolerancija 0,02 min ir masės tolerancija 0,02 Da. Buvo naudojami trys kartotiniai mėginiai, surinkti iš kiekvienos geografinės vietos (n=3). Iš viso modeliui sukurti buvo panaudoti 6 339 kintamieji.
DNR brūkšninis kodavimas: DNR ekstrahavimas, PGR amplifikacija ir sekos nustatymas
Mėginiai, paimti iš džiovintų mėsingų C. deserticola ir C. tubulosa (30 mg) stiebų, buvo trinami 2 minutes 30 r/s dažniu. DNR buvo išskirta pagal gamintojo instrukcijas (Tiangen). Konkrečiai, protokolas buvo pakeistas taip, kad chloroformas buvo pakeistas chloroformo mišiniu: izoamilo alkoholis (24:1 tame pačiame tūryje) ir buferinis tirpalas GP2 su izopropanoliu (toks pat tūris). Įtrinti milteliai suberti į 1,5 ml eppendorfo mėgintuvėlius, įpilta 700 ml 65 uC pašildyto GP1 ir 1 ml b-merkaptoetanolio, kad maišytų naudojant sūkurį 10–20 s, ir inkubuojama 60 minučių 65 uC temperatūroje; Pridedant 700 ml chloroformo: izoamilo alkoholio (24:1) mišinio, centrifuguojama 5 minutes 12000 aps./min (134006g); Pipete supilkite supernatantą į naują mėgintuvėlį, įpilkite 700 ml izopropanolio, maišykite 15–20 minučių; Visą mišinį supilkite į sukimo kolonėlę CB3 ir centrifuguokite 40 s esant 12000 aps./min.; Išmeskite filtratą ir įpilkite 500 ml GD (prieš naudojimą įpilkite kiekybinio bevandenio etanolio), centrifuguokite 12 000 aps./min. greičiu 40 s; filtrato išmetimas ir 700 ml PW (prieš naudojimą įpilant kiekybinio bevandenio etanolio) membranai išplauti, centrifuguoti 40 s esant 12000 aps./min.; Išmeskite filtratą ir įpilkite 500 ml PW, centrifuguokite 40 s esant 12000 aps./min.; Išmeskite filtratą ir centrifuguokite 2 minutes 12000 aps./min., kad pašalintumėte plovimo buferio likučius PW; Sukimo kolonėlės CB3 perkėlimas į švarų 1,5 ml Ependorfo mėgintuvėlį ir džiovinimas kambario temperatūroje 3–5 minutes; Centrifuguokite 2 minutes 12000 aps./min., kad gautumėte bendrą DNR. Polimerazės grandininės reakcijos (PGR) pradmenys buvo pagrįsti anksčiau nurodytomis sekomis [4, 5]. PGR reakcijos mišiniuose buvo 2-mL DNR šablono, 8.{51}} mL ddH2O, 12.5-mL 26Taq PCR pagrindinio mišinio (Beijing TransGen Biotech Co., Kinija), 1/{{57 }}mL pirmyn/atvirkštiniai (F/R) pradmenys (2,5 mM), galutinis tūris 25 ml. PGR amplifikacija buvo atlikta taip, kaip aprašyta Kress ir kt. [4]. PGR reakcijos pradmenys buvo fwd PA: GTTATGCATGAACGTAATGCTC (59- 39) ir rev TH: CGCGCATGGTGGATTCACAATCC (59-39). PGR produktai buvo atskirti ir aptikti 1 procento agarozės gelio elektroforeze. PGR produktai buvo išgryninti pagal gamintojo protokolą ir tiesiogiai sekvenuoti.
Pagrindinis veiksmingas cistanche junginys: Akteozidas
Rezultatai
Preliminarus smailių priskyrimas pagal UPLC-QTOF/MS Reprezentatyvios C. deserticola ir C. tubulosa chromatogramos iš skirtingų auginimo sričių parodytos 1 paveiksle. Pirštų atspaudų chromatograma parodė Cistanches Herba mėginių panašumus. Iš viso buvo aptiktos 23 kvalifikuotos masės smailės, o 16 smailių buvo identifikuota suderinus sulaikymo laiką ir masės spektrus su anksčiau nurodytais (2 lentelė) [29–35]. 2, 3, 5, 6, 7, 8, 9, 11, 12, 15, 16, 17, 20, 21, 22 ir 23 smailės buvo preliminariai identifikuotos kaip cistanozidas F, mussaenozido rūgštis, cistanbulozidas C1/C2, kampneozidas II. , kampneozido II, echinakozido, cistanozido A, akteozido, izoakteozido, siringalido A-39-aL-ramnopiranozido, cistanozido C, 29-acetilaktozido, osmantuzido B, cistanozido D, tubulozido B, cistanozido B ir atitinkamo cistanozido B izomeras. . Nustatyta, kad cheminės sudedamosios dalys pirmiausia yra feniletanoidiniai glikozidai (PhG), o vienas junginys, mussaenozido rūgštis, buvo iridoidinis polisacharidas. PhG yra pagrindiniai aktyvūs junginiai gydant inkstų nepakankamumą ir antioksidacinį bei neuroprotekcinį poveikį [36]
C. deserticola ir C. tubulosa PCA
PCA buvo naudojamas skirtingų augalų rūšių pavyzdžiams atskirti. PCA yra neprižiūrimas daugiamatis duomenų analizės metodas, kuriuo siekiama vizualizuoti daugiamatių antrinės metabolitų sudėties duomenų panašumus ir (arba) skirtumus [37]. Dviejų komponentų PCA modelis bendrai sudarė 46,04 proc. pokyčio (PC1, 36,43 proc.; PC2, 9,61 proc.). 2 paveiksle parodyta, kad 24 mėginiai buvo suskirstyti į dvi grupes PCA baluose, pateiktuose pagal rūšies kilmę, o tai rodo, kad C. deserticola ir C. tubulosa cheminė sudėtis labai skyrėsi.
Pagrindinis veiksmingas cistanche junginys: echinakozidas
