2 dalis: Kalpastatinas apsaugo nuo angiotenzino I sukelto podocitų pažeidimo, palaikydamas autofagiją

Kontaktas:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791

Pls spustelėkite čia, kad pamatytumėte 1 dalį

Pls spustelėkite čia, kad pamatytumėte 3 dalį

Angel plus HSD aktyvina kalpaino aktyvumą podocituose, kurie prisideda prie autofagijos blokados

Kadangi buvo nustatyta, kad Angelas suaktyvina kalpaino aktyvumą keliuose ląstelių tipuose ir ii) suskaido kelis su autofagija susijusius baltymus, susimąstėme, ar AngII ir HSD sukelta autofagijos blokada gali būti siejama su padidėjusiu Anglo sukeltu kalpaino aktyvumu. Pirmiausia nustatėme, kad pirminiai podocitai išreiškė 3 visur esančias kalpainų formas (3a pav.). Tada parodėme, kad AngII stimuliavo kalpaino aktyvumą pirminiuose podocituose. Šį kalpaino aktyvumo padidėjimą blokavo selektyvus kalpaino inhibitorius (3b pav.). Norėdami įvertinti kalpainų vaidmenį AngII ir HSD tarpininkaujamoje sistemoje, naudojome pelę su papildoma kalpastatino transgeno ekspresija (dėl to sumažėja kalpaino aktyvumas).inkstassužalojimasir autofagijos blokada. Pirminiai CST'g pelių podocitai, reaguodami į AngII, parodė sumažėjusį kalpaino aktyvumą, palyginti su kontrolinių pelių podocitais (3c pav.). Taigi, per didelis kalpastatino ekspresija podocituose sumažino AngII sukeltą kalpaino aktyvaciją.

Cistanchekanalėliųturi daugefektai, spustelėkite čia norėdami sužinoti daugiau

Toliau įvertinome autofagijos lygį podocituose iš CSTTg pelių. Sukūrėme CST peles su GFP-LC3 transgenu. LC3-GFP reporteris leido skaičiuoti autofagosomas kaip GFP plius /P62 plius taškus. Kai autofaginis srautas blokuojamas, P62 kaupsis agregatuose ląstelėse. Esant bazinei būsenai, suskaičiavome mažiau GFP plius P62 plius taškų (4a, b ir e paveikslai) ir mažiau P62 kaupimosi (4c, d ir f pav.) CST1g GFP-LC3 pelių podocituose nei normalių podocitų.

4 paveikslas|Autofaginio srauto įvertinimas kalpastatino transgeninių (CST9) pelių podocituose. (a, b) Tipiniai imunofluorescenciniai vaizdai, rodantys žalio fluorescencinio baltymo (GFP) (žalia) ir P62 (raudona) ekspresiją glomeruluose iš 12-savaičių senumo GFP-LC3 ir CST'GFP-LC3 pelių. Rodyklės rodo GFP plius P62 plius autofagosomas. (c, d) reprezentatyvūs imunofluorescenciniai P62 (žalia) ir Podocalyxin (PODXL; raudona) ekspresijos vaizdai glomeruluose iš 12-savaičių senumo GFP-LC3 ir CST'9 GFP-LC3 pelių. Paveikslų poskyriai su pirminiais ženklais rodo didesnį padidinimą. Branduoliai buvo nudažyti Hoechst (mėlyna) spalva. Strypai=50 μm. (e) LC3 ir P62 plius taškų viename podocite kiekybinis įvertinimas. Mann-Whitney testas:**P=0.0065. f) P62 plius ploto glomerulų skyriuje kiekybinis įvertinimas. Mann-Whitney testas:*P= 0.0420.In(e,f), n =5 GFP-LC3 pelių ir n =8 CST'9 GFP-LC3 pelių. Pateikiamos reikšmės kaip atskiri sklypai ir vidurkis± SEM. Norėdami optimizuoti šio vaizdo peržiūrą, žr. šio straipsnio internetinę versiją GFP-LC3 pelėms, siūlančią padidėjusį autofaginį srautą pelių, kuriose yra daug kalpastatino, podocituose.

Autofaginis srautas gali būti stebimas matuojant citoplazminės LC3, LC3-I formos konversiją į autofagosomiškai suskaidytą ir su fosfatidiletanolaminu susietą LC3, LC3-II formą, Western blot metodu. . CST pelių podocitai padidino LC3-I konversiją į LC3-II ir sumažino P62 ekspresiją tiek esant bafilomicinui A, tiek jo nesant (5a ir b pav.), o tai rodo padidėjusį autofaginį srautą. podocituose su per dideliu kalpastatino ekspresija. Galiausiai, GFP plius P62 plius taškų kaupimasis podocituose po chlorokvino vartojimo buvo svarbesnis CST'g GFP-LC3 pelėms nei GFP-LC3 pelėms, taip patvirtinant, kad per didelė kalpastatino ekspresija sukelia autofaginį srautą podocituose in vivo (5c pav. -e). Apskritai, mūsų duomenys rodo, kad AngII stimuliuoja kalpaino aktyvumą podocituose, kad autofagiją slopina kalpainas podocituose ir kad endogeninio kalpaino aktyvumo slopinimas dėl per didelio kalpastatino ekspresijos yra pakankamas, kad būtų skatinamas autofaginis srautas podocituose.

CSTT9 pelės yra apsaugotos nuo Angel ir HSD sukelto podocitų pažeidimo

CSTT: pelėms nieko nebuvoinkstaspakeitimas iki mažiausiai 12 mėnesių amžiaus (papildomas S5 paveikslas). AngII ir HSD gydymo metu analizavome podocitų pažeidimus CST'号 pelėse. Nors WT pelėms po 4 savaičių hipertenzijos išsivystė lengva glomerulosklerozė ir podocitų pažeidimas, kaip rodo nenormali podokaliksino ir nefrino ekspresija, CSTTg pelėms buvo mažiau sklerozinių glomerulų pažeidimų (6a pav.

5 pav. Autofagosomų degradacijos blokavimas patvirtino padidėjusį podocitų autofaginį srautą kalpastatino transgeninėse (CSTT) pelėse.(a) LC3 ekspresijos Western blot analizė. 1 sekvestosoma (SOSTM1)/P62 ir ATG5 pirminiuose podocituose iš laukinio tipo (W arba CST'9 pelių. Tubulino ekspresija yra normalizuojama. Podocitai buvo gydomi arba negydomi bafilomicinu A1 (BafA1; 100 nM) 4 valandas prieš kultūrą b) LC3-ll/'tubulino ir P62/tubulino santykio kiekybinis nustatymas.n=10 WT pelių ir n =8 CST'9 pelių. Vertės pateikiamos kaip atskiros diagramos ir vidurkis ± SEM. Dviejų krypčių dispersijos analizė, suporuota gydymui: LC3-ll/tubulinas: genotipas, P= 0.0008;gydymas, P<0.0001; for="" p62/tubulin:="" genotype,="" p="0.0884;" treatment,="">< 0.0001.sidak's="" multiple="" comparison="" test:="" for=""><0.0001 for="" wt-bafa1="" versus="" wt+=""><0.0001 for="" cst'9-bafa1="" versus="" cst'9+bafa1,"*p="0.0028" for="" wt+bafa1="" versus="" cstt9="" +bafa1:for=""><0.0001 for="" wt-bafa1="" versus=""><0.0001 for="" cst'9-bafa1="" versus="" cst'9+="" bafa1.(c,d)representative="" immunofluorescence="" images="" of="" the="" expression="" of="" green="" fluorescent="" protein="" (gfp;="" green)="" and="" p62="" (red)="" in="" glomeruli="" from="" 12-week-old="" gfp-lc3="" and="" cst'9="" gfp-lc3="" mice.="" figure="" subparts="" with="" prime="" indicate="" higher="" magnification.="" nuclei="" were="" stained="" with="" hoechst="" （blue）.="" bars="50" μm.="" mice="" were="" treated="" with="" chloroquine（cq;="" 80="" mg/kg）="" 4="" hours="" before="" killing.="" the="" arrowheads="" indicate="" gfp+="" p62+autophagosomes.="" (e)="" quantification="" of="" the="" number="" of="" lc3+="" p62+="" dots="" per="" podocyte.="" n="5" mice="" per="" genotype.="" values="" are="" presented="" as="" individual="" plots="" and="" mean="" ±="" sem.="" unpaired="" t-test="" with="" equal="" sd:*p="0.0302." to="" optimize="" viewing="" of="" this="" image,="" please="" see="" the="" online="" version="" of="" this="" article="" at="">inkstas-international.org.

6 pav.| Per didelis kalpastatino ekspresija apsaugo nuo angiotenzino II (Angel) ir daug druskos turinčios dietos (HSD) sukelto podocitų pažeidimo. (a, b)

Cistanchegali palengvintiinkstų liga

Reprezentatyvūs Massono trichromu nudažytų glomerulų atkarpų vaizdai iš laukinio tipo (WT ir kalpastatino transgeninių (CST'9) pelių po 6 savaičių Angll ir HSD.Bars=50 um.(c,d,f,g) Reprezentatyvūs (c,d)podokaliksino (PODXL) ir (f,g)nefrino (NPHS1) ekspresijos imunofluorescenciniai vaizdai WT ir CST'9 pelėse po 6 savaičių Angel plius HSD ir (e,h) susijusių kiekybinių įvertinimų. {8}} um. (ii)

cistanchegali gydytiūminis inkstų nepakankamumas

Tipiški imunofluorescenciniai Wilm's Tumor 1 (WT1; žalia) ir PODXL (raudona) ekspresijos vaizdai WT ir CST pelių glomeruluose po 6 savaičių Angel plus HSD ir (k) susijęs WT1 plius ląstelių skaičiaus glomeruluose kiekybinis įvertinimas skyrius. Branduoliai buvo nudažyti Hoechst (mėlyna). Juostos =50 um. (e,h,k) reikšmės pateikiamos kaip atskiros diagramos ir vidurkis ± SEM,n =9 WT pelių ir n=7 CSTTg pelių. Nesuporuotas t testas su vienodu SD:**P =0.0095 in (e),*P=0.0249 in (h), P=0.7891 in (k).

ir b) ir išsaugota podokaliksino ir nefrino ekspresija (6c-h pav.). Tokie podocitų fenotipo skirtumai buvo pastebėti stadijoje, kai WT ir hipertenzinių CST'g pelių podocitų branduolių tankis nesiskyrė (6i-k pav.).

Panašiai, po 6 savaičių hipertenzijos, GFP-LC3 ir CST'1 GFP-LC3 pelėms buvo podocitų pažeidimas, tačiau pažeidimai buvo ryškesni GFP-LC3 pelėms (7 pav.). Albumino ir kreatinino santykis šlapime buvo didesnis GFP-LC3 pelėms po 4 savaičių AnglI ir HSD (7a pav.). Podocitų skaičius tarp 2 genotipų nesiskyrė, tačiau nefrino ekspresija buvo žymiai labiau sumažėjusi GFP-LC3 (kontrolinės) pelėse (7b-e pav.). Koreliuojant su kalpastatino sukelta apsauga, ultrastruktūrinė analizė parodė nedidelį ir židininį podocitų pėdos proceso išnykimą GFP-LC3 pelėse, gydytose Angl plus HSD, geriau išsaugant pėdos proceso išbėrimą CST'g pelėms, nors bendras kiekybinis podocitų skaičiaus įvertinimas. pėdos procesai pagal glomerulų bazinės membranos (GBM) ilgį statistiškai nesiskyrė, greičiausiai todėl, kad mūsų modelyje podocitų pažeidimas yra židininis ir segmentinis (7f-h pav.). Pažymėtina, kad makrofagų ir T-limfocitų infiltracijainkstusgrupėse nesiskyrė (papildomas S6 paveikslas). Kartu šie rezultatai parodė, kad kalpastatinas užkirto kelią AngII ir HSD sukeltam podocitų pažeidimui.

Per didelis kalpastatino ekspresija atkuria autofaginį srautą podocituose iš pelių po gydymo Angel ir HSD

Galiausiai susimąstėme, ar kalpastatino sukelta glomerulų apsauga AngII plius HSD modelyje turėjo įtakos podocitų autofagijos palaikymui. Įdomu tai, kad AnglI ir HSD sukeltas P62 kaupimasis podocituose buvo užkirstas kelias CSTTg ir GFP-LC3 CST'g pelėms (8a–d pav.), o tai rodo, kad kalpastatinas neleido blokuoti podocitų autofagijos. Pažymėtina, kad autofagosomų GFP plius P62 plius taškų skaičius buvo panašus podocituose iš hipertenzija sergančių GFP-LC3 ir GFP-LC3 CST pelių, o tai rodo, kad AnglI ir HSD sukėlė podocitų autofaginio srauto sulėtėjimą, o ne visišką sustojimą. (8e-g pav.).

Kalpaino skilimo vietos in silico prognozė podocitų baltymuose

Mes panaudojome keletą in silico įrankių, kad galėtume numatyti galimus kalpaino taikinius podocituose (papildomos lentelės S1 ir S2). Buvo palygintos trys internetinės duomenų bazės: GPS-CCD, 4CaMPDB, 5 ir DeepCalpain. In silico analizė nustatė keletą podocitų baltymų, tarp jų nefriną ir podociną, kuriuos galėjo skaidyti kalpainai. Taigi, kalpastatino sukelta glomerulų apsauga gali būti susieta su kalpaino fermentinio aktyvumo sumažėjimu, dėl kurio sumažėja kai kurių podocitų baltymų skaidymas.

Be to, mažiausiai 3 su autofagija susiję baltymai yra tiesioginiai kalpainų taikiniai. ATG5 skaido kalpainai, todėl sutrinka ATG12-ATG5 komplekso susidarymas.57 Kalpaino inhibitorių skyrimas in vivo taip pat užkirto kelią autofagijos baltymo Beclin-1 skilimui.5"In silico analizė numanoma su autofagija susijusių baltymų skilimo vieta patvirtina hipotezę, kad kalpainas gali reguliuoti autofagiją per fermentinį autofagijos baltymų skilimą.

Endoplazminio tinklo (ER) mRNR ekspresija ir oksidacinio streso žymenys glomeruluose iš pelių, gydytų Angll ir HSD

Kiekybiniu PGR glomeruluose įvertinome endoplazminio tinklo (ER) stresą ir oksidacinį stresą gydymo AngII ir HSD metu (1 lentelė). Pradiniame etape mes nepastebėjome jokių analizuotų genų mRNR ekspresijos pokyčių glomerulų5loxlox pelėse (papildomas WT ir Nphs2.cre Atg5 S7 paveikslas). Po 6 savaičių hipertenzijos, glomerulai iš Nphs2. cre Atg5loxlox pelėms buvo skirtingi ER streso ir oksidacinio streso takų genų mRNR profiliai su padidėjusia Sod1, Prdxl, Atf4, Gpxl ir Hsp90b1 ekspresija, palyginti su WT glomerulais, o tai rodo, kad autofagijos išeikvojimas podocituose buvo palankus AngII ir HSD indukuotai. ER stresas ir oksidacinis stresas. Ir atvirkščiai, CST pelių glomeruluose sumažėjo kelių ER streso ir oksidacinio streso takų genų reguliavimas, taip pat sumažėjo kai kurių proapoptotinių genų ekspresija (9 pav.).

Visi šie rezultatai rodo, kad per didelė kalpastatino ekspresija gali užkirsti kelią glomerulų pažeidimui, sumažindama AngII ir HSD sukeltą ER ir oksidacinį stresą.

DISKUSIJA

Šiame tyrime parodėme, kad sergant AngII ir HSD sukelta hipertenzija, podocitų autofagija yra žymiai sumažinta. Be to, pelėms, kurių podocitams būdingas Atg5 ištrynimas, buvo labiau linkę į AngI ir HSD sukeltą glomerulosklerozę ir podocitų praradimą, taip parodydamos, kad podocitų autofagija neleidžia vystytis hipertenzinei nefropatijai, pabrėžiant kritinį autofagijos vaidmenį Angl plus HSD sukeltame podocite. sužalojimas. Mažai žinoma apie tarpląstelinius dirgiklius, reguliuojančius ląstelių autofagiją, ir šie rezultatai atskleidžia AngII patofiziologinį podocitų autofagijos reguliavimą.

Daugumos žmogaus glomerulopatijų atveju podocitų pėdos procesų išnykimas yra glomerulų pažeidimo, sukeliančio proteinuriją, požymis. Tikėtina, kad autofagija vaidins esminį vaidmenį palaikant podocitų funkciją, nes šios galutinai diferencijuotos ląstelės pasižymi dideliu autofagijos lygiu net ir nesant streso. Ankstesnis tyrimas parodė, kad Angi skatina autofagiją generuodamas reaktyviąsias deguonies rūšis sąlyginai įamžintoje pelių podocitų ląstelių linijoje.5 Reaktyviųjų deguonies rūšių gamyba iš tiesų yra bendras autofagijos induktorius daugelyje ląstelių tipų ir tokio neatitikimo su mūsų ląstelėmis priežastys. išvados neaiškios. Skirtingai nuo pastarojo tyrimo, mes naudojome pelių pirminius kultivuotus podocitus, išlaikančius podocino ir nefrino ekspresiją ir in vivo metodus, o ne pelių ląstelių linijas. Patvirtiname ankstesnius pranešimus, kad postmitoziniai podocitai pasižymi neįprastai aukštu konstitucinės autofagijos lygiu. Norint nustatyti padidėjusį LC3-II kiekį po AngII stimuliacijos, kai yra arba nėra lizosomų inhibitorių, būtina išmatuoti

ar autofaginis srautas yra padidėjęs ar užblokuotas. Ankstesni tyrimai nepaisė šio reiškinio.

Čia mes naudojome hipertenzinį modelį, pagrįstą AnglI perfuzija ir HSD. Podocitai turi ATI receptorius ir yra veikiami laisvų filtruotų peptidų, tokių kaip AngII1,6,26,61-6 Manoma, kad pastebėtas renoprotekcinis RAAS slopinimo poveikis gali būti (bent iš dalies) dėl šio podocito blokados. -specifinis RAAS. Taip pat in vivo tyrimai

Cistanchegali palengvintiinkstų liga