1 dalis: Cistanche Deserticola ekstraktai gali antagonizuoti imunosenescenciją ir pailginti gyvenimo trukmę pelėms, linkusioms į senėjimą 8 (SAM-P8)

Kontaktai: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 El. paštas:audrey.hu@wecistanche.com

Ke Zhang, 1 Xu Ma, 1 Wenjun He, 1 Haixia Li, 1 Shuyan Han, 1 Yong Jiang, 1

Hounan Wu, 2 Li Han, 3 Tomohiro Ohno, 3 Nobuo Uotsu, 3 Kohji Yamaguchi, 3 Zhizhong Ma, 1, 4 ir Pengfei Tu1

1 Natūralių vaistų katedra, Farmacijos mokslų mokykla, Pekino universitetas, Nr. 38 Xueyuan Road, Pekinas 100191, Kinija

2 Medicinos ir sveikatos analizės centras, Pekino universitetas, Nr. 38 Xueyuan Road, Pekinas 100191, Kinija

3 Fundamentinių tyrimų fakultetas, Fancl tyrimų institutas, FANCL Corporation, 12-13 Kamishinano, Totsuka-ku, Jokohama, Kanagava 244-0806, Japonija

4 Tradicinės kinų ir vakarų medicinos integracijos skyrius, Pekino universiteto Pagrindinių medicinos mokslų mokykla, Nr. 38 Xueyuan Road, Pekinas 100191, Kinija

Korespondencija turėtų būti adresuojama Zhizhong Ma; zhma@bjmu.edu.cn ir Pengfei Tu; pengfeitu@bjmu.edu.cn Gauta 2013 m. liepos 19 d.; Peržiūrėta 2013 m. spalio 23 d.; Priimta 2013 m. lapkričio 11 d.; Paskelbta 2014 m. sausio 9 d.; Akademinis redaktorius: Adair Santos

1. Įvadas

Cistanche deserticola, vienas populiariausių tradicinių kiniškų vaistažolių ir (arba) sveikatos produktų, daugelyje istorinių Kinijos žolelių farmakopėjų aprašytas kaip turintis senėjimą stabdančių savybių. Todėl Kinijoje jis buvo plačiai naudojamas įvairiems su amžiumi susijusiems sutrikimams, įskaitant senatvinę demenciją, impotenciją, nevaisingumą, lėtinę infekciją ir pagyvenusių žmonių kraujodaros sutrikimus, gydyti [1]. Šiuolaikiniai cheminiai metodai leido išskirti dviejų pagrindinių tipų junginius, feniletanoidinius glikozidus ir oligosacharidus, kurie yra pagrindinės Cistanche deserticola veikliosios medžiagos [1]. Pastarąjį dešimtmetį Cistanche deserticola ir jos ekstraktai buvo intensyviai tiriami ir įrodyta, kad jie gali apsaugoti neuronus nuo neurotoksinų sukeltų pažeidimų[2], slopinti anglies tetrachlorido sukeltą hepatotoksiškumą [2] ir skatinti kaulų čiulpų ląstelių atsigavimą Kartu sukelta radiacijos žala [3]. Taip pat buvo įrodyta, kad jis turi priešuždegiminį, antioksidacinį ir senėjimą stabdantį poveikį [4]. Tačiau ar Cistanche deserticola gali pailginti gyvenimo trukmę ir kokie yra pagrindiniai molekuliniai mechanizmai [3], susiję su jaanti-senėjimosavybės nebuvo griežtai išbandytos.

Anti-senėjimo Cistanche deserticola ekstraktai

Imunosenescencija, ty imuninės sistemos pokyčiai su amžiumi, yra pagrindas, dėl kurio vyresnio amžiaus žmonėms yra padidėjęs jautrumas infekcijoms, vėžiui, neurodegeneracinėms ligoms ir autoimuninėms ligoms [5]. Buvo pranešta, kad terapinės intervencijos, tokios kaip kalorijų ribojimas [6] ir vitamino E papildai, veiksmingos sulėtinant imuninės sistemos senėjimo progresavimą ir sumažinant sergamumą kai kuriomis su amžiumi susijusiomis ligomis, taip pat pailginant žmonių ir graužikų gyvenimo trukmę. [7, 8]. Tačiau šios srities tyrimus apsunkina tai, kad senėjimas yra susijęs su imuninės sistemos nepakankamumo ir lėtinio uždegimo paradoksu [9]. Tai reiškia, kad paprastas limfocitų išsiskyrimo stimuliavimas ar priešuždegiminis poveikis nėra ideali terapinė intervencija kovojant su senėjimu ir su amžiumi susijusiomis sąlygomis [10]. Todėl ieškant medicininių intervencijų, galinčių užkirsti kelią su amžiumi susijusioms ligoms, įskaitant infekcijas, vėžį, autoimunines ligas, aterosklerozę ir neurodegeneracines ligas, kurios yra pagrindinės mirties ir negalios priežastys, arba jas palengvinti, ir imuninės sistemos defektų taisymas turi būti lydimas uždegiminės reakcijos.

Senėjimo pagreitinta pelė [11] yra inbred pelės modelis, gautas iš AKR/J padermės, plačiai naudojamas senėjimo tyrimuose. Šių pelių P8 padermė (SAM-P8) turi žymiai trumpesnę gyvenimo trukmę, palyginti su R1 padermiu (SAM-R1), kuris taip pat rodo lėtesnį senėjimo procesą [12]. Lygiagrečiai su ankstyvu senėjimu, SAM-P8 pelėms taip pat būdingas padidėjęs neurologinis senėjimas, imuninės sistemos senėjimas ir su amžiumi susiję kraujodaros trūkumai, kurie labai primena tipiškas žmogaus senėjimo ypatybes [13, 14]. Pagrindinių mechanizmų, atsakingų už pagreitintą senėjimo procesą ir su amžiumi susijusius sutrikimus, analizė rodo, kad tai susiję su mitochondrijų disfunkcija [15], oksidaciniu stresu ir padidėjusiu somatinių DNR mutacijų greičiu [16, 17]. Todėl ši pelių sistema, turinti homogeninį genetinį foną, yra puikus eksperimentinis senėjimo ir senėjimo terapijos tyrimo modelis [12], deponuotas Pekino universiteto Farmacijos mokslų mokyklos herbariume, Kinijoje.

cistanche gali kovoti su senėjimu

2. Medžiagos ir metodai

2.1. Medžiagos.

ŠviežiasCistanche deserticola YC MAbuvo surinktas iš įvairių vietovių šiaurės vakarų Kinijoje, įskaitant Sindziango, Neimenggu ir Ningxia autonominius regionus. Ekstraktams ruošti naudotus mėginius patvirtino Pekino universiteto Farmacijos mokslų mokyklos Natūralių vaistų katedros farmakognozijos specialistas profesorius Pengfei Tu. Cistanche deserticola (numeris CD-2007-03-08) kupono pavyzdys buvo Mokslo centras (Pekinas, Kinija). Šį tyrimą patvirtino Pekino universiteto gyvūnų tyrimų komitetas ir jis buvo atliktas pagal Pekino universiteto laboratorinių gyvūnų priežiūros ir naudojimo gaires. Šių pelių sertifikavimo numeris buvo SCXK2001-2008. Pelės buvo laikomos standartiniuose metaboliniuose narvuose aplinkos sąlygomis

C, 45–60 procentų drėgmė ir 12 valandų šviesos / tamsos ciklas) ir leido laisvai patekti į maistą ir vandenį. Po 2 savaičių aklimatizacijos gyvūnai buvo suskirstyti į penkias grupes: 3 ECD gydymo grupes, SAM-R1 kontrolinę grupę ir negydomą SAM-P8 kontrolinę grupę. 3 gydymo grupių dieta buvo papildyta dieta, sumaišyta su skirtingomis ECD koncentracijomis: mažomis (50 mg/kg), vidutinėmis (150 mg/kg) ir didelėmis (450 mg/kg) vidutinėmis ECD dozėmis per parą. . SAM-R1 ir SAM-P8 kontrolinės grupės nebuvo šeriamos ta pačia dieta be ECD. Viso eksperimento metu visų gyvūnų maisto suvartojimas buvo matuojamas kas tris dienas. Kraujo spaudimas ir širdies mėnesiai per eksperimentą, siekiant nustatyti pelių sveikatos būklę. Kiekvienos pelės gyvenimo trukmė buvo gyvybingi apoptoziniai ir nekroziniai limfocitai buvo kiekybiškai įvertinti naudojant Annexin V-FITC rinkinį (Beijing Biosea Biotechnology Co., Ltd., Pekinas, Kinija). Limfocitai buvo dvigubai nudažyti fluoresceino izotiocianatu konjuguotu pažymėtu aneksinu V (Aneksino V-FITC) ir suspensuoti 200 jungiamojo buferio (10 mM HEPES/NaOH,

2.2 Cistanche deserticola (ECD) ekstraktų paruošimas ir HPLC analizė.

Džiovinta ore ir supjaustyta Cistanche deserticola(2.{1}} kg) buvo sumalti į miltelius ir du kartus ekstrahuota 70 procentų etanoliu 1 valandą. Pirmą kartą ekstrahuojant naudotas augalų ir etanolio santykis buvo 1/6 (m/m), o antroje – 1/4 (m/m). Abu ekstraktai buvo sujungti ir filtruojami prieš sukoncentruojant iki 1,10–1,15 santykinio tankio sumažintame slėgyje 60 °C temperatūroje. Tada šis koncentratas vakuumuojamas ir išdžiovinamas, o gauti milteliai buvo Cistanche deserticola (ECD) ekstraktas, naudojamas šiame tyrime. .

ECD komponentai buvo analizuojami naudojant HPLC, kaip aprašyta anksčiau [1]. Trumpai tariant, 100 mg ECD miltelių buvo ištirpinta 10.0 ml HO ir po filtravimo įšvirkščiama į HPLC. HPLC analizė buvo atlikta naudojant Agilent 1100 skysčių chromatografijos sistemą (Agilent Co., JAV). Mobiliąją fazę sudarė metanolio (A) ir 0,10 procentų metano rūgšties (B) mišinys. Naudota gradiento chromatografijos programa; tai buvo 26,5 procento (A) ir 73,5 procento (B) per 0–7 min., 26,5–29,5 procento (A) ir 73,5–70,5 (B) per 8–10 min., o 29,5 procento (A) ir 70,5 procento (B) ) per 20–27 min. Srauto greitis buvo pastovus 1,0 ml/min., įpurškimo tūris buvo 10 ml, o kolonėlės temperatūra palaikoma 25 °C. 330 nm UV detektorius buvo naudojamas kolonėlės nutekėjimui stebėti ir chromatogramoms generuoti.

Džiovinta ir supjaustyta Cistanche deserticola

Feniletanoidiniai glikozidai ir cistanche oligosacharidaibuvo identifikuoti pagal jų sulaikymo laiką ir sugerties spektrus. Kiekybinis įvertinimas buvo atliktas išorinėmis standartinėmis kalibravimo kreivėmis. Derlius išCistanche deserticola ekstraktai(ECD) buvo apie 3,33 proc., o feniletanoidų kiekis – 17,94 proc. Akteozidas ir echinakozidas buvo dvi pagrindinės šios frakcijos sudedamosios dalys, kurių kiekis buvo atitinkamai 3,80 ir 8,25 proc. Oligosacharidai sudaro 82 procentus viso ECD. Pagrindinių aktyvių ECD komponentų koncentracijos pateiktos 1 lentelėje.

2.3 Gyvūnų gyvenimo trukmės analizė.

Šiame tyrime daugiausia dėmesio buvo skiriama ištirti, arCistanche deserticola ekstraktaigali pratęsti SAM-R1 pelių gyvenimo trukmę, įsigytos iš Pekino universiteto Sveikatos SAM-P8 laboratorinių gyvūnų veisimo ir tyrimų centro ir pakeisti jų imunosenescencijos būseną.

2.4. Statistinė analizė.

Duomenys rodomi kaip vidutinės vertės SD Skirtingų grupių palyginimai buvo atlikti naudojant vienpusį ANOVA su post hoc testu. Gyvenimo trukmės tyrime duomenims buvo atlikta Kaplan-Meier išgyvenamumo analizė, kuri apėmė ir Log-rank (Mantel-Cox) ir Gehan-Breslow-Wilcoxon testus. Statistinė analizė buvo atlikta naudojant statistinį socialinių mokslų paketą, skirtą Windows (SPSS, fosfatiniu buferiniu tirpalu (PBS, pH 7,4), kurio sudėtyje yra 0,01 proc. natrio azido, ir buvo atlikta FCM analizė. Limfocitų subpopuliacijos buvo analizuojamos pagal srautą citometrija naudojant FACS Calibur srauto citometrą (BD Biosciences, San Diego, CA, JAV) ir BD CellQuest analizės programinę įrangą. Čikaga, IL) ir a yra reikšminga.

Feniletanoidiniai glikozidai ir cistanche oligosacharidai

3. Rezultatai

Buvo atsižvelgta į mažesnę nei 0.05 reikšmę.Periferinių T limfocitų ląstelių gyvybingumo įvertinimas naudojant aneksino V-FITC ir PI dvigubą dažymą ir FACS analizę. Po SAM-P8 pelių dietos papildymo trimis ECD dozėmis 4 savaites, gyvūnai buvo pritvirtinti 12 valandų, po to buvo anestezuoti, o kraujas buvo paimtas ir analizuojamas.

3.1. Potencialių aktyvių komponentų Cistanche deserticola (ECD) ekstraktuose analizė. Kaip parodyta 1 lentelėje, ECD daugiausia sudaro dviejų tipų junginiai – feniletanoidiniai glikozidai ir oligosacharidai. Feniletanoidiniuose glikoziduose buvo nustatytas echinakozidas, akteozidas ir 8-epilogano rūgštis, o oligosachariduose – tik galaktitolis.

3.2.CistanchedeserticolakbdO4ct poveikis vidutinei SAM-P8 pelių gyvenimo trukmei. Šiam ir tolesniems tyrimams aštuonių mėnesių amžiaus SAM-P8 pelių patinai buvo suskirstyti į 4 grupes. Iš jų viena pelių grupė buvo šeriama įprasta mityba be ECD, kitos 3 grupės atskirai valgė ėdalą, kuriame yra skirtingos ECD proporcijos. Visuose eksperimentuose kaip kontrolinė grupė buvo naudojamos pelės iš SAM-R1 padermės, kurių senėjimo procesas ir gyvenimo trukmė yra neįprasti.

Palyginti su kontroline SAM-R1 grupe, vidutinė SAM-P8 pelių gyvenimo trukmė buvo žymiai sutrumpėjusi (1 paveikslas (a);<0.001). although="" supplementation="" of="" diet="" with="" the="" low="" dose(50mg/kg)of="" ecd="" failed="" to="" produce="" a="" significant="" increase="" in="" life="" spanofsam-p8mice,="" at="" the="" medium="" (150="" mg/kg)and="" high(450="" mg/ml)="" supplementary="" doses="" there="" was="" a="" dose-dependent="" increase="" in="" life="" span="" (figures="" 1(a)and=""><0.05 0.0thatwasconfirmedby="" kaplan-meier="" survival="" analysis,="" which="" included="" use="" of="" both="" the="" log-rank="" (mantel-cox)="" and="" gehan-breslow-wilcoxon="">

3.3. SAM-P8 pelių imunosenescencijos panaikinimas naudojant Cistanche deserticola (ECD) ekstraktus. Periferinių naivų T limfocitų sumažėjimas ir kartu padidėjęs periferinės atminties T limfocitų skaičius yra ryškūs imuninės sistemos senėjimo požymiai, kurie plačiai laikomi pagrindinėmis su amžiumi susijusių imunologinių anomalijų priežastimis. Ši imunosenescencija SAM-P8, palyginti su SAM-R1

aniftalsv0akivaizdžiai akivaizdu, kai FACS analizė turėjo surašyti (CD3 plius CD44wCD4Bigh) limfocitus kaip naivių T ląstelių rodiklį ir (CD3 plius CD44gh CD45 BR limfocitus kaip atminties T-ląstelių rodiklį. Taigi, periferinio kraujo 2 paveikslas) ir blužnies ląstelė (3 pav.) SAM-P8 pelėms buvo pastebėtas sumažėjęs naivių T ląstelių populiacijų lygis ir padidėjęs atminties T ląstelių kiekis Nustatyta, kad SAM-P8 pelių raciono papildymas ECD gali pakeisti šiuos imunosenescencijos rodiklius doze, priklausomybė tiek periferinio kraujo (2 pav.), tiek blužnies ląstelių (3 pav.) populiacijose. Kaip papildomas imunosenescencijos pasikeitimo ECD papildant mitybą rodiklis, natūralių žudikų [18] ląstelių lygis, nuostabus įgimtos imuninės sistemos ląstelinis žymeklis Tai parodė, kad ECD dietos papildymas lėmė nuo dozės priklausomą NK(CD3 plius CD49 plus ) ląstelių padidėjimą tiek periferinio kraujo (4 pav.), tiek blužnies ląstelių (5 pav.) limfocitų populiacijose.

3.4. Cistanche deserticola ekstraktai stiprina Sca{2}} teigiamų ląstelių santykinį fluorescencijos intensyvumą SAM-P8 pelėse. Kamieninių ląstelių antigenas-1(Sca-1) yra vienas ryškiausių kraujodaros kamieninių ląstelių (HSC) biologinių žymenų kaulų čiulpų ląstelių populiacijose. Sca-1 teigiamos ląstelės taip pat yra limfocitų pirmtakai, turintys buvo naujai eksportuojami iš kaulų čiulpų į periferinį kraują, kur jie patenka.

2 paveikslas: Maisto papildymo su ECD netiesioginio ir atminties poveikio analizė Tlimfocitezino periferiniam kraujui. Aštuonių mėnesių patinai SAM-P8 ir kontrolinės SAM-RI pelės buvo suskirstytos į 5 grupes. 3 gydymo SAM-P8 gyvūnų grupės buvo šeriamos keturias savaites ėdalu, papildytu mažomis (100 mg/kg), vidutinėmis (500 mg/kg) ir didelėmis (2500 mg/kg) ECD dozėmis, o du kontroliniai gyvūnai.

Naudojant CD3 plius Tcels. Linijos, kurios nerodomos viename plokštumoje, nurodo slenksčius, naudojamus atskirti CD44x* ir CD45, naudojant bendrą žemą naivių (CD3 plius Cp b"C4RB→) ir atminties (CD3 plius CD4hCD 4Bl) T ląstelių identifikavimą. b) Histograma, rodanti grupes, buvo paduota 12 valandų nevalgius, iš anestezuotų RB T ląstelių pogrupių gyvūnų buvo paimtas periferinis kraujas ir atlikta FACS analizė, kaip aprašyta 5 skyriuje. skirtingų gyvūnų grupių periferiniame kraujyje. (c) Histograma, rodanti atminties T ląstelių procentą skirtingų gyvūnų grupių periferiniame kraujyje. Stulpeliai rodo vidurkį ± SD (kiekvienoje grupėje,=10).<0.05sam-p8versus>

3 pav. Maisto papildymo su ECD ir atmintimi poveikio FACS analizė. Tlimfocitai blužnyje. Aštuonių mėnesių SAM-P8 ir kontrolinės SAM-RI pelių patinėliai buvo suskirstyti į 5 grupes. 3 gydymo SAM-P8 gyvūnų grupės buvo šeriamos keturias savaites papildomu maistu. su mažomis (100 mg/kg), vidutinėmis (500 mg/kg) ir didelėmis (2500 mg/kg) ECD dozėmis ir dviem kontrolinėmis gyvūnų grupėmis, naudojant CD3 plius Tląsteles. Kiekviename diagramoje parodytos linijos rodo, kad turėtų būti naudojamas atskirti CD44 ir CD45 bw, naudojamus, kad būtų galima identifikuoti naivius (CD3 plius CD "CsRB动") ir atmintį (CD3 plius CD42CD I'm) Tcels. (b) Histogramos rodymas buvo įtrauktas į 12 valandų nevalgius, blužnies limfocitai buvo paimti iš anestezuotų RB T ląstelių pogrupių gyvūnų ir jiems buvo atlikta FACS analizė, kaip aprašyta 5 skyriuje.

4 paveikslas: ECD maisto papildų poveikis natūralioms žudikų ląstelėms (NK ląstelėms, CD3 plius CD49 ir ​​T ląstelėms) SAM-P8 pelių periferinio kraujo limfocitų populiacijose. Aštuonių mėnesių patinai SAM-P8 ir kontrolinės SAM-RI pelės buvo suskirstytos į 5 grupes. 3 gydymo SAM-P8 gyvūnų grupės buvo šeriamos keturias savaites ėdalu, papildytu mažomis (100 mg/kg), vidutinėmis (500 mg/kg) ir didelėmis (2500 mg/kg) ECD dozėmis, o dvi kontrolinės gyvūnų grupės buvo skirtos ta pati dieta be papildų. Po 12 valandų nevalgius, iš anestezuotų gyvūnų buvo paimtas periferinis kraujas ir atlikta FACS analizė, kaip aprašyta 5 skirsnyje. (a) Reprezentatyvūs skirtingų pelių grupių FACS grafikai, sudaryti sujungiant CD3 plius CD49 ir ​​T ląsteles. (b) Histograma, rodanti skirtingų gyvūnų grupių natūralaus žudiko T-ląstelių periferinio kraujo procentą. Juostos rodo vidurkį ± SD (kiekviena grupė, =10).=<0.01><0.01 each="" treatedgroup="" versussam-p8group="" (byone="" way="" anovawith="" post="" hoc="">

5 pav. ECD maisto papildų poveikis natūralioms žudančioms ląstelėms (NKląstelėmis, CD3 plius CD49 plius T-ląstelėmis) SAM-P8 pelių blužnies limfocituose. Aštuonių mėnesių patinai SAM-P8 ir kontrolinės SAM-RI pelės buvo suskirstytos į 5 grupes. 3 gydymo SAM-P8 gyvūnų grupės buvo šeriamos keturias savaites maistu, papildytu mažomis (100 mg/kg), vidutinėmis (500 mg/kg) ir didelėmis (2500 mg/kg) ECD dozėmis, o dvi kontrolinės gyvūnų grupės buvo šeriamos. šeriami ta pačia dieta be papildų. Po 12 valandų nevalgius blužnies limfocitai buvo paimti iš anestezuotų gyvūnų ir jiems buvo atlikta FACS analizė, aprašyta 5 skirsnyje. (a) Reprezentatyvus skirtingų pelių grupių FACS brėžinys, sukurtas apimant CD3 ir CD494 T ląsteles. (b) Histograma, rodanti natūralaus žudiko T procentą. skirtingų gyvūnų grupių blužnies limfocitų ląstelės. Stulpeliai rodo vidutinį SD (kiekvienoje grupėje,=10), # < 0,01="" sam-p8="" yersus=""><0.01 eachtreatedgroup="" versussam-p8group(by="" oneway="">

Tolesnė diferenciacija į įvairių tipų subrendusius limfocitus. Todėl šios Sca{0}} teigiamos ląstelės yra pagrindinis naivių T limfocitų šaltinis periferiniame kraujyje. 6 paveiksle parodyta, kad palyginti su SAM-R1 kontrolinėmis pelėmis, santykinis Sca-1 teigiamų ląstelių fluorescencijos intensyvumas SAM-P8 pelėse buvo žymiai mažesnis. Nustatyta, kad SAM-P8 pelių dietos papildymas trimis skirtingomis ECD dozėmis žymiai padidino Sca-1 teigiamų ląstelių santykinį fluorescencijos intensyvumą (6 pav.).

Cistanche žolės nauda: stabdo senėjimą