2 DALIS: Cistanche Deserticola polisacharidas slopina OVX sukeltą kaulų nykimą pelėms ir RANKL sukeltą osteoklastogenezę

Kontaktas:joanna.jia@wecistanche.com

Osteoporozė yra rimta kaulų liga, paveikianti senstančius žmones. Įrodyta, kad Kinijoje plačiai naudojamas tonizuojantis ir gydomasis maistas Cistanche deserticola (CD) veiksmingai gydo osteoporozę.Cistanche deserticola polisacharidas(CDP), išgautas iš CD, pasižymi įvairiomis farmakologinėmis savybėmis, tačiau jo vaidmuo osteoklastų formavimuisi ir funkcijoms, taip pat osteoporozei, lieka nežinomas. Šio tyrimo tikslas buvo išgauti ir išvalyti CDP.(Cistanche deserticola polisacharidas)toliau tirti galimą jo poveikio osteoporozei mechanizmą. Rezultatai parodė, kad CDP(Cistanche deserticola polisacharidas) gydymas užkirto kelią OVX sukeltai osteoporozei ir sumažino kaulų retėjimą slopindamas osteoklastų aktyvumą ir funkciją. Be to, CDP(Cistanche deserticola polisacharidas)gydymas reikšmingai slopino RANKL sukeltą osteoklastogenezę. kaulų rezorbcija ir osteoklastams būdinga genų ekspresija. Mechaniškai, CDP(Cistanche deserticola polisacharidas)slopino RANKL sukeltą NF-xB ir MAPK signalizacijos kelių aktyvavimą ir atitinkamai paveikė pasroviui esantį NEATc1 aktyvavimą. Šio tyrimo išvados rodo, kad CDP(Cistanche deserticola polisacharidas)yra potencialiai saugus vaistas osteoporozei gydyti.

Osteoporozės gydymas: Cistanche Deserticola polisacharidas

SPAUSKITE ČIA, KAD LOKITE PRAT 1

3. Rezultatai

3.1. CDP(Cistanche deserticola polisacharidas)apsaugo nuo OVX sukelto kaulų retėjimo in vivo

CDP poveikiui ištirti panaudojome OVX sukeltą osteoporozės pelės modelį(Cistanche deserticola polisacharidas)osteoporozės gydymas in vivo. Palyginti su „Sham“ grupe, OVX pelių kūno svoris žymiai padidėjo, o gimdos indeksas sumažėjo, o tai rodo, kad osteoporozės modelis buvo sukurtas sėkmingai (1B ir D pav.). blauzdikaulio mikro-KT analizė OVX grupėje parodė didelį kaulų retėjimą. Palyginti su OVX grupe, kaulų trabekulių skaičius padidėjo CDP-L grupėje, o CDP-H ir E2 grupių padidėjimas buvo reikšmingesnis, o pastarųjų dviejų grupių trabekulės tapo stambesnės, o tarpas sumažėjo. Kiekybinė analizė patvirtino, kad keletas kaulų histomorfometrinių parametrų, įskaitant KMT, BV/TV, BS/TV ir Tb. N vertės žymiai padidėjo, o Tb. Sp rodė sumažėjusias CDP-H grupės vertes (1E ir F pav.). Histopatologinis tyrimas naudojant H&E dažymą atskleidė, kad kaulų trabekulių skaičius CDP-H ir E2 grupėse buvo žymiai didesnis nei OVX grupėje, o CDP-L grupėje reikšmingo pagerėjimo nebuvo (1G pav.). Be to, TRAcP dažymas parodė, kad osteoklastų skaičius žymiai padidėjo OVX grupėje, bet sumažėjo CDP-H ir E2 grupėse (1H pav.). CDP-L, CDP-H ir E2 grupės parodė, kad slopino OVX sukeltą P kiekio padidėjimą, bet padidino Ca kiekį kraujo serume. Kaulų absorbcijos žymenys RANKL ir TRAcP{18}}b parodė CDP-L mažėjimo tendenciją.

3.2. CDP(Cistanche deserticola polisacharidas) slopina RANKL sukeltą osteoklastogenezę in vitro

Stebėjome ląstelių proliferacijąCDP- apdoroti BMM naudojant ilgalaikį realaus laiko dinaminį gyvų ląstelių vaizdo analizatorių. Palyginti su kontroline grupe, ląstelių susiliejimasCDP-gydytų grupių dozės nepakito<10 µg/ml,="" but="" was="" significantly="" reduced="" at="" the="" 20="" and="" 40="" µg/ml="" dosages="" (fig.="" 2a).="" to="" investigate="" the="" effect="" of="">CDP(Cistanche deserticola polisacharidas)RANKL sukeltos osteoklastogenezės metu BMM buvo stimuliuojami RANKL ir M-CSF, dalyvaujantCDPfor 7 days. TRAcP, a characteristic enzyme of osteoclasts, is considered an indicator of osteoclast function (Minkin, 1982). TRAcP staining showed that the osteoclasts treated with>1,25 µg/mlCDP(Cistanche deserticola polisacharidas)parodė žymiai sumažėjusį dydį ir skaičių. Šie rezultatai parodė, kad CDP(Cistanche deserticola polisacharidas)veiksmingai slopino numatomą RANKL sukeltą osteoklastogenezę, nepaveikdamas ląstelių gyvybingumo.

3.3. CDP(Cistanche deserticola polisacharidas)slopina RANKL sukeltą osteoklastinės rezorbcijos aktyvumą ir osteoklastams būdingą genų ekspresiją

Toliau nustatėme CDP poveikį(Cistanche deserticola polisacharidas)osteoklastų kaulų rezorbcijos aktyvumo gydymas naudojant hidroksiapatitu padengtas plokšteles. Kaulų rezorbcija yra pagrindinė funkcija ir standartas matuojant osteoklastų aktyvumą ir gebėjimą (Novack & Faccio, 2011). Rezultatai parodė, kad CDP(Cistanche deserticola polisacharidas)gali žymiai sumažinti kaulų rezorbcinį osteoklastų plotą priklausomai nuo dozės, o tai rodo, kad CDP(Cistanche deserticola polisacharidas)slopino RANKL sukeltą kaulų rezorbcijos aktyvumą (3A ir B pav.). Visų pirma, po gydymo 10 µg/mL CDP osteoklastinis kaulų rezorbcinis plotas sumažėjo iki maždaug 6,3 proc.(Cistanche deserticola polisacharidas). Norėdami geriau išsiaiškinti CDP kliūtis(Cistanche deserticola polisacharidas)osteoklastogenezės metu išmatavome su osteoklastais susijusių genų transkripcijos lygius. Be gydymo CDP(Cistanche deserticola polisacharidas), indukcija su RANKL skatino NFATc1, CTSK, Acp5, Atp6v0d2 ir Mmp9 genų ekspresiją. Priešingai, kartu taikant CDP ir RANKL šie penki genai žymiai sumažėjo.

3.4. CDP(Cistanche deserticola polisacharidas)slopina RANKL sukeltą NFATc1 aktyvaciją

TRAcP dažymas atskleidė, kad CDP(Cistanche deserticola polisacharidas)gydymas reikšmingai sumažino numatomą subrendusių osteoklastų skaičiaus padidėjimą po RANKL stimuliacijos 3–7 dienas (4A ir B pav.). Be to, ištyrėme, ar CDP gydymas gali veiksmingai pakenkti osteoklastų diferenciacijai, slopindamas NFATc1 ekspresiją. Rezultatai parodė, kad NFATc1 buvo labai išreikštas po RANKL stimuliacijos 5 dienas, o tai buvo žymiai slopinama po CDP(Cistanche deserticola polisacharidas)gydymas (4C ir D pav.). Be to, gydymas CDP slopino CTSK, baltymo, reikalingo normaliam osteoklastų susidarymui ir funkcijai, ekspresijos lygius (Bossard ir kt., 1996) (4E ir F pav.). Mes pasirinkome RANKL stimuliacijos vaizdą 5 dienas, kad toliau tirtume 10 µg / ml CDP poveikį.(Cistanche deserticola polisacharidas)gydymas dėl NFATc1 translokacijos. Kaip ir tikėtasi, CDP(Cistanche deserticola polisacharidas)gydymas reikšmingai slopino RANKL sukeltą NFATc1 branduolio translokaciją.

3.5. CDP(Cistanche deserticola polisacharidas) slopina RANKL sukeltą NF-κB ir MAPK signalizacijos takų aktyvavimą

Norėdami išsiaiškinti mechanizmus, susijusius su CDP sukeltu osteoklastų diferenciacijos slopinimu, ištyrėme CDP poveikį.(Cistanche deserticola polisacharidas)gydymas NF-κB ir MAPK keliais. Rezultatai atskleidė, kad CDP(Cistanche deserticola polisacharidas)gydymas turėjo slopinamąjį poveikį IκB skilimui ir p65 fosforilinimui priklausomai nuo dozės. Buvo sureguliuotas trijų MAPK šeimos narių, ypač tarpląstelinio signalo reguliuojamos kinazės (ERK), c-Jun N-galinės kinazės (JNK) ir p38, fosforilinimas.

Cistanche Deserticola

4. Diskusija

Osteoporozė yra dažna ir degeneracinė kaulų liga. Šiuo metu osteoporozei gydyti yra daug cheminės sintezės vaistų, tokių kaip estrogenai ir bisfosfonatai. Tačiau ilgalaikis šių vaistų vartojimas palaipsniui susilpnins klinikinį veiksmingumą ir netgi sukels daug rimtų šalutinių poveikių, įskaitant padidėjusį kiaušidžių, krūties ir endometriumo vėžio bei žandikaulio osteonekrozės riziką (Beral, 2003; Khan ir kt., 2009; Lacey ir kt., 2002). Šiame tyrime pasirinkome CDP(Cistanche deserticola polisacharidas), veiksmingas komponentas, išgautas iš CD, kaip terapinis agentas ir įrodė, kad CDP(Cistanche deserticola polisacharidas)turėjo apsauginį poveikį

kaulų praradimas OVX pelėse ir slopino RANKL sukeltą osteoklastų susidarymą ir funkciją. Tuo tarpu pagal tradicinės kinų medicinos teoriją „inkstų valdantis kaulas“ kaulų retėjimas priskiriamas inkstų nepakankamumui. Įrodyta, kad CD, kaip inkstus tonizuojantis medicininis maistas, veiksmingai gydo osteoporozę (Fan ir kt., 2019; Jiang, Wang, Li ir Zhang, 2016). Taigi, CDP(Cistanche deserticola polisacharidas)išgautas iš šios natūralios žolės yra geresnis ir saugesnis vaistų pasirinkimas.

Šiuo metu OVX pelės modelis yra klasikinis moterų kaulų retėjimo po menopauzės modelis, tiriantis kaulų retėjimo priežastis ir atliekantis intervenciją (Wehrle ir kt., 2015). Atitinkamai, C57BL / 6J pelių patelėms atlikome dvišalę ooforektomiją, kad sukurtume osteoporozės modelį. Ankstesniuose tyrimuose CDP dozės gyvūnams buvo 50–200 mg/kg (maža dozė) ir 1800 mg/kg (didelė dozė) (Guo ir kt., 2016; Zhang ir kt., 2018). Čia didelė CDP dozė(Cistanche deserticola polisacharidas)pelėms buvo 600 mg/kg, kuri buvo pagrįsta didele klinikine 30 g CD nuoviru doze; taigi jis panašus į dabartinę klinikinę praktiką. Šiame tyrime gydymas CDP(Cistanche deserticola polisacharidas)žymiai slopino OVX sukeltą kūno svorio padidėjimą, kuris yra dažnas reiškinys, stebimas OVX pelėms (Davis ir kt., 2019). Naudodami mikro-CT nuskaitymą ir 3D rekonstrukciją, nustatėme, kad OVX žymiai sumažino KMT, BV / TV, BS / TV ir Tb. N, ir Tb padidėjimas. Sp, o CDP gydymas panaikino visus šiuos pokyčius. Visų pirma, palyginti su teigiamu vaistu, CDP gali žymiai pagerinti OVX pelių KMT, kuris yra svarbus kaulų kokybės žymuo ir naudojamas osteoporozės laipsniui atspindėti (Fuggle ir kt., 2019), o tai rodo, kad CDP turi pranašumą. daugiau nei teigiamą vaistą gerinant KMT. Be to, histologiniai rezultatai parodė, kad CDP gydymas gali sumažinti padidėjusį TRAcP teigiamų osteoklastų kiekį, kurį sukelia OVX. Šie rezultatai rodo, kad CDP vartojimas veiksmingai sumažino kaulų retėjimą sergant OVX sukelta osteoporoze, galbūt slopindamas osteoklastų susidarymą. Remiantis aukščiau pateiktais rezultatais, mes nustatėme, kad CDP, priklausomai nuo dozės, slopino RANKL sukeltą osteoklastų susidarymą ir funkciją, o CDP turėjo nedidelį poveikį M-CSF sukeltai osteoklastų pirmtakų ląstelių proliferacijai mūsų in vitro eksperimentuose.

RANKL ir RANK susiejimas gali paskatinti TRAF6 įdarbinimą ir vėliau suaktyvinti kelis pasroviui skirtus signalizacijos kelius, tokius kaip NF-κB ir MAPK (Boyle ir kt., 2003; Huang ir kt., 2006). NF-κB signalizacijos kelias vaidina svarbų vaidmenį reguliuojant osteoklastų diferenciaciją, o genų, koduojančių pagrindinius baltymus šiame kelyje, nutildymas gali sukelti nenormalų kaulų vystymąsi (Leibbrandt ir Penninger, 2008). Gerai nustatyta, kad NF-κB yra nestimuliuojamų ląstelių citoplazmoje komplekse su IκB, tačiau po RANKL stimuliacijos greitai patenka į branduolį (Boyle ir kt., 2003). Tada išsiskyręs IκB greitai suyra, o NF-κB aktyvuoja specifinę genų transkripciją, todėl skatina osteoklastų diferenciaciją, brendimą ir apoptozę (Abdelmagid ir kt., 2015). Šio tyrimo rezultatai parodė, kad CDP(Cistanche deserticola polisacharidas)gydymas slopino RANKL sukeltą NF-κB signalizacijos kelio aktyvavimą, kaip rodo IκB skilimo ir p65 fosforilinimo slopinimas priklausomai nuo dozės, o tai gali turėti įtakos jo anti-osteoklastogeniniam poveikiui. Be to, MAPK signalizacijos kelias, įskaitant ERK, JNK ir p38, yra glaudžiai susijęs su RANKL sukelta osteoklastogeneze (Li ir kt., 2002). Be to, dominuojantys p38 ir JNK inhibitoriai gali užkirsti kelią RANKL sukeltai osteoklastogenezei (Chang ir kt., 2008; Kim ir kt., 2019), o ERK vaidina svarbų vaidmenį osteoklastų išgyvenime (Miyazaki ir kt., 2000). Gerai žinoma, kad RANKL aktyvuoja MAPK signalizacijos kelią, padidindamas ERK, JNK ir p38 fosforilinimą (Mizukami ir kt., 2002). Savo tyrime parodėme, kad CDP slopino RANKL sukeltą pagrindinių baltymų fosforilinimą MAPK signalizacijos kelyje. Visi šie rezultatai rodo, kad NF-κB ir MAPK signalizacijos kelių aktyvacijos slopinimas prisideda prie CDP slopinamojo poveikio osteoklastogenezei.

NF-κB ir MAPK signalizacijos kelių aktyvinimas skatina kelių pagrindinių transkripcijos faktorių, tokių kaip ląstelių onkogeno fos, aktyvatoriaus baltymo 1 ir NFATc1, ekspresiją (Huang ir kt., 2006; Wagner ir Matsuo, 2003). NFATc1, svarbus NFAT šeimos narys, dalyvauja galutiniame osteoklastų diferenciacijoje kaip pagrindinis transkripcijos reguliatorius (Asagiri ir kt., 2005). Buvo pranešta, kad NFATc1- trūkumo embrioninės kamieninės ląstelės negali diferencijuotis į osteoklastus, stimuliuojant RANKL, o negimdinė NFATc1 ekspresija sukelia pirmtakų ląstelių diferenciaciją apeinant RANKL signalizaciją, o tai rodo, kad NFATc1 vaidina lemiamą vaidmenį osteoklastų diferenciacija (Takayanagi ir kt., 2002). Mūsų tyrimo rezultatai parodė slopinamąjį CDP poveikį(Cistanche deserticola polisacharidas)apie NFATc1 ekspresiją ir jį sekantį baltymą CTSK. Įdomu tai, kad mes pastebėjome, kad NFATc1 baltymų ekspresijos lygis pirmiausia padidėjo, o paskui sumažėjo ir pasiekė aukščiausią lygį 5 dieną po RANKL stimuliacijos. Tai atitiko Baek ir kt. (2014), kurie stebėjo M-CSF sukeltą NFATc1 skaidymą vėlyvosios osteoklastogenezės stadijos metu per Cbl sukeltą NFATc1 ubikvitinaciją priklausomai nuo Src kinazės. Imunofluorescencinio tyrimo rezultatai nuosekliai patvirtino CDP slopinamąjį poveikį(Cistanche deserticola polisacharidas)apie NFATc1 transkripcijos aktyvavimą. Be to, visi osteoklastams būdingi genai, įskaitant CTSK, Acp5, Mmp9 ir Atp6v{5}d2, yra tiesiogiai reguliuojami NFATc1 (Y. Kim ir kt., 2005), buvo slopinami CDP. Šie radiniai rodo, kad NFATc1 yra CDP slopinamojo poveikio taikinys(Cistanche deserticola polisacharidas)NF-κB ir MAPK signalizacijos keliuose.

Cistanche deserticola polisacharidas

5. Išvada

Apibendrinant, mes ekstrahavome ir išgryninome aktyvųjį polisacharidą iš CD ir parodėme, kad CDP(Cistanche deserticola polisacharidas)parodė apsauginį poveikį OVX sukeltai osteoporozei ir sumažino kaulų retėjimą, slopindamas osteoklastų aktyvumą ir funkciją. Be to, CDP(Cistanche deserticola polisacharidas)gali slopinti RANKL sukeltą osteoklastų diferenciaciją ir funkciją, trukdydamas NF-κB ir MAPK signalizacijos keliams ir dėl to paveikdamas pasroviui esantį NFATc1 aktyvavimą. Apibendrinant, mūsų išvados sudaro pagrindą CDP išplėtimui ir taikymui gydant osteoporozę.

Nuorodos

1. Abdelmagid, SM, Sondag, GR, Moussa, FM, Belcher, JY, Yu, B., Stinnett, H., ... Safadi, FF (2015). Osteoaktyvino mutacija skatina NFkappaB ligando (RANKL) sukelto osteoklastų diferenciaciją ir išgyvenimą receptorių aktyvatorių, bet slopina osteoklastų funkciją. Biologinės chemijos žurnalas, 290(33), 20128–20146. https://doi.org/10.1074/jbc.M114.624270.

2. Baek, JM, Kim, JY, Cheon, YH, Park, SH, Ahn, SJ, Yoon, KH, … Lee, MS (2014). Aconitum pseudolaeve var. erectum slopina branduolinio faktoriaus kappa-B ligando sukeltą osteoklastogenezę receptorių aktyvatorių per aktyvuotų T ląstelių c-Fos/branduolinį faktorių, citoplazminį 1 signalizacijos kelią ir užkerta keliąpolisacharidas- sukeltas pelių kaulų retėjimas. Molekulės, 19(8), 11628–11644. https://doi.org/ 10.3390/molecules190811628.

3. Black, DM, Bauer, DC, Schwartz, AV, Cummings, SR ir Rosen, CJ (2012). Tęsiamas gydymas bisfosfonataisosteoporozėkam ir kiek laiko? New England Journal of Medicine, 366(22), 2051–2053. https://doi.org/10.1056/ NEJMp1202623.

4. De Martinis, M., Di Benedetto, MC, Mengoli, LP ir Ginaldi, L. (2006). Senatvinisosteoporozė: Ar tai imuninės sistemos sukelta liga? Uždegimo tyrimai, 55(10), 399–404. https://doi.org/10.1007/s00011-006-6034-x.

5. Fuggle, NR, Curtis, EM, Ward, KA, Harvey, NC, Dennison, EM ir Cooper, C. (2019). Lūžių numatymas, vaizdavimas ir atrankaosteoporozė. Nature Reviews Endocrinology, 15(9), 535–547. https://doi.org/10.1038/s41574-019-0220-8.

6. Hu, Y., Huang, J., Li, Y., Jiang, L., Ouyang, Y., Li, Y., … Zeng, Q. (2020).Cistanche deserticola polisacharidasskatina melanogenezę melanocituose ir mažina oksidacinį stresą aktyvindamas NRF2/HO-1 kelią. Journal of Cellular and Molecular Medicine, 24(7), 4023–4035. https://doi.org/10.1111/jcmm.15038.

7. Huang, H., Ryu, J., Ha, J., Chang, EJ, Kim, HJ, Kim, HM, … Kim, HH (2006). Osteoklastų diferenciacijai reikalingas TAK1 ir MKK6 NFATc1 indukcijai ir NF-kappaB transaktyvacijai naudojant RANKL. Ląstelių mirtis ir diferenciacija, 13(11), 1879–1891.

8. Liu, Y., Wang, C., Wang, G., Sun, Y., Deng, Z., Chen, L., … Xu, J. (2019). Loureirinas B slopina RANKL sukeltą osteoklastogenezę ir pašalina kiaušidesosteoporozėper silpninančią NFATc1 ir ROS veiklą. Theranostics, 9(16), 4648–4662. https://doi. org/10.7150/thno.35414.

9. Rachner, TD, Khosla, S. ir Hofbauer, LC (2011).Osteoporozė: Dabar ir ateitis. Lancet, 377(9773), 1276–1287. https://doi.org/10.1016/S0140-6736(10)62349-5.

10. Strom, O., Borgstrom, F., Kanis, JA, Compston, J., Cooper, C., McCloskey, EV ir Jonsson, B. (2011).Osteoporozė: Našta, sveikatos priežiūros teikimas ir galimybės ES: Ataskaita parengta bendradarbiaujant su TarptautiniuOsteoporozėfondas (IOF) ir Europos farmacijos pramonės asociacijų federacija (EFPIA). Archyvai išOsteoporozė, 6, 59–155. https://doi.org/10.1007/ s11657-011-0060-1.

11. A identifikavimas ir apibūdinimaspolisacharidasiš Morinda officinalis šaknų, kaip kaulų formavimosi induktorius, reguliuojant tikslinio geno ekspresiją. International Journal of Biological Macromolecules, 133, 446–456.

12. Zhang, A., Yang, X., Li, Q., Yang, Y., Zhao, G., Wang, B. ir Wu, D. (2018). Imunostimuliuojantis vandens ekstrakto aktyvumaspolisacharidaiiš Cistanche deserticola kaip augalų adjuvantas in vitro ir in vivo. PLoS One, 13 straipsnio 1 dalis, e0191356 straipsnis. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0191356.

13. Zhang, K., Ma, X., He, W., Li, H., Han, S., Jiang, Y., … Tu, P. (2014). Cistanche deserticola ekstraktai gali antagonizuoti imunosenescenciją ir pailginti senėjimo pagreitintų pelių, linkusių 8 (SAM-P8) pelių gyvenimo trukmę. Įrodymais pagrįsta papildoma ir alternatyvioji medicina, 2014 m. (2), 601383 straipsnis. https://doi.org/10.1155/2014/601383.

14. Zhang, S., Zhang, Q., Zhang, D., Wang, C. ir Yan, C. (2018).Kova su osteoporoze aromano Achyranthes Biden tata veiklapolisacharidasper stimuliuojant kaulų formavimąsi.Carbohydrate Polymers, 184, 288–298. https://doi.org/10.1016/j.

15. Zheng, H., He, B., Wu, T., Cai, J. ir Wei, J. (2020). Ekstrahavimas, gryninimas ir anti-osteoporozinis aktyvumas apolisacharidasiš Epimedium Maxim. in vitro. International Journal of Biological Macromolecules, 156, 1135–1145. https://doi. org/10.1016/j.ijbiomac.2019.11.145.

Cistanche deserticola papildai