2 dalis: Akteozidas slopina RANKL sukeltą osteooklastogenezę, slopindamas C-Fos indukciją ir NF-KB kelią bei silpnindamas ROS gamybą

Kontaktai: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 El. paštas:audrey.hu@wecistanche.com

Seung-Youp Lee1,2., Keun-Soo Lee3.¤, Sea Hyun Yi2., Sung-Ho Kook, Jeong-Chae Lee22,3*

Pls spustelėkite čia, grįžkite į 1 dalį

AkteozidasSlopina kaulų rezorbciją iš makrofagų Akteozidas taip pat užkirto kelią RANKL sąlygotai kaulų rezorbcijai priklausomai nuo dozės, matuojant in vitro modelio sistema (3A pav.). Kaulų rezorbcija buvo žymiai slopinama, kai BMM buvo inkubuojami su 1 mM akteozido (3B pav.). Gydymas 10 mM akteozidu beveik visiškai susilpnino RANKL sukeltą duobės susidarymą BMM. Panašiai, akteozidas sumažino kaulų rezorbciją RANKL stimuliuojamose RAW264.7 ląstelėse (S2A ir B pav.). Akteozido gebėjimas slopinti kaulų rezorbciją priklausė nuo gydymo laiko, palyginti su RANKL stimuliacija. Akteozidas (10 mM), pridėtas praėjus 4 dienoms po RANKL stimuliacijos, nesumažino duobutės susidarymo KMM, tuo tarpu slopino susidariusių osteoklastų skaičių (3C pav.). Šį skirtingą rezultatą iš dalies lėmė duobės plotas, susidaręs po 4 dienų RANKL stimuliacijos formavimosi (3D pav.).

CISTANCŲ EKSTRAKTAS

AkteozidasŽemyn reguliuojami ankstyvieji RANKL signalizacijos keliai

RANKL sukelia 3 gerai žinomų MAPK ir NF-kB aktyvavimą osteoklastų pirmtakuose, ir šis aktyvinimas reikalingas ankstyvam osteoklastų diferenciacijai. Suprasti galimus mechanizmus, kuriaisakteozidoslopina osteoklastogenezę, tyrėme poveikįakteozidoapie MAPK ir NF-kB aktyvavimą makrofaguose. BMM ir RAW264.7 ląstelės buvo iš anksto apdorotos 10 mM akteozidu 2 valandas, o po to stimuliuojamos 100 ng / ml RANKL 30 minučių. MAPK fosforilinimas buvo ištirtas Western blot ir imunometrine analize. RANKL sukėlė p38, ERK ir JNK fosforilinimą BMM (4A pav.) ir RAW264.7 ląstelėse (4B pav.). Akteozidas užkirto kelią šiems RANKL sukeltam p-p38, p-ERK ir p-JNK padidėjimui. Šis rezultatas buvo patvirtintas imunometrine analize, kuri, kad išankstinis apdorojimas 10 mM akteozidu reikšmingai slopino fosforilintų MAPK kiekį šiuose makrofaguose (4C pav.). Gydymas RANKL padidino NF-kB prisijungimą prie DNR, o akteozidas slopino RANKL sukeltą NF-kB-DNR prisijungimo aktyvaciją (5A pav.). Šis slopinimas buvo ryškesnis BMM nei RAW264.7 ląstelėse. Akteozidas taip pat sumažino RANKL stimuliuojamą p65 ir IkBa fosforilinimą BMM ir RAW264.7 ląstelėse (5B ir C pav.). 10 mM akteozido pridėjimas beveik visiškai slopino IkBa skaidymą ir aktyvavimą BMM (5B pav.). Siekiant dar labiau patvirtinti, kad NF-kB aktyvacija yra susijusi su akteozido veikimu, kB promotoriaus-luciferazės konstrukcijos buvo laikinai transfekuotos į RAW264.7 ląsteles. Ląstelės, inkubuotos su 100 ng/ml RANKL, turėjo 3- kartų didesnį kB promotoriaus aktyvumą, kurį žymiai susilpnino 10 mM akteozido (5D pav.).

AkteozidasSlopina uždegiminių citokinų gamybą ir TNF-a, c-Fos ir NFATc1 ekspresiją RANKL stimuliuojamuose makrofaguose TNF-a, IL-1b ir IL-6 yra svarbūs osteoklastų susidarymui ir funkcija, kurią tarpininkauja NF-kB signalizacija RANKL stimuliuojamuose makrofaguose. RANKL paskatino šių citokinų gamybą, ir ši gamyba buvo žymiai sumažinta 10 mM akteozido išankstiniu apdorojimu BMM (6A pav.). Panašiai akteozidas susilpnino RANKL sukeltą citokinų, išskyrus IL-6, gamybą RAW264.7 makrofaguose (S3 pav.). Norėdami suprasti molekulinius akteozido veikimo mechanizmus osteoklastogenezėje, toliau tyrėme akteozido poveikį TNF-a, c-Fos ir NFATc1 ekspresijai. RANKL padidino šių faktorių mRNR ekspresijos reguliavimą BMM ir RAW264.7 ląstelėse (6B ir C pav.). Išankstinis apdorojimas 10 mM akteozidu reikšmingai slopino RANKL sukeltą šių faktorių ekspresiją abiem atvejais.

BMM ir RAW264.7 ląstelės. Išankstinis gydymas akteozidu taip pat stipriai sumažino c-Fos ir NFATc1 baltymų kiekį RANKL stimuliuojamuose BMM (6D pav.). Šie rezultatai rodo, kad akteozidas sumažina RANKL indukuojančius osteoklastų susidarymo mediatorius genų ir baltymų lygiu.

CISTANCŲ EKSTRAKTAS: AKTEOZIDAS

Akteozidas sumažina tarpląstelinę ROS susidarymą BMM, priklausomai nuo dozės

Kadangi žinoma, kad tarpląstelinė ROS gamyba koreliuoja su RANKL stimuliuojama osteoklastogeneze, ištyrėme, ar akteozidas slopina ROS gamybą RANKL sukeltos osteoklastų diferenciacijos metu, naudojant ląstelėms pralaidų, oksidacijai jautrų dažiklį DCFH-DA. Srauto citometrijos analizė parodė, kad vidutinis fluorescencinis signalas, būdingas DCF BMM, po stimuliacijos RANKL buvo akivaizdžiai pasislinkęs į dešinę, palyginti su neapdorotomis kontrolinėmis ląstelėmis (7A pav.). Šis poslinkis buvo panašus į atvejį, kai po RANKL stimuliacijos buvo pastebėti RAW264.7 makrofagai (duomenys nerodomi). BMM gydymas akteozidu sumažino DCF signalo intensyvumą priklausomai nuo dozės. Išankstinis apdorojimas 10 mM akteozidu beveik visiškai sumažino tarpląstelinio ROS lygį, susidarantį osteoklastų diferenciacijos metu, iki neapdoroto kontrolinio lygio (7B pav.).

Geriamasis akteozido vartojimas slopina osteoporozės biocheminių žymenų pasikeitimą ir kaulų praradimą pelėms, iš kurių pašalintos kiaušidės

Norėdami ištirti akteozido poveikį kaulų retėjimui, parengėme osteoporozinio gyvūno modelį kiaušidžių pašalinimo būdu. Eksperimentiniu laikotarpiu reikšmingo kūno svorio skirtumo tarp OVX ir Sham pelių nebuvo (duomenys nerodomi). OVX grupė turėjo žymiai didesnį IL-1b ir IL-6 kiekį serume nei fiktyvi grupė (8 pav.). Kiaušidžių pašalinimo sukeltas šių uždegiminių citokinų padidėjimas buvo susilpnintas vartojant geriamąjį akteozidą (AC grupė). Kaulų apykaitos žymenų, tokių kaip ALP, kalcio, TRAP5b ir OC, kiekis serume buvo žymiai padidėjęs OVX grupėje. Iš šių osteoporozinių žymenų padidėjęs kalcio, TRAP5b ir OC kiekis OVX pelėse buvo akivaizdžiai slopinamas gydant akteozidu, o ALP koncentracija serume gydymo nepakito. Vidutinė maksimali lūžio apkrova iki dešiniojo šlaunikaulio vidurio buvo žymiai mažesnė OVX grupėje nei apgaulingoje grupėje (9A pav.). Gydymas akteozidu padidino maksimalų lūžių skaičių iki apgaulingos grupės. Kai šlaunikaulio žievės kaulas buvo išpjaustytas ir stebimas optine mikroskopija, OVX grupėje parodytos osteoporozės požymiai beveik visiškai išnyko AC pelėms (9B pav.). Siekiant patikrinti akteozido poveikį OVX sukeltos osteoporozės modeliui, mikro-KT buvo išanalizuoti KMT ir kaulų morfologiniai parametrai šviesaus proksimalinio šlaunikaulio trabekuliacijoje. Kaip parodyta 9C pav., OVX pelėms buvo rastas šlaunikaulio trabekulinės architektūros pakitimas, o šis pokytis buvo sumažintas gydant akteozidu. Mikro-KT analizės rezultatai atskleidė, kad OVX pelių KMT, kaulų stiprumo matas, labai sumažėjo (9D pav.). Palyginti su „Sham“ grupe, OVX pelėms taip pat buvo reikšmingų BV / TV, Tb pokyčių. Sp ir Tb. N, bet ne Tb.Th. OVX pelių gydymas geriamuoju akteozidu reikšmingai užkirto kelią KMT, taip pat BV/TV ir Tb.N pokyčiams.

Akteozidas neturi įtakos osteoblastogenezei kaulų čiulpų ląstelėse

Akteozido vaidmuo osteoblastinei diferenciacijai buvo toliau tiriamas naudojant kaulų čiulpų ląsteles. Kaip parodyta 10A pav., gydymas DAG padidino alizarinu raudonai nusidažytų ląstelių skaičių ir to nepakeitė išankstinis apdorojimas 10 mM akteozidu. Esamas dažų kiekis parodė, kad derinamas akteozidas irGydymas DAG mineralizacijos nepakeitė (10B pav.). Panašiai DAG sukeltas kaulams būdingų žymenų, tokių kaip Runx2, osterix, BSP ir OC, kalcio kiekio padidėjimas ląstelėse (10C pav.) ir mRNR lygis (10D pav.) nebuvo paveiktas išankstinio apdorojimo akteozidu.

cistanche akteozido poveikis

Diskusija

Kaulų remodeliavimą griežtai reguliuoja pusiausvyra tarp kaulų formavimosi osteoblastų ir kaulų rezorbcijos osteoklastų. Ilgalaikė ir per didelė kaulų rezorbcija sukelia skeleto apykaitos disbalansą, dėl kurio atsiranda kaulų rezorbcinių ligų. Norėdami ištirti akteozido poveikį osteoklastogenezei, naudojome du makrofagus, pirminės kultūros BMM ir RAW264.7 ląsteles.

Šios ląstelės buvo stimuliuojamos RANKL, kad diferencijuotųsi į osteoklastus, kai yra akteozido ir jo nėra. Pirmą kartą parodėme, kad akteozidas slopina osteoklastų diferenciaciją ir susidarymą. Pats akteozidas tirtomis koncentracijomis nesukėlė pirminių kultivuotų makrofagų gyvybingumo sumažėjimo tiek augimo, tiek diferenciacijos sąlygomis.

Gydymas akteozidu taip pat sumažino brandžių osteoklastų rezorbcijos aktyvumą. Šie rezultatai rodo, kad akteozidas slopina osteoklastų susidarymą iš makrofagų ir osteoklastų rezorbcijos aktyvumą. Mūsų kultūros sistemos, kurioje nebuvo osteoblastų ar stromos ląstelių, rezultatai taip pat rodo, kad akteozidas apsaugo nuo osteoklastų susidarymo, tiesiogiai veikdamas osteoklastų pirmtakus.

RANKL suaktyvina MAPK, įskaitant p38, ERK ir JNK. Šios trys kinazės dalyvauja ankstyvoje osteoklastų diferenciacijoje, todėl jų slopinimas farmakologiškai arba su dominuojančia neigiama JNK transfekcija slopina RANKL sukeltą osteoklastogenezę [29]. Mūsų rezultatai atskleidė, kad išankstinis gydymas akteozidu slopino visas šias kinazes, o tai rodo nespecifinį MAPK reguliavimą. Šis rezultatas iš dalies skyrėsi nuo ankstesnės ataskaitos, kad EGCG, pagrindinis žaliosios arbatos priešuždegiminis junginys, specialiai susilpnino JNK aktyvaciją, nepaveikdamas ERK ar p38 aktyvacijos RANKL stimuliuojamuose BMM [7]. Taip pat pranešta, kad paeonolis, priešuždegiminis junginys, gautas iš Kinijos žolės, slopina ERK ir p38, bet ne JNK, fosforilinimą RANKL stimuliuojamose RAW264.7 ląstelėse [30]. Priešingai, silibininas, naujas kaulų inhibitorius, susilpnino RANKL sukeltą p38, ERK ir JNK aktyvaciją [31]. Šie radiniai rodo, kad antirezorbcinių junginių poveikis MAPK aktyvacijai RANKL priklauso nuo junginio, nors visi trys MAPK dalyvauja ankstyvoje osteoklastogenezėje.

Atsižvelgiant į pastebėjimą, kad akteozidas susilpnino p-JNK

RANKL stimuliuojamų BMM lygiai, net esant 1 mM, JNK blokada, o ne p38 MAPK ar ERK, buvo specifiškesnis akteozido sukeltos anti-osteoklastogenezės įvykis ląstelėse. Nors tos pačios koncentracijos akteozidas nesumažino osteoklastų skaičiaus KMM, gydant akteozidu žymiai sumažėjo duobių susidarymas. Taip pat nustatėme, kad išankstinis gydymas SP600125, JNK specifiniu farmakologiniu inhibitoriumi, smarkiai užkirto kelią osteoklastų susidarymui (duomenys nerodomi). Visi šie radiniai rodo, kad JNK sukeltas signalizavimas yra glaudžiai susijęs su akteozido sukeltu osteoklastogenezės slopinimu, kurį skatina RANKL.

NF-kB signalizacija reguliuoja ląstelių įvykius, įskaitant apoptozę, ląstelių ciklo progresavimą, ląstelių adheziją, citokinų gamybą ir išgyvenimą makrofaguose [32]. NF-kB signalizacija taip pat reikalinga osteoklastų vystymuisi, o tai buvo įrodyta osteopetrozės atsiradimu NF-kB išmuštoms pelėms [33, 34]. Todėl siūloma, kad NF-kB slopinimas būtų veiksmingas antirezorbcinių agentų taikinys, siekiant sumažinti osteoklastų aktyvumą ir gydyti osteoporozę. NF-kB pošeimos baltymų modifikavimas po transliacijos yra labai svarbus moduliuojant NF-kB aktyvumą. Ypač p65 subvieneto ir IkB kinazės fosforilinimas yra labai svarbus, kad NF-kB sukeltų osteoklastogenezę [7]. Mūsų dabartiniai rezultatai parodė, kad RANKL stimuliacija padidino NF-kB surišimo su DNR aktyvumą ir p65 subvieneto bei IkBa fosforilinimą tiek BMM, tiek RAW264.7 ląstelėse. Išankstinis gydymas akteozidu slopino šiuos RANKL sukeltus padidėjimus, todėl sumažėjo NF-kB aktyvumas. Todėl šie rezultatai rodo, kad, be MAPK, NF-kB signalizacija yra pagrindinis akteozido taikinys, slopinantis osteoklastų diferenciaciją ir susidarymą iš RANKL stimuliuojamų makrofagų.

Be NF-kB signalizacijos, c-Fos/c-Jun/NFATc1 kelias atlieka pagrindinį vaidmenį osteoklastų vystymesi, todėl šių baltymų trūkumas gali sustabdyti osteoklastogenezę [35, 36]. Šiame tyrime mes nustatėme, kad akteozidas užkirto kelią RANKL sukeltai c-Fos ir NFATc1 ekspresijai mRNR ir baltymų lygiais. JNK yra prieš srovę esanti c-Jun kinazė, reikalinga NFATc1 ekspresijai ir osteoklastogenezei reaguojant į RANKL [29].

JNK/c-Jun kelio blokavimas šiukšlių inhibitoriumi sumažino RANKL sukeltą osteoklastų susidarymą ir c-Fos bei NFATc1 ekspresiją [7]. Mūsų rezultatai ir ankstesni išvados rodo, kad JNK tarpininkaujamo signalizacijos slopinimas akteozidu yra glaudžiai susijęs su RANKL tarpininkaujamų c-Fos ir NFATc1 prevencija.ekspresija, kuri slopina osteoklastų diferenciaciją makrofaguose. Akteozido poveikio BMM ir RAW264.7 ląstelėms skirtumus bent iš dalies lemia jautrumo JNK slopinimui skirtumai.

TNF-a gali sukelti osteoklastogenezę nepriklausomai nuo RANKL-RANK signalizacijos [37]. IL-1 yra stiprus patologinio kaulų sunaikinimo, kurį sukelia estrogenų trūkumas arba uždegimas, tarpininkas [7]. I tipo IL-1 receptorių arba IL-1 signalų perdavimo sutrikimas gali pakeisti kaulų retėjimą, kurį sukelia kiaušidžių pašalinimas [38] arba reumatoidinis artritas [39]. Šis tyrimas parodė, kad akteozidas gali sumažinti uždegiminių citokinų, tokių kaip TNF-a, IL- 1b ir IL-6, gamybą makrofaguose. Manoma, kad akteozidas slopina uždegiminių citokinų gamybą, slopindamas p38 kinazę ir ERK signalizaciją, nes suaktyvinti ERK1/2, p38 MAPK arba abu yra reikalingi lipopolisacharidų sukeltai šių citokinų gamybai makrofaguose [40, 41]. Taip pat buvo pranešta, kad liuteolinas, uždegiminis junginys, slopina uždegiminių mediatorių gamybą, slopindamas p38 MAPK aktyvaciją [42]. Šiame tyrime taip pat nustatėme, kad akteozidas susilpnino kaulų nykimą pelėms, iš kurių buvo pašalintos kiaušidės, o tai rodo atkurta maksimali lūžio jėga dešiniojo šlaunikaulio viduryje ir osteoporozinio žievės kaulo išnykimas. Geriamasis akteozido vartojimas sumažino kiaušidžių pašalinimo sukeltą IL-1b ir IL-6 koncentracijos padidėjimą serume, bet ne ALP. Padidėjęs kalcio, TRAP ir OC kiekis serume OVX taip pat buvo slopinamas geriamuoju akteozidu, o tai rodo, kad akteozidas susilpnina kaulų formavimuisi ir rezorbcijai būdingų biomarkerių pokyčius. Kadangi osteoporozei būdingas sumažėjęs masės tankis ir pablogėjusi trabekulinio kaulo mikroarchitektūra, OVX sukeltas trabekulinio kaulo nykimas ir morfometrinių parametrų pokyčiai buvo reikšmingai slopinami vartojant geriamąjį akteozidą. Šie atradimai rodo, kad akteozidas gali būti naudojamas kaip antirezorbcinis agentas osteoporozei gydyti, panaikinant nesubalansuotą osteoklastų aktyvaciją. Tačiau osteoblastai yra pagrindinis veiksnys, atsakingas už naujų kaulų formavimąsi. Taigi, norint sustiprinti kaulų formavimąsi, reikalingas agentas, galintis padidinti osteoblastų proliferaciją arba diferenciaciją [30]. Priešingai, mes nustatėme, kad akteozidas neturėjo įtakos osteoblastų diferenciacijai ar mineralizacijai DAG apdorotose kaulų čiulpų ląstelėse. Apibendrinant, mūsų rezultatai rodo, kad akteozidas turi antirezorbcinį poveikį, bet neturi tiesioginės įtakos kaulų formavimuisi. Norint išsiaiškinti, ar akteozidas naudingas osteoblastogenezei, reikalingi išsamesni eksperimentai, analizuojantys kaulams būdingus parametrus in vivo ir in vitro.

Šiame tyrime pabrėžiamas slopinantis akteozido poveikis osteoklastų diferenciacijai ir kaulų rezorbcijai, slopindamas MAPK ir kelis transkripcijos veiksnius, tokius kaip NF-kB, c-Fos ir NFATc1. Duomenys rodo du galimus mechanizmus, kuriais akteozidas turi šios naudos.

CISTANCĖS ECHINAKOZIDAS IR AKTEOZIDAS GALI gydyti osteoporozę

Nuorodos

1. RhoJ, Takami M, Choi Y (2004) Osteoimunologija: imuninės ir skeleto sistemų sąveika. Molekulės ir ląstelės 17: 1–9.

2. Del Fattore A, Capannolo M, Rucci N (2010) Kaulai ir kaulų čiulpai: tas pats organas. Biochemijos archyvas Biofizika 503: 28–34.

3. Rachner TD, Khosla S, Hofbauer LC (2011) Osteoporozė: dabar ir ateitis. Lancet 377: 1276–1287.

4. Sturge J, Caley MP, Waxman J (2011) Kaulų metastazės sergant prostatos vėžiu: atsirandančios terapinės strategijos. Nature Reviews Clinical Oncology 8: 357–368.

5. Goltzman D (2002) Atradimai, vaistai ir skeleto sutrikimai. Nature Reviews Drug Discovery 1: 784–796.

6. Rodan GA, Martin TJ (2002) Terapiniai požiūriai į kaulų ligas. Mokslas 289: 1508–1514.

7. Lee JH, Jin H, Shim HE, Kim HN, Ha H ir kt. (2010) Epigallocatechin-3- galatas slopina osteoklastogenezę, sumažindamas c-Fos ekspresiją ir slopindamas branduolinio faktoriaus-kappaB signalą. Molekulinė farmakologija 77: 17–25.

8. Kim HN, Lee JH, Jin WJ, Ko S, Jung K ir kt. (2012) MS-275, benzamido histono deacetilazės inhibitorius, užkerta kelią osteoklastogenezei, sumažindamas c-Fos ekspresiją ir slopina pelių kaulų retėjimą. European Journal of Pharmacology 691: 69–76.

9. Kim T, Ha H, Shim KS, Cho WK, MaJY (2013) Yijung-tang anti-osteoporozinis poveikis žiurkės modeliui, kuriam atlikta pašalinta kiaušialąstė, sąlygojamas osteoklastų diferenciacijos slopinimo. Etnofarmakologijos žurnalas 146: 83–89.

10. Nakanishi A, Litsuka N, Tsukamoto J (2013) Žuvų taukai slopina kaulų rezorbciją slopindami osteoklastogenezę dėl sumažėjusio M-CSF, PU.1, MITF ir RANK ekspresijos žiurkių kiaušidėse. Molekulinės medicinos ataskaitos 7: 1896–1903.

11. Bar-Shavit Z (2007) Osteoklastas: daugiabranduolė, hematopoetinės kilmės, kaulus rezorbuojanti osteoimuninė ląstelė. Journal of Cellular Biochemistry 102: 1130–1139.

12. Takahashi N, Maeda K, Ishihara A, Uehara S, Kobayashi Y (2011) Osteoklastogenezės reguliavimo mechanizmas RANKL ir Wnt signalais. Bioscience sienos 16: 21–30.