1 dalis: Žmogaus pieno oligosacharidas 2/-Fukozilaktozė sukelia neuroprotekciją nuo intracerebrinio hemoraginio insulto

Kontaktai: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 El. paštas:audrey.hu@wecistanche.com

Tsai-Wei Hung 1, Kuo-Jen Wu 1, Yu-Syuan Wang 1, Eun-Kyung Bae 1, YoungHa Song 2, JongWon Yoon 2 ir Seong-Jin Yu1,*

1Neuropsichiatrinių tyrimų centras, Nacionaliniai sveikatos tyrimų institutai, Zhunan 35053, Taivanas;

pilypily@nhri.edu.tw (T.-WH); kjwu@nhri.edu.tw (K.-JW); yswang@nhri.edu.tw (Y.-SW);

baee@nhri.edu.tw (E.-KB)

2Advanced Protein Technologies Corporation, Suwon-si 16229, Korėja; yhsong@aptech.biz (YS);

jongwon.yoon91@gmail.com (JY)

Susirašinėjimas: b7508@nhri.edu.tw; Tel.: plius 886-37206166 (el. 36710)

Santrauka:

Intracerebrinis kraujavimas (ICH) atsiranda, kai smegenų kraujagyslės plyšta, sukeldamos uždegimą ir ląstelių mirtį. 2-Fukozilaktozė (2FL), motinos pieno oligosacharidas, turi stiprų antiapopotinį ir priešuždegiminį poveikį. Šio tyrimo tikslas buvo ištirti apsauginį 2FL poveikį ICH ląstelių ir graužikų modeliuose. Heminas buvo pridėtas prie pirminės žiurkės žievėsneuronųir BV2 mikroglijų kokultūra, imituojanti ICH in vitro. IBA1 ir MAP2 imunoreaktyvumas buvo naudojamas uždegimui nustatyti irneuronųišlikimas. Heminas žymiai padidino IBA1, o sumažino MAP2 imunoreaktyvumą. 2FL reikšmingai priešinosi abiem atsakymams. Apsauginis 2FL poveikis buvo toliau tiriamas naudojant žiurkės ICH modelį. VII tipo kolagenazės intracerebrinis vartojimas sumažino atviro lauko lokomotorinį aktyvumą. Ankstyvas gydymas 2FL žymiai pagerino lokomotorinį aktyvumą. Smegenų audiniai buvo surinkti imunohistochemijai ir qRT-PGR analizei. 2FL sumažino IBA1 ir CD4 imunoreaktyvumą pažeistame striatum. 2FL sumažino ER streso žymenų (PERK ir CHOP) ekspresiją, tuo tarpu padidino M2 makrofagų žymenų (CD206 ir TGF) reguliavimą pažeistose smegenyse. Apibendrinant, mūsų duomenys patvirtina, kad 2FL turi aneuroprotekcinispoveikis prieš ICH per slopinimąneuronų uždegimasir ER stresas. 2FL gali turėti klinikinių pasekmių ICH gydymui.

Raktiniai žodžiai: 2-fukozilaktozė; intracerebrinis hemoraginis insultas; uždegimas; endoplazminis Tinklelis

cistanche ekstrakto poveikis: gydyti neurologines ligas

Pls spustelėkite čia, kad pamatytumėte 2 dalį

1. Įvadas

Intracerebrinis kraujavimas (ICH) yra pagrindinisneurologiniaisutrikimas, susijęs su didele suaugusiųjų mirties rizika [1,2]. ICH sudaro 10–15 procentų visų ūminių insulto atvejų [3]. Keli epidemiologiniai tyrimai patvirtino lyčių skirtumus tarp pacientų, sergančių ICH [4] arba smegenų kraujagyslių ligomis [5]. Nedidelei daliai ICH pacientų išsivysto hemoraginis lakūninis sindromas [6]. Dabartinis ICH gydymas yra skirtas kraujavimo kontrolei, kraujo krešulio pašalinimui ir kraujavimo sukelto intrakranijinio slėgio mažinimui. Nėra veiksmingo ICH farmakologinio gydymo.

Uždegimas vaidina svarbų vaidmenį ICH sukeltame proceseneurodegeneracija. Prasidėjus ICH, kraujo ląstelės patenka į smegenų parenchimą, suaktyvina mikrogliją ir pradeda gaminti priešuždegiminius citokinus [7,8]. Heminas, šalutinis hemoglobino produktas, sukelianeuronųmirtį ir sukelia apoptozę bei uždegimą [9,10]. Keletas tyrimų patvirtino priešuždegiminio gydymo veiksmingumą ICH gyvūnų modeliuose [11,12]. Neseniai parodėme, kad ankstyvas gydymas CXCR4 antagonistu CX807 slopino uždegimą ir pagerino eksperimentinių ICH žiurkių elgesio funkciją [13]. Šie duomenys rodo, kad priešuždegiminis gydymas gali sumažinti smegenų pažeidimą

po ICH.

Žmogaus motinos piene yra maistinių medžiagų ir keletas svarbių biologiškai aktyvių ingredientų [14], pvz., motinos pieno oligosacharidų (HMO) [15]. 2′-fukozilaktozė (2FL) yra pagrindinis oligosacharidas moters piene. Pagerėjo 2FL pristatymas per burnąatmintisir mokymasis žiurkėms [16,17]. Be to, 2FL slopino lipopolisacharidų sukeltą CD14 ekspresiją ir uždegimą žmogaus enterocituose [18]. Neseniai pranešėme, kad 2FL sumažėjoneuronų uždegimassergant išeminiu insultu smegenyse [19]. Šie duomenys rodo, kad 2FL yra stiprus priešuždegiminis agentas, todėl gali būti naudingas ICH gydymui.

Šio tyrimo tikslas buvo ištirti 2FL neuroninius apsauginius veiksmus ICH ląstelių ir gyvūnų modeliuose. Heminas buvo naudojamas ICH modeliavimui ląstelių kultūroje [20]. Mes parodėme, kad 2FL antagonizuoja hemino sukeltą mikroglijos aktyvavimą. VII tipo kolagenazė buvo naudojama suaugusių žiurkių židinio ICH generavimui [13]. Mes nustatėme, kad 2FL žymiai sumažino ICH sukeltą mikroglijų aktyvaciją, CD4 ir limfocitų infiltraciją bei ER stresą pažeistose smegenyse ir pagerino elgesio funkciją. Mūsų duomenys patvirtina, kad 2FL turi aneuroprotekcinispoveikis prieš ICH.

cistanche ekstrakto poveikis

2. Rezultatai

2.1. 2FL sumažinta hemino sukelta neurodegeneracija pirminiuose žievės neuronuose ir BV2 mikroglijos kultūroje

Apsauginis 2FL poveikis pirmą kartą buvo ištirtas smegenų kraujavimo ląsteliniame modelyje. Pirminė žievėneuronųir BV2 mikroglijos kokultūros buvo apdorotos heminu (10 uM) 48 valandas (žr. laiko juostą 1E paveiksle). Heminas susilpnėjoneuronųžymeklį MAP2 (1A pav.), o padidino mikroglijos žymeklį IBA1 (1B pav.). Abu šie atsakai buvo antagonizuoti 2FL (1 uM, 1A, B pav.). MAP2 ir IBA1 imunoreaktyvumas buvo toliau analizuojamas matuojant konkrečių žymenų pikselių tankį. Kaip matyti 1C, D paveiksluose, heminas žymiai sumažino MAP2 imunoreaktyvumą (Map2-ir) ir padidino IBA1-ir (p < 0).{19}}0="" 1,="" vienpusė="" anova,="" n="6" kiekvienoje="" grupėje).="" šiuos="" atsakymus="" labai="" priešinosi="" 2fl="" (map2:="" p="">< 0,001,="" f2,="" 14="115.863;" iba1:="" p="">< 0,001,="" f2,="" 15="134.644," vienpusė="">

F

1 pavneuroprotekcinis2FL poveikis pirminėje žievėjeneuronasir BV2 mikroglijų kokultūra. (A) Reprezentatyvios mikrofotografijos rodo, kad heminas sumažino MAP2 imunoreaktyvumą (-ir). Vartojimas kartu su 2FL stabdė hemino sukeltą MAP-ir praradimą. (B) Heminas padidino IBA1-ir. Vartojimas kartu su 2FL sumažintu IBA1-ir. (C,D) MAP2-ir arba IBA{{10}}ir pikselių tankis buvo analizuojamas naudojant NIS Elements AR 5.11 programinę įrangą. (C) 2FL reikšmingai antagonizuoja hemino sukeltą MAP{15}ir praradimą. (D) 2FL žymiai susilpnino hemino sukeltą IBA1 aktyvumą. (E) Eksperimento laiko juosta. * p < 0,05.="" mastelio="" juosta="100">

cistanche ekstrakto nauda

2.2. Gydymas 2FL pagerintu lokomotoriniu aktyvumu ICH žiurkėms

Apsauginis 2FL poveikis buvo toliau tiriamas naudojant ICH gyvūnų modelį. Iš viso 14 suaugusių žiurkių patinų stereotaktiškai buvo sušvirkšta maža VII tipo kolagenazės dozė (0,5 vienetų/uL × 1 uL), kad sukeltų smegenų kraujavimą dešiniajame striatum. 2FL (400 mg/kg/d, ip, n=7) arba tirpiklis (fiziologinis tirpalas, ip, n=7) ​​buvo skiriamas kasdien 5 dienas, pradedant 1 dieną po insulto (žr. 2G pav.). Tada, praėjus 2 valandoms po paskutinės 2FL arba transporto priemonės injekcijos 5 dieną, gyvūnai buvo atskirai patalpinti į infraraudonųjų spindulių aktyvumo kameras 30 minučių. Atviro lauko lokomotorinis elgesys buvo tiriamas 30 min. Mes nustatėme, kad 2FL žymiai padidino vertikalųjį aktyvumą (VACTV, 2A pav.), bendrą nuvažiuotą atstumą (TOTDIST, 2B pav.), vertikalų laiką (VTIME, 2C pav.), horizontalųjį aktyvumą (HACTV, 2D pav.), judėjimo laiką (MOVTME, 2E pav. ) ir judėjimo numerį (MOVNO, 2F pav.). Išsami statistika (dvipusė ANOVA ir post hoc Newman-Keuls (NK) testai) yra pateikta 1 lentelėje.

2 pav. Vėlesnis gydymas 2FL pagerina ICH žiurkių nervų funkcijas. Suaugusios žiurkės buvo gydomos VII tipo kolagenaze D0 (G, laiko juosta). 2FL arba transporto priemonė buvo skiriama sistemingai kasdien 5 dienas. Lokomotorinis elgesys buvo tiriamas D5. 2FL žymiai pagerėjo (A) vertikalus aktyvumas, (B) bendras nuvažiuotas atstumas, (C) vertikalus laikas, (D) horizontalus aktyvumas, (E) judėjimo laikas ir (F) judėjimas

numerį. n {{0}} kiekvienoje grupėje. * p < 0.05,="" dvipusė="" anova;="" #="" p="">< 0,05,="" post="" hoc="" nk="">

1 lentelė. Reikšmingi lokomotorinio elgesio skirtumai tarp ICH plius veh ir ICH plus 2FL.

2.3. Ankstyvas gydymas su 2FL sumažinta mikroglijos aktyvacija pažeistame regione

Po elgesio testo 5 dieną aštuonios ICH žiurkės (2FL, n=4; Veh, n=4) buvo numarintos ir perfuzuotos IBA1 imunohistochemijai atlikti. Tipiškas IBA1-ir parodytas 3 paveiksle. IBA1-ir buvo sustiprintas peri-pažeistoje srityje striatumoje (3B pav.), palyginti su atitinkamomis vietomis priešingame nepažeistame striatum (3A pav.) insulto žiurkėms, gavusioms veh. Esant dideliam padidinimui, pažeistoje srityje buvo aptiktos deramifikuotos arba ameboidinės mikroglijos ląstelės (3B pav., intarpas), o ramybės būsenos mikroglijos, turinčios išsišakojusią morfologiją, buvo rastos nepažeistoje juostoje (3A pav., intarpas). Gydymas 2FL sumažino IBA{17}}ir ir iš dalies atkūrė morfologinę mikroglijos išsišakojimą (3C pav., intarpas). IBA1-ir buvo kiekybiškai įvertintas ir suvidurkintas trijose iš eilės smegenų dalyse, vizualizuojant visų gyvūnų priekinę komisiją. 2FL žymiai sumažino IBA1-arba ICH smegenyse (3D pav., p < 0.001,="" f2,="" 12="50.357," vienpusė="">

3 pav. Ankstyvas po gydymo 2FL sumažino mikroglijos aktyvaciją pažeistame striatum. Gyvūnai gavo nešiklio arba 2FL po kolagenazės injekcijos nuo 1 iki 5 dienų. Gyvūnai buvo paaukoti 5 dieną. Sustiprėjęs IBA1 imunoreaktyvumas su deramifikuota morfologija buvo nustatytas pažeistame striatum (B ir A). Gydymas 2FL sumažino IBA imunoreaktyvumą (C prieš B). (D) 2FL žymiai sumažino IBA1 imunoreaktyvumą pažeistose smegenyse. * p < 0.05,="" vienpusis="" anova="" ir="" nk="">

2.4. 2FL sumažinta CD4 ir limfocitų infiltracija į pažeistas smegenis

Kolagenazės skyrimas sustiprino CD4 ir limfocitų infiltraciją į pažeistą striaumą (4B pav.). Nepažeistame striatume beveik nebuvo rasta CD4 ląstelių (4A pav.). CD4 ląstelių įsiskverbimas į pažeistą striatumą buvo sumažintas gydant 2FL (4C pav., palyginti su 4B pav.; p < 0.001,="" f2,="" 6="173.485," vienpusė="" anova,="" 4d="">

4 pav. Po apdorojimo 2FL sumažėjo CD4 ir limfocitų infiltracija į pažeistas smegenis. Reprezentatyvios mikrofotografijos rodo CD4 imunoreaktyvumą (A) nepažeistoje juostoje ir (B) pažeistame striatumoje iš žiurkės, gavusios nešiklį mažu (kalibravimas=50 um) ir dideliu padidinimu (įterpimas, kalibravimas=10). um), taip pat (C) pažeistą striaumą iš žiurkės, gaunančios 2FL. (D) 2FL žymiai sumažino CD{{10}}ir pažeistose smegenyse (* p < 0,001,="">

būdas ANOVA).

2.5. 2FL skirtingai pakeitė M1 ir M2 uždegiminių žymenų raišką ICH smegenyse

Iš aštuonių žiurkių (veh, n {{0}}; 2FL, n=4) 5 dieną buvo paimti ruožo audiniai. M1/M2 uždegiminių žymenų ekspresija buvo ištirta qRT-PGR. ICH žymiai padidino M1 žymens CD86 (5A pav., p=0.005) ir M2 žymenų CD206 ir TGF (5B pav., C, p=0.005) raišką. 2FL nepakeitė CD86 išraiškos (5A pav., p=0.356, dvipusė ANOVA). Tačiau tai žymiai padidino CD206 (5B pav.) ir TGF ekspresiją pažeistoje pusėje (p < 0,05,="" nk="">

cistanche ekstrakto nauda

2.6. 2FL pakeitė ER streso ir apoptotinių žymenų išraišką ICH smegenyse

ER streso ir apoptotinių žymenų raiška buvo ištirta aštuonioms žiurkėms (veh, n=4; 2FL, n=4). 2FL žymiai sumažino PERK (6A pav., p=0.016), IRE1 (6B pav., p=0.018), CHOP (6C pav., p=0.032) ir SigmaR1 išraišką. (6D pav., p=0.017) pažeistame striatum. 2FL nepakeitė BIP (6E pav., p=0.841) ir ATF6 (6F pav., p=0.403) išraiškos. Be to, kaspazės3 ekspresija buvo žymiai sumažinta 2FL (6G pav., p=0.029, t-testas).

5 pav. 2FL padidino M2 žymenų ekspresiją ICH smegenyse. ICH žymiai padidino (A) M1 žymens CD86 ir M2 žymenų (B) CD206 ir (C) TGF (# p=0.005, dvipusis) raišką. ANOVA). (A) 2FL žymiai padidino (B) CD206 ir (C) TGF, bet ne (A) CD86 ekspresiją pažeistame striatum (* p < 0,05,="" nk="">

6 pav. 2FL slopino ER streso ir apoptotinių žymenų raišką. (A) PERK, (B) IRE1, (C) CHOP, (D) SigmaR1 ir (G) kaspazės3 ekspresija buvo reikšmingai slopinama 2FL hemoraginėse smegenyse. 2FL nepakeitė (E) BIP ir (F) ATF6 išraiškos. * p < 0.05.="" er,="" endoplazminis="" tinklas;="" perk,="" baltymų="" kinazės="" r="" tipo="" er="" kinazė;="" ire1,="" inozitolio="" reikalaujantis="" fermentas="" 1;="" chop,="" ccaat="" stipriklį="" surišantis="" baltymas="" homologinis="" baltymas;="" sigmar1,="" sigma="" 1="" receptorius;="" atf6,="" aktyvuojantis="" 6="" transkripcijos="">

cistanche papildas