Ⅱ DALIS: SARS-CoV-2 Sirijos žiurkėno modelio infekcija sukelia uždegimą, taip pat I tipo interferono sutrikimą kvėpavimo ir ne kvėpavimo takų audiniuose, įskaitant širdį ir inkstus

Norėdami gauti daugiau informacijos:ali.ma@wecistanche.com

Magen Ellen Francis, Una Goncin ir kt.

SPAUSKITE ČIA, norėdami DALIS Ⅰ

Abstraktus

COVID{0}}(2019 m. koronavirusinė liga), kurią sukėlėSARS-CoV-2(sunkus ūminis respiracinis sindromas koronavirusas 2) infekcija yra liga, pažeidžianti kelias organų sistemas. Modelis, fiksuojantis visus klinikinius simptomusCOVID{0}}, taip pat tolimųjų vežėjų liga, reikalinga. Mes ištyrėme šeimininko atsakus, susijusius su infekcija keliose pagrindinėse organų sistemose, įskaitant kvėpavimo takus, širdį irinkstuspo toSARS-CoV-2Sirijos žiurkėnų infekcija. Mes nustatėme reikšmingą uždegiminių citokinų (IL-6, IL-1beta ir TNF) ir II tipo interferonų padidėjimą, o I tipo interferonai buvo slopinami. Ekstrapulmoninio audinio tyrimas parodė uždegimąinkstas, kepenys ir širdis, kurioms taip pat trūko I tipo interferono reguliavimo. Histologiškai širdyje buvo miokardito ir mikrotrombų požymiųinkstasturėjo kanalėlių uždegimą. Šie rezultatai leidžia suprasti daugelio organų ligą, kurią patiria žmonės, sergantysCOVID{0}}ir galbūt užsitęsusią ligą žmonėms, turintiems poūmių pasekmiųSARS-CoV-2(PASC). koronavirusas 2) infekcija gali paveikti kelias organų sistemas, įskaitant kvėpavimo takus, šlapimo takus, neurologinę sistemą ir širdies ir kraujagyslių sistemą. Norint tinkamai ištirti šią ligą ir įvertinti terapiją, modelis, apimantis visus klinikinius simptomusCOVID{0}}yra būtinas. Yra žinoma, kad žala, atsirandanti po virusinės infekcijos, dažnai atsiranda dėl paties šeimininko imuninės reakcijos. Todėl čia mes ištyrėme, kaip imuninio šeimininko atsakas reguliuojamas keliose pagrindinėse organų sistemose, įskaitant kvėpavimo takus, širdį irinkstuspo toSARS-CoV-2Sirijos žiurkėnų infekcija. Mes nustatėme reikšmingą uždegiminių citokinų (IL-6, IL-1beta ir TNF), taip pat antivirusinių citokinų, vadinamų I tipo interferonais, padidėjimą. Įdomu tai, kad antivirusinio atsako I tipo interferonai buvo slopinami kvėpavimo takuose. Ekstrapulmoninio audinio tyrimas parodė uždegimąinkstas, kepenys ir širdis, kurioms taip pat trūko I tipo interferono reguliavimo. Histologiškai širdyje buvo miokardito ir mikrotrombų požymiųinkstasturėjo kanalėlių uždegimą. Šie rezultatai leidžia suprasti daugelio organų ligą, kurią patiria žmonės, sergantysCOVID{0}}ir galbūt užsitęsusią ligą žmonėms, turintiems poūmių pasekmiųSARS-CoV-2(PASC).

Click to Cistanche naudoja inkstų funkcijai

SARS-CoV-2 infekcija sukelia reikšmingą uždegimą arba imuninės sistemos reguliavimą širdyje, limfmazgiuose ir blužnyje bei eozinofilų ženklus storojoje žarnoje.

Imuniniai uždegimo žymenys, adaptyvus imunitetas ir antivirusinis atsakas taip pat buvo įvertinti ne kvėpavimo takų audiniuose kartu su audinių histopatologija. Ištyrėme tarpuplaučio limfmazgius, širdį,inkstas, blužnis, kepenys ir storoji žarna, kad būtų galima reguliuoti imuninius taikinius, suskirstytus į kategorijas pagal I tipo IFN, II tipo / bendrąjį IFN atsaką ir įgimtus / prisitaikančius tarpininkus (6 pav.), taip pat imunopatologijai (7 ir S4 pav.). Jei pradinis histopatologijos įvertinimas parodė, kad dalyvauja specifiniai imuniniai mechanizmai (S4 pav.), buvo atliktas didelės raiškos nuskaitymas, siekiant gauti daugiau informacijos (7 pav.). 15 dieną tarpuplaučio limfmazgių atsistatyti nepavyko. Atitinkamas reikšmes genų ekspresijai galima rasti S2 lentelėje. I ir II tipo IFN atsakai visuose ekstrapulmoniniuose organuose, išskyrus kepenis, turėjo panašų reguliavimo profilį kaip ir plaučių ir nosies turbinų (6 pav.). Genų reguliavimui buvo būdingas sumažėjęs I tipo atsakas ir padidėjęs II tipo atsakas. STAT2 reikšmingai sumažėjo tarpuplaučio limfmazgiuose,inkstas, blužnis ir storoji žarna. Širdyje reikšmingai ir nuolat sumažėjo IRF1, o storojoje žarnoje sumažėjo IFN-beta (6 pav.). Ir atvirkščiai, ryškus gama IFN padidėjimas buvo pastebėtas tarpuplaučio limfmazgiuose irinkstasir mažesniu mastu širdyje ir blužnyje. CXCL10, T ląstelių chemoatraktantas, buvo padidintas iki didelio blužnies, kepenų ir tarpuplaučio limfmazgių, kur limfmazgio reguliavimas buvo dvifazis (6 pav.). Įgimtų / prisitaikančių tarpininkų genų blužnyje ir limfmazgiuose reguliavimas buvo pastebėtas visiems tirtiems imuniniams taikiniams, išskyrus TGF-beta, IL-5R ir CCR3, kurie nebuvo veiksmingai reguliuojami. Konkrečiai, reikšmingas CD3, CD4, CD8A, IL-2, IL-21, IL-10, IL-4, IL-5, IL{{13 }} ir IL-12 buvo pastebėta šiuose antriniuose imuniniuose organuose. Įgimtų / prisitaikančių imuninių mediatorių reguliavimas buvo ypač įdomus širdyje, kur IL-2, IL-10, IL-4 ir IL-5 padidėjo 100 kartų, palyginti su pradiniu lygiu. . Didžiausias uždegiminių citokinų reguliavimas buvo aptiktas širdyje, po to inkstuose, kepenyse ir tarpuplaučio limfmazgiuose. Širdyje IL-12 gerokai padidėjo anksti ir kartu su TNF išliko padidėjęs 15 pi dieną. IL-6 ir IL-1beta taip pat buvo laikinai indukuoti širdies audiniuose 5 ir 8 dienomis (6 pav.). Reikšmingi širdies pokyčiai buvo pastebėti histologinės analizės būdu (S4 pav.). Didelės skiriamosios gebos vaizdavimas nustatė mikrotrombų (7A pav., baltos rodyklės), taip pat miokardito (7B pav., baltos rodyklės) širdyje požymių. CD14, IL-1beta ir TNF buvo sureguliuoti anksti inkstuose, bet sumažėjo 8–12 pi dieną (6 pav.), o tai sutapo su uždegiminių ląstelių infiltracija į inkstą ir galbūt ūminiu inkstų pažeidimu arba kanalėlių pažeidimu (nurodyta). baltomis rodyklėmis, 7C pav.). IL-6 ekspresija buvo palaikoma kepenyse, kur IL-1beta taip pat padidėjo vėlyvais laiko momentais. Tarpuplaučio limfmazgiuose buvo dvifazis IL-12 padidėjimas, trumpalaikis IL-6 ir TNF padidėjimas atitinkamai iki 12, 8 ir 11 kartų. Storojoje žarnoje buvo reikšmingas IL-5, IL-5R ir CCR3 reguliavimas su eozinofilų infiltracija (7D pav.), bet minimalus bet kokių kitų įgimtų / prisitaikančių mediatorių reguliavimas. Norėdami atlikti papildomų plaučių organų analizę, išanalizavome gyvūnų kraujo chemiją per tam tikrą laiką, kad įvertintume organų disfunkciją (S5 pav.). Mes išanalizavome gliukozę, albuminą, šarminę fosfatazę, alanino transferazę, kraujo šlapalo azotą, bendrą bilirubiną ir bendrą baltymą kaip kepenų funkcijos požymį [27]. Inkstams įvertinti buvo analizuojamas kalcis, kalis, albuminas, amilazė, kraujo šlapalo azotas ir bendras baltymas [27]. Virškinimo trakto sveikata buvo vertinama naudojant natrio, kalio ir šarminės fosfatazės kiekį[27]. Širdies funkcija buvo matuojama naudojant natrio, kalio ir alanino transferazę [27]. Globulino padidėjimas buvo įvertintas kaip antigeninės stimuliacijos požymis[27]. Iš 14 tirtų molekulių, tik amilazės ir gliukozės kiekis buvo reikšmingai padidėjęs užsikrėtusiems gyvūnams, palyginti su kontroliniais gyvūnais, 8 pi dieną atitinkamai 1700 U/L ir 280 mg/dL. Be to, kalio koncentracijos ([K plius ]) pokyčiai buvo ryškiausi ir dažniausiai buvo susiję su laiku per tyrimo laikotarpį, nes daugumai asmenų padidėjo [K plius ], o didžiausias pokytis buvo pastebėtas 15 dieną. albumino kiekis taip pat buvo pastebimas, tačiau daugeliui gyvūnų buvo švelnus. Bendra baltymų koncentracija daugumos tiriamųjų šiek tiek padidėjo, tačiau pokytis yra gana lengvas ir greičiausiai kliniškai nereikšmingas. Kiti kepenų žymenys pasiekė aukščiausią tašką vėliau, įskaitant gliukozę (280 mg/dl) 8 dieną, šarminę fosfatazę (ALP) 12 dieną (3 U/L) ir kraujo šlapalo azotą (BUN) (22 mg/dl). 15 dieną. Alanino transferazė (ALT), nors ir pasiekė aukščiausią lygį 2 dieną, buvo didelė 12 dieną ir buvo šiek tiek mažesnė nei 100 U/L, o tai rodo galimą kepenų pažeidimą. Inkstų žymenys taip pat pasiekė aukščiausią tašką vėliau, 8 dieną amilazei (1700 U/L), o 15 dieną kaliui ir BUN (atitinkamai 12 ir 22 mg/dl). BUN, išskyrus kelias išimtis, gali padidėti nuo laiko priklausanti koncentracija. Priešingai, 2,6 mg/dl kalcio kiekis buvo didžiausias 2 dieną, bet nukrito į atskaitos intervalus. Virškinimo trakto ir širdies sveikatos žymenys, tokie kaip natris, parodė minimalų reguliavimą, o [K plius ] padidėjo santykinai tiesiškai per visą infekcijos laikotarpį, o aukščiausią tašką pasiekė 15 dieną (12 mg/dl). ALP (virškinimo trakto žymuo) buvo didelis 5 ir 8 dienomis esant 3 u/l, o ALT (širdies žymuo) buvo padidėjęs užsikrėtusiems žiurkėnams, palyginti su neužkrėstais žiurkėnais 2, 8 ir 12 dienomis esant 75–100 U/L, tačiau skirtumai nebuvo reikšmingi. Galiausiai, globulinas pasiekė aukščiausią 2 dieną – 0,6 g/dl ir laikui bėgant sumažėjo santykinai tiesiškai. Apskritai kraujo analizė rodo tam tikrą ekstrapulmoninių organų reguliavimo sutrikimą, taip pat antigeninę stimuliaciją, reaguojant įSARS-CoV-2.

6 pav. SARS-Cov-2 infekcija žiurkėnams padidina su uždegimu ir su imuniniu tarpininku susijusių genų skaičių tam tikruose ekstrapulmoniniuose organuose, o tai gali rodyti miokarditą, adaptyviąją imuninės sistemos evoliuciją ir eozinofilų infiltraciją į storąsias žarnas.qRT-PGR buvo atlikta su RNR, išskirta iš tarpuplaučio (M) limfmazgio, širdies, inkstų, blužnies, kepenų ir storosios žarnos.SARS-CoV-2inokuliuoti žiurkėnai. Mėginiai buvo įvertinti dėl I tipo interferono atsako (IFN-beta, STAT2, IRF1, IRF3, TLR3), II tipo interferono atsako (IFN-gama, IRF2, STAT1, CXCL10) ir įgimto / prisitaikantis tarpininkas (CD3, CD4, CD8, CD19, IL-2, TGF-beta, IL-21, IL-10, IL-4, IL-5, IL-5R, IL-13, IL-12, CD14, CCR3, PKR, CCL20, CCL22, IL-1beta, IL-6, TNF) genai panaudojant PGR pradmenis, būdingus žiurkėnų sekoms (1 lentelė). Sulenkimo pokytis buvo apskaičiuotas naudojant ΔΔCt, palyginti su pradine linija (0 diena), naudojant BACT kaip namų tvarkymo geną. N yra 3 visiems laiko taškams.

Diskusija

Iš pradžiųSARS-CoV-2Manoma, kad infekcija daugiausia sukelia kvėpavimo takų ligas, tačiau dabar tai aiškuCOVID{0}}yra daugelio veidų liga, pažeidžianti kelias organų sistemas[25,26]. Siekdami geriau suprasti ligos kilmę ir daugybę klinikinių simptomų, patiriamų žmonėms, tyrimo metu ištyrėme kvėpavimo takų ir ne kvėpavimo organų imunopatologiją.SARS-CoV-2Sirijos žiurkėnų infekcija. Infekcija 105 TCID50 išSARS-CoV-2sukėlė lengvą ar vidutinio sunkumo klinikinę ligą. Infekcinis virusas daugiausia buvo kvėpavimo takuose, nors viruso RNR buvo visuose įvertintuose audiniuose. Kvėpavimo takų šeimininko atsako profiliavimas nustatė I tipo IFN atsako slopinimą kartu su II tipo IFN, uždegiminių citokinų, įgimtų ir adaptyvių citokinų padidėjimu. Neplaučių organų tyrimas taip pat nustatė panašų I ir II tipo IFN signalizacijos profilį; tačiau buvo nustatyta ir specifinė audinių imuninė reguliacija. Konkrečiai, reikšminga įgimtų ir prisitaikančių tarpininkų išraiška buvo nustatyta širdyje ir blužnyje. Kadangi antivirusinio gydymo metuSARS-CoV-2infekcija yra veiksminga tik per trumpą laikotarpį[28], sunkiCOVID{0}}Manoma, kad tai yra sutrikusio imuninio atsako pasekmė[29]. Imuninės patogenezės supratimas yra būtinas norint nustatyti terapinius tikslus ir gydyti ūminius ne kvėpavimo takų simptomus, susijusius suCOVID{0}}įskaitant širdies plakimą ar migreną ir ilgiau trunkančias būkles atsigavimo fazėje, pvz., poūmines pasekmesSARS-CoV-2infekcija (PASC), dar vadinama ilgalaikiu COVID[30].

7 pav. Kai kurie ekstrapulmoniniai organai turi skirtingą patologiją po SARS-CoV-2 infekcijos su mikrotrombų ir miokardito požymių širdyje, kanalėlių pažeidimu inkstuose ir eozinofilų infiltracija storojoje žarnoje.Širdis, inkstai ir storoji žarna buvo paimti iš kiekvieno gyvūno skrodimo metu ir fiksuoti 10 procentų formalinu prieš parafino bloko įterpimą. Audiniai buvo nudažyti H&E. Širdies audiniuose buvo mikrotrombų (baltos rodyklės) per kelias dienas (A), taip pat miokarditas 8 dieną (balta rodyklė) (B). Inkstams buvo ūminis sužalojimas / kanalėlių pažeidimas (baltos rodyklės) (C). Storojoje žarnoje buvo eozinofilų infiltracija (baltos rodyklės) (D). Dažyti audiniai buvo vizualizuoti ir vaizduojami naudojant skaidrių skaitytuvą Aperio ScanScope XT. Rodomi vaizdai reprezentuoja 3 gyvūnus vienoje grupėje per vieną laiko tašką.

Pirminė infekcijos vieta, daranti įtaką perdavimuiSARS-CoV-2žmonėms yra kvėpavimo takai. Todėl pradinis mūsų tyrimo dėmesys buvo skiriamas kvėpavimo takams, įskaitant susijusius imuninius atsakus ir imunopatologiją. Čia pademonstravome ir viršutinių, ir apatinių kvėpavimo takų infekciją bei susijusią ligą po SARS-CoV-2 infekcijos Sirijos žiurkėnams. Virusinė plaučių infekcija sukėlė sunkią patologiją, kuriai būdinga uždegiminių ląstelių infiltracija, dėl kurios 5-ąją dieną pasireiškė bronchopneumonija, o 8 dieną – kraujavimas. Šie radiniai atitiko SARS-CoV{5}} infekciją ankstesniuose Sirijos žiurkėnų tyrimuose[19, 20, 31, 32] ir didesni gyvūnų modeliai, įskaitant rezus makakas[33], taip pat kai kuriems žmonėms nustatyta sunki pneumonijaCOVID{0}}pacientų[34-36]. Duomenų nuoseklumas patvirtina žiurkėno naudojimą modeliavimuiSARS-CoV-2infekcinė žmogaus kvėpavimo takų liga ir susijusi imunopatologija. Taip pat pastebėjome, kad kai kurie žiurkėnai patyrė didesnį svorio kritimą, kuris buvo susijęs su didesniu viruso kiekiu. Skirtingas svoris galėjo atsirasti dėl natūralaus žiurkėnų instinkto slėpti maistą savo skruostuose, neveiksmingo inokuliavimo arba dėl įgimtų šeimininko savybių, kurios gali lemti skirtingą svorio mažėjimą ir viruso dauginimąsi šiose gyvulėse. Kadangi buvo patikrinta, ar visi gyvūnai laikosi maisto produktų burnoje, ir visi gyvūnai buvo teigiamiSARS-CoV-2viruso, nemanome, kad šis rezultatas yra nei svėrimo klaidų, nei prastos inokuliacijos atspindys. Reikia daugiau darbo, norint nustatyti, ar Sirijos žiurkėnai turi genetinių skirtumų nuo Charles River. Gyvūnų grynumo supratimas suteiks svarbios informacijos apie šių gyvūnų naudojimą SARS-CoV-2 terapiniuose tyrimuose ir ar bus įmanoma panaudoti šias žinias sunkesnio žiurkėno vystymuisi.SARS-CoV-2modelis. Savo tyrime taip pat nustatėme pagrindinių uždegiminių genų, tokių kaip IL-6 ir TNF, reguliavimą plaučiuose ir nosies turbinose, patvirtinančius ankstesnį žiurkėnų imuninį modeliavimą[32,37]. Šios išvados yra svarbios, nes buvo įrodyta, kad šie uždegiminiai žymenys yra sunkios ligos prognozės, įvertinus žmonių kraują[38-42]. Nuodugnesnė šeimininko atsako į SARS-CoV-2 analizė žiurkėnų kvėpavimo audiniuose buvo atlikta naudojant transkripto sekos analizę[43,44]. Hoaglandas ir kolegos įvertino plaučiusSARS-CoV-2užkrėstus žiurkėnus šeimininko imuninio geno reguliavimui ir nustatė ryškų IL-6, TNF ir IL-1beta[43] padidėjimą, atitinkantį mūsų PGR rezultatus. Kito tyrimo metu vienos ląstelės sekos analizė atskleidė ryškų T ląstelių atsaką, įskaitant gama IFN ir IL-2[44], dviejų žymenų, kurie taip pat buvo labai išreikšti plaučiuose, reguliavimą. Be to, mūsų plaučių analizė atskleidė T ląstelių žymenų CD3, CD4 ir CD8A reguliavimą. Svarbu tai, kad qRT-PGR analizė, apie kurią pranešėme šiame tyrime, sutampa su šiais kitais tyrimais, taip patvirtinant qRT-PGR naudojimą kaip metodą, leidžiantį greitai įvertinti vakcinų ir gydymo priemonių, vertinamų žiurkėnų SARS-CoV{{, veiksmingumą. 13}} modelis. Mūsų qRT-PCR profiliuose pateikiami tiksliniai biomarkeriai, kuriuos galima lengvai panaudoti. Mūsų tyrimą ir aiškinimą ribojo tik patogenezės analizė. Būsimuose tyrimuose turėtų būti panaudota mūsų imuninių taikinių grupė, skirta naudoti vakcinų ir terapiniuose tyrimuose.

Antivirusinis atsakas yra būtinas pradinei viruso kontrolei aktyviai sunaikinant viruso replikaciją ir stimuliuojant imuninę sistemą, siekiant apriboti plitimą į kitas ląsteles. Nustačius viruso ar viruso antigenų buvimą, interferonų indukcija yra svarbiausia siekiant sukurti antimikrobinę būseną ląstelėse, kur interferonų ir kitų įgimtų citokinų pusiausvyra yra labai svarbi veiksmingam veikimui[45]. Pastaruoju metu I tipo interferonų (IFN-alfa ir IFN-beta) slopinimas buvo siejamas su sunkia ligaCOVID{0}}Tai rodo, kad virusas gali blokuoti antivirusinį imunitetą, dėl kurio padidėja patogenezė [14,46,47]. Savo tyrime mes nustatėme, kad žiurkėnai, užsikrėtęSARS-CoV-2turi prototipinį II tipo IFN atsaką. Priešingai, IIFN tipo atsakas yra sumažintas, kaip rodo IFN-beta geno ekspresijos sumažėjimas ir IRF2 geno, I tipo antagonisto, ekspresijos padidėjimas. Daugybė tyrimų parodė, kad I tipo IFN atsakas susilpnėjo po SARS-CoV-2 infekcijos in vitro[14,48-51]. IFN disreguliacija, apie kurią pranešame čia, dar nebuvo ištirta sunkių žmonių kvėpavimo audinyjeCOVID{0}}, tačiau sisteminės imuninės kraujo analizės parodė panašius rezultatus[14,46,47,52]. Nors mechanizmai, slopinantys I tipo interferono atsaką, nebuvo iki galo išaiškinti, virusiniai ir šeimininko veiksniai buvo susiję su šiuo reguliavimo sutrikimu [53, 54].

Interferono atsako reguliavimo sutrikimas yra virusų naudojama strategija, siekiant išvengti šeimininko imuniteto. Ankstesni šeimininko atsako į SARS-CoV (sunkaus ūminio kvėpavimo sindromo koronaviruso 1) ir MERS-CoV (Artimųjų Rytų respiracinio sindromo koronaviruso) infekciją tyrimai rodo, kad daugelis koronavirusų naudoja šią strategiją[55-59]. 2020 m. atliktas Xia ir kt. tyrimas. nustatyta, kad šis labai patogeniškų koronavirusų naudojamas reguliavimas tęsiasi ikiSARS-CoV-2parodydami, kad visi trys iš šių beta koronavirusų sumažina I tipo interferono kelią. Konkrečiai, NSP1, NSP6 ir NSP13[50] trukdo IFN-beta transliacijai, blokuodami šeimininko ribosomą NSP1[60] atveju arba nukreipdami prieš srovę esančius baltymus, būtinus IFN-beta indukcijai NSP13 atveju[61]. KitaSARS-CoV-2viruso baltymai taip pat buvo susiję su interferono reguliavimu[62]. ORF3b ir ORF9b yra specialiai nukreipti į mitochondrijų antivirusinių signalų baltymų kompleksą, kad slopintų I tipo IFN signalizaciją [63, 64]. Įtakojantys šeimininko veiksniaiSARS-CoV-2infekcijos pasekmės apima amžių ir lytį; be to, gretutinės ligos taip pat buvo susijusios su interferono reguliacija[65]. 2020 m. atliktas Trouillet-Assent ir kt. tyrimasCOVID{0}}pacientų rezultatai kohortoje, kurioje buvo asmenys, sistemingai ekspresuojantys I tipo IFN, ir asmenys, kurių alfa ir beta IFN kiekis buvo žymiai mažesnis. Jie nustatė, kad pacientai, kuriems trūksta I tipo interferono ekspresijos, buvo vyresni ir dažniau vyrai, palyginti su tais, kurie išreiškė I tipo IFN[66. Panašiame tyrime nustatytas žymiai didesnis sisteminis IFN-alfa2 kiekis moterims, palyginti su vyrų lygiu|67]. Neseniai atliktame tyrime nustatėme, kad vyresnio amžiaus suaugusių šeškų patinų I tipo interferono atsakas buvo uždelstas, palyginti su suaugusiomis patelėmis, o patinams trūko esminių antivirusinių genų, įskaitant OASL, MIX1 ir IDG15, indukcijos, o tai sutapo su padidėjusia virusų našta[68]. Mūsų dabartiniame tyrime, naudojant žiurkėnų modelį, visi mūsų gyvūnai buvo patinai, o tai rodo, kad norint visapusiškai suprasti mūsų pastebėtą I tipo interferono disreguliaciją, reikia ištirti lytinį šališkumą. Šiuo metu nežinoma, kodėl ir kaip šeimininko veiksniai veikia interferono atsaką įSARS-CoV-2. Bastard ir kt. atliktas tyrimas nustatė, kad vyrams, sergantiems sunkiomis ligomis, yra autoantikūnų prieš I tipo interferonus.COVID{0}}[69]. Tai leidžia paaiškinti imuninius mechanizmus, susijusius su sumažėjusiu I tipo interferono atsaku kai kuriems pacientų pogrupiams. Sumažėjusio interferono atsako mechanizmas mūsų dabartiniame tyrime, kuriame visi žiurkėnai buvo suaugę patinai, laukia tolesnio tyrimo. Be to, kartu paėmus, imuninis profilis, kurį nustatėme kartu su kvėpavimo takų patologija, rodo, kad žiurkėnai yra idealus modelis tirti šiuos mechanizmus ir išbandyti vaistus, tokius kaip Iinterferonai [48, 49, 70] arba interferonas lambda [Z1, Z2], kurie abu įrodė veiksmingumą gydantCOVID{0}}pacientų [Z3-75], tačiau reikia atlikti daugiau tyrimų.

COVID{0}}yra liga, kuri apima ir kvėpavimo, ir ne kvėpavimo organų patogenezę[25,26, tačiau mažai žinoma apie šeimininko atsaką už kvėpavimo takų ribų. Savo tyrime nustatėme vRNR keliuose audiniuose už kvėpavimo takų ribų, įskaitant tarpuplaučio limfmazgius, širdį, inkstus, kepenis, blužnį ir storąją žarną. Virusinės RNR buvimas gali būti gyvo viruso replikacijos ir audinių infekcijos rodiklis, bet gali būti ir be gyvo viruso. Neradome reikšmingo gyvo viruso už kvėpavimo takų ribų, o tai rodo minimalią ekstrapulmoninių organų infekciją. Tačiau virusinės RNR buvimas gali turėti įtakos klinikinei ligai ir susijusiems mechanizmams. Virusinės RNR gali atsirasti dėl viruso kraujyje, kuris yra sistemiškai pernešamas, arba viruso antigeno, kurį antigeną pateikiančios ląstelės pernešė į imunologiškai svarbius audinius, tokius kaip blužnis ir tarpuplaučio limfmazgiai. Virusinės RNR buvimas gali turėti įtakos imuniniam atsakui ir susijusiai patogenezei šiuose audiniuose. Todėl toliau tyrėme su imunitetu susijusius šeimininkų atsakus audiniuose, kurie buvo teigiami virusinei RNR. Nors mes nustatėme uždegiminių ir II tipo interferono genų reguliavimą visuose ne plaučių audiniuose, ryškiausias atsakas buvo imunomoduliuojančių citokinų padidėjimas širdyje. Mūsų analizė nustatė citokinų, įskaitant IL-10, IL-2, IL-4, IL-5, IL-5R, IL{, padidėjimą širdyje. {12}}, CD14 ir CCR3, kur kai kurie citokinų mRNR nuorašai buvo padidinti 100- kartus. Nors atrinktus citokinus čia gali gaminti skirtingi T ląstelių pogrupiai, TGF-beta nebuvimas rodo, kad T-reguliuojančių ląstelių buvimas yra mažiau tikėtinas. Be to, IL-13 nebuvimas sumažina TH2 atsako tikimybę. Be T-limfocitų, IL-10, TNF ir IL-6 genų ekspresijos padidėjimas gali būti siejamas su monocitais arba makrofagais[76]. Tai dar labiau patvirtina CD14 padidėjimas[76]. IL-5, IL-5R, IL-4 ir CCR3 ekspresija taip pat rodo, kad yra eozinofilų[77]. Daugybė klinikinių tyrimų dabar nustatė širdies pažeidimąCOVID{0}}[78-84]. Tiesą sakant, manoma, kad maždaug 30 procCOVID{0}}turi tam tikro tipo širdies pažeidimą85]. Vokiečių tyrimas apie 100COVID{0}}pacientų pastebėjo, kad miokardo uždegimas buvo dažnas net praėjus mėnesiams po pasveikimo nuoSARS-CoV-2infekcija[84]. Ištirtoje grupėje 78 procentai pacientų patyrė su širdimi susijusių simptomų, neatsižvelgiant į jų laipsnį.COVID{0}}sunkumas[84]. Monocitai yra tarp ląstelių tipų, kurie, kaip žinoma, prasiskverbia į širdį sergant miokardo uždegimu, gamina IL-10, IL-1beta, IL-6 ir TNF [86], taip pat IL-12[87,88], kurie visi buvo sureguliuoti širdyje poSARS-CoV-2skiepijimas mūsų dabartiniame tyrime. Be to, kitas širdies problemų pogrupis, susijęs suCOVID{0}}buvo priskiriamas eozinofilams, sukeliantiems eozinofilinį miokarditą[89]. Yra žinoma, kad kiti virusai po užsikrėtimo sukelia eozinofilinį miokarditą[90-93]. Ši patologija paprastai atsiranda, kai virusas užkrečia širdies audinius, pavyzdžiui, Coxsackievirus B3 infekcija[94]. Buvo diagnozuotas eozinofilinis miokarditasCOVID{0}}pacientų, o po skrodimo širdies audinys parodė uždegiminių ląstelių, įskaitant limfocitus, makrofagus ir ypač eozinofilus, infiltraciją [89]. Šiuo atveju eozinofilų padidėjimas ir bendras širdies uždegimas buvo nustatytas nepaisant to, kad mirties metu širdyje nebuvo gyvo viruso [95]. Atlikdami eozinofilinio miokardito histopatologijos ir citokinų parašo širdyje tyrimą radome įrodymų. Mūsų tyrime įmanoma, kad eozinofilai sukelia uždegiminę kardiomiopatiją, padidindami IL-4 reguliavimą, kuris 8 dieną po SARS-CoV-2 inokuliacijos padidėjo dėl genų ekspresijos žiurkėnų širdyse. Padidėjęs kalio kiekis ir nedidelis alanino transferazės padidėjimas užsikrėtusių žiurkėnų plazmoje taip pat galėjo palaikyti širdies veiklos sutrikimą. Turint tai omenyje, mechanizmai, reguliuojantys širdies pažeidimą, susijusį su COVID{7}}, vis dar nežinomi. Atsižvelgiant į širdies pažeidimo paplitimąCOVID{0}}pacientų, norint suprasti ligos mechanizmus, reikia atlikti daugiau tyrimų. Pateikėme įrodymų, kad žiurkėnai gali būti naudingi norint suprasti apibrėžiančius širdies pažeidimo mechanizmusSARS-CoV-2infekcija ir šios patologijos gydymo priemonių įvertinimas.

Imunologiniu požiūriu mūsų blužnies ir tarpuplaučio limfmazgių analizė rodo, kad atsiranda adaptyvus imunitetas. Tarpuplaučio limfmazgis nustatė reikšmingą dvifazį su T ląstelėmis susijusių genų reguliavimą, padidindamas CD3, CD4, IL-2, IL-21, I-10, IL{ genų ekspresijos reguliavimą. {6}}, IL-5 ir IL-13 2 ir 15 dienomis. Šis profilis rodo ankstyvą antigeno atsiradimą drenuojančiame limfmazgiuose netrukus po plaučių infekcijos dendritinėmis ląstelėmis, o tai būtų palaikoma dieną. 2 IL-12 gamybos limfmazgiuose padidėjimas [96,97]. Dendritinių ląstelių migracija, sukelianti T ląstelių aktyvavimą, galiausiai baigiasi IL-2, skatinančiu T ląstelių augimą ir proliferaciją[98]. Globulino kiekis kraujyje 2 dieną po užsikrėtimo užsikrėtusiems žiurkėnams taip pat palaiko ankstyvą antigeninę stimuliaciją. Padidėjęs IL-4, IL-5 ir IL-13 reguliavimas rodo, kad TH2 atsakas yra iškreiptas[99]. Ankstyvieji tyrimai parodė, kad besimptomis arba lengvasCOVID{0}}atvejų, kai imuninė sistema pakrypo link sisteminio TH2, kuriam būdingas IL-4 ir IL-10[100] padidėjimas. IL-10, reguliuojančio citokino, 2 mūsų tyrimo dieną taip pat buvo padidintas. Mūsų duomenys rodo, kad aktyvuotos T ląstelės yra įtraukiamos į audinius, turinčius gyvą virusinę infekciją, pvz., Nosies turbinus, kur 5 dieną po inokuliacijos pastebėjome su T ląstelėmis susijusių genų padidėjimą. Antrinis limfmazgio genų reguliavimas 15 dieną taip pat rodo T ląstelių pogrupių išsiplėtimą. Jei šiuo metu nėra infekcinių virusų, tai gali būti T ląstelių pogrupių padidėjimas, kuris tiesiogiai prisideda prie atminties atsako vystymosi. Kadangi centrinės atminties T ląstelės taip pat gamina IL-2[101], mūsų duomenys, rodantys padidėjusį IL-2 15 dieną po inokuliacijos, gali rodyti T ląstelių atmintį. IL-21 buvo labiausiai reguliuojamas su T ląstelėmis susijęs genas 15 dieną. IL-21 daugiausia gamina T folikulų pagalbinės ląstelės – pogrupis, padedantis gemalo centro B ląstelėms[102], ypač iškreiptoms B. ląstelės afiniteto brendimo ir atminties vystymosi link. B ląstelių žymeklis CD19 taip pat padidėjo limfmazgiuose, o didžiausia genų ekspresija įvyko 15 dieną. 2021 m. atliktas Lakshmanappa ir kt. atliktas tyrimas.SARS-CoV-2rezus makakų infekcija, atskleidžianti tvirtą T ląstelių atsaką tarpuplaučio limfmazgiuose su specifiniu CD4 padidėjimu, taip pat T folikulų pagalbinių ląstelių žymenų CD28 ir CXCR5 [103]. Gali būti, kad mūsų tyrime pastebėta padidėjusi T ląstelių genų ekspresija taip pat rodo germinalinio centro atsaką. Padidėjęs sisteminis T ląstelių atsakas taip pat buvo pastebėtas pacientams, sergantiems SARS-CoV-2, kurie pasveiksta ir išsivysto ilgalaikė atmintis [97, 104]. Skiepų tyrimams būtų naudinga atlikti gilesnę analizę su padidėjusiais gemalo centro reakcijų žymenimis limfmazgių įvertinimui.

Padidėjęs limfmazgių aktyvumas taip pat gali rodyti patogenezę. Limfmazgis buvo vienintelis ne kvėpavimo organas, kuriame buvo aptiktas gyvas virusas. Gyva virusinė limfmazgio ir blužnies infekcija buvo pastebėta žmonėms, kurie mirė nuoSARS-CoV-2[105].Kaneko ir kt. atliktame tyrime žmogaus limfmazgių ir blužnies mėginiai iš mirusiųjųCOVID{0}}pacientams trūko BCL6 plius B ląstelių, taip pat ištisų germinalinių centrų apskritai. Autoriai iškėlė hipotezę, kad tai buvo prastos humoralinės reakcijos priežastisSARS-CoV-2[106]. Kadangi nustatėme tvirtą neutralizuojančių antikūnų atsaką, kuris buvo aptiktas 8 dieną po užsikrėtimo, kuris sutapo su viruso plitimo sumažėjimu, labiau tikėtina, kad mūsų tyrimo limfmazgiuose rastas gyvas virusas rodo funkcinį B ląstelių atsaką ir germinalinio centro reakcijos.

Blužnis taip pat parodė ryškius imuninius atsakus, kuriems būdingas genų ekspresijos padidėjimas tiesiškai nuo 8 dienos iki 15 dienos. Šis vėlyvas reguliavimas koreliuoja su tipišku blužnies įsitraukimu ir imuniniu atsaku į patogenus, kurie atsirastų aktyvavus vietinius nutekėjimo mazgus[107]. Blužnis, limfoidinis organas, taip pat aktyvina T ir B ląsteles, reaguodama į viruso antigeną. Didelė CD3, CD4, IL-2 ir I-21 genų ekspresija rodo T folikulų ląsteles. taip pat nuo gemalo centro priklausomą B ląstelių aktyvumą, kaip matėme limfmazgiuose [108]. Be to, atsakas blužnyje gali būti viremijos pasekmė, kai plazmacitoidinės dendritinės ląstelės (pDC) dalyvauja viruso antigeno atpažinime per TLR7 ir TLR9, skirtą CD8 plius T ląstelėms ir Natural Killer T (NKT) ląstelių aktyvavimui. Abu šie ląstelių tipai veikia išvalant virusu užkrėstas ląsteles po to, kai blužnyje juos aktyvuoja IFN-beta ir IL-12 [109], kurių mūsų modelyje buvo padidinta kartu su CD8.IL-12 , IL-10 ir CD14 buvo sureguliuoti užsikrėtusių žiurkėnų blužnyje, o tai gali reikšti makrofagų fagocitinį aktyvumą[110,111]. Be to, įgimtos limfoidinės ląstelės (ILC) blužnyje palaiko audinių atstatymą reaguojant į sužalojimą ir gamina IL-5 ir IL-13[112]. Apibendrinant, šis vėlesnis atsakas blužnyje rodo blužnies perdirbimo funkciją, taip pat galimą limfocitų aktyvavimą ilgalaikės atminties atsakams.

Storojoje žarnoje nustatytas minimalus vertinamų citokinų reguliavimas, išskyrus I-5, IL-5R ir CCR3. Visų trijų šių genų ekspresija žymiai padidėjo nuo 2 iki 15 dienų, o didžiausias IL-5 kartotinis pokytis buvo 74, palyginti su pradine 8 dieną. IL-5 daugiausia išskiria 2 tipo T. - pagalbinės ląstelės ir eozinofilai[113]. Atsižvelgiant į mažesnius kitų Th2 susijusių genų, tokių kaip IL-4 ir IL-13, genų ekspresijos lygius ir žinomų eozinofilų žymenų IL-5R ir CCR3 padidėjimą, tikėtina, kad IL{ {18}} daugiausia gamina eozinofilai, kurie matomi atliekant histologinę storosios žarnos analizę. Eozinofilai atlieka tiesioginį antivirusinės gynybos vaidmenį, kaip rodo jų granulėse esančios RNazės, ir jie yra susiję su kitų kvėpavimo takų virusų pašalinimu[114,115]. Didelis eozinofilų skaičius randamas ir virškinimo trakte[116]. Mūsų tyrimo metu užsikrėtusių žiurkėnų storojoje žarnoje gyvų virusų nebuvo. Tačiau storoji žarna buvo teigiamaSARS-CoV-2viruso RNR 2 ir 5 dieną po inokuliacijos, o tai atitinka Sia ir kt., kurie taip pat stebėjo vRNR storojoje žarnoje, nesant uždegiminio atsako [20]. Iki 20 procCOVID{0}}pacientų praneša apie virškinimo trakto simptomus, tokius kaip viduriavimas[39 117], kai virusai išsiskiria su išmatomis[118]. Tai galima paaiškinti eozinofilų sumažėjimu, apie kurį pranešta sunkiais atvejaisCOVID{0}}[119-121]. Eozinofilų IL-5 geno ekspresijos padidėjimas gali prisidėti prie antivirusinės storosios žarnos būklės ir taip užkirsti kelią infekcijai. Reikia atlikti tolesnį tyrimą, kad būtų patvirtintas tikslus ląstelių tipas, lemiantis šį padidintą IL-5 atsaką.

Savo tyrime taip pat ištyrėme kraujo chemijąSARS-CoV-2užkrėstų Sirijos žiurkėnų. Referencinį diapazoną nustatėme naudodami neužkrėstus žiurkėnus iš mūsų gyvūnų šaltinio, taip pat palyginome rodmenis su paskelbtais žiurkėnų, ypač Sirijos žiurkėnų, etaloniniais diapazonais[122]. Kai kurie ikianalitiniai veiksniai, galintys turėti įtakos mūsų gyvūnų kraujo chemijai prieš užsikrėtimą, į kuriuos reikia atsižvelgti atliekant analizę, yra gyvūnų patiriamo streso lygis, taip pat izoflurano anestetikas, naudojamas imant kraują, kuris gali pakeisti kraujo cheminę sudėtį. Buvo įrodyta, kad gliukozės, ALT, ALP ir neorganinio fosforo kiekis buvo žymiai didesnis žiurkėms, vartojusioms izofluraną ir kitus čia nenurodytus anestetikus[123]. Atlikdami SARS-CoV-2 užsikrėtusių žiurkėnų tyrimą, vienas iš ryškiausi pokyčiai po užsikrėtimo buvo kalio koncentracija, kuri laikui bėgant didėjo. Kalis, kuris yra bazė, veikia kaip buferis, keičiantis vandeniliu (H') (rūgštimi), kai pacientas yra rūgštinėje būsenoje. Kadangi kraujo acidozę gali sukelti kvėpavimo funkcijos pokyčiai, nenuostabu, kad žiurkėnai, kuriems pasireiškė pneumonijos / kvėpavimo sutrikimo požymiai (tai rodo, kad anglies dioksidas (CO2) sulaikomas (arba pašalinamas mažiau) ir mažiau deguonies. O2)vartojamas dėl sumažėjusios alveolių funkcijos) patektų į rūgštinę būseną, dėl kurios padidėtų kalio kiekis kraujyje. Kalbant apie mažesnį albumino kiekį, palyginti su mūsų etaloniniu diapazonu, būtų galima tikėtis, kad albuminas padidės, reaguodamas į uždegiminę citokinų ekspresiją. Gali būti, kad mažesnis albumino kiekis atsirado dėl izoflurano vartojimo, kuris buvo parodytas anksčiau[122-124]. Kalbant apie gliukozės kiekį laikui bėgant, daugumos užsikrėtusių gyvūnų gliukozės koncentracija padidėjo, o tai rodo kortizolio sukeltą stresą, epinefrino sukeltą susijaudinimą arba insulino gamybos arba sekrecijos / receptorių sąveikos sutrikimą. Apibendrinant, įdomiausia šios analizės išvada buvo sumažėjusio deguonies kiekio, susijusio su padidėjusiu kalio kiekiu, pasiūlymas. Šie rezultatai rodo, kad kalio kiekio stebėjimas gali būti naudojamas plaučių uždegimui nustatyti per visą gyvenimąCOVID{0}}gyvūnų tyrimai. Toliau šis darbas taip pat gali būti naudojamas kuriant Sirijos žiurkėno SARS-CoV-2 infekcijos modelio pamatines vertes ir gali būti naudojamas atliekant terapinių vaistų patikrą.

Mūsų tyrimas suteikia svarbių įžvalgųSARS-CoV-2infekcija irCOVID{0}}ligos reguliavimas. Ikiklinikiniai modeliai yra kertinis biomedicininių tyrimų akmuo, suteikiantis galimybę eksperimentiškai išskirti ligos mechanizmus ir įvertinti galimas medicinines atsakomąsias priemones, įskaitant imunomoduliuojančius vaistus, antivirusinius vaistus ir vakcinas. KaipSARS-CoV-2Pirmą kartą pasirodė, kad mes turėjome ribotą supratimą apie patogenezės mechanizmus, neturėjome nustatytų terapinių ar profilaktikos priemonių ir neturėjome ikiklinikinio modelio, kuris būtų naudingas medicininių atsakomųjų priemonių atradimui. Nuo viruso atsiradimo laikų buvo padaryti didžiuliai šuoliai, ypač kuriant ikiklinikinį modelį, tačiau mūsų supratimas apieCOVID{0}}ir daugelis jo apraiškų vis dar riboti. Mūsų tyrimas patvirtino virusinį tropizmą ir kvėpavimo takų patologiją, anksčiau identifikuotą mūsųSARS-COV-2žiurkėnų tyrimai, bet taip pat galėjo išplėsti mūsų supratimą apie imuninį reguliavimą ir patogenezę kvėpavimo takuose ir už jos ribų.

Nuorodos

1. Zhuang Pinghui JW. Uhano pneumonija: kaip vyko paslaptingos ligos šaltinio paieškos South China Morning Post 2020. Galima rasti iš: https://www.scmp.com/news/china/society/article/ 3046233/Wuhan-pneumonia-how-search -išskleista šaltinis-paslaptis-liga.

2. Cucinotta D, Vanelli M. PSO pareiškiaCOVID{0}}pandemija. Acta Biomed. 2020 m.; 91(1):157–60. Epub 2020-03-20. https://doi.org/10.23750/abm.v91i1.9397 PMID: 32191675.

3. Petrosillo N, Viceconte G, Ergonul O, Ippolito G, Petersen E.COVID{0}}, SARS ir MERS: ar jie glaudžiai susiję? Clin Microbiol Infect. 2020 m.; 26(6):729–34. Epub 2020/04/03. https://doi.org/10.1016/j. cmi.2020.03.026 PMID: 32234451; PubMed Central PMCID: PMC7176926.

4. Medicina JHU. Coronavirus Resource Center 2021. Galima rasti iš: https://coronavirus.jhu.edu/.

5. Marshall M. Ilgalaikis koronaviruso tolimųjų vežėjų kančia. Gamta. 2020 m.; 585(7825):339–41. Epub 2020-09-16. https://doi.org/10.1038/d41586-020-02598-6 PMID: 32929257.

6. Gupta A, Madhavan MV, Sehgal K, Nair N, Mahajan S, Sehrawat TS ir kt. Ekstrapulmoninės apraiškosCOVID{0}}. Nat Med. 2020 m.; 26(7):1017–32. Epub 2020-07-12. https://doi.org/10.1038/s41591- 020-0968-3 PMID: 32651579.

7. Nikolich-Zugich J, Knox KS, Rios CT, Natt B, Bhattacharya D, Fain MJ.SARS-CoV-2irCOVID{0}}vyresnio amžiaus žmonėms: ko galime tikėtis dėl patogenezės, imuninio atsako ir rezultatų. Geroscience. 2020 m.; 42(2):505–14. Epub 2020/04/11. https://doi.org/10.1007/s11357-020-00186-0 PMID: 32274617; PubMed Central PMCID: PMC7145538.

8. PSO. Informacija vaikų sveikatos priežiūros paslaugų teikėjams, 2021 m. Galima rasti adresu https://www.cdc.gov/coronavirus/2019-ncov/hcp/pediatric-hcp.html.

9. Fu Y, Cheng Y, Wu Y. SupratimasSARS-CoV-2- Tarpininkaujantys uždegiminiai atsakai: nuo mechanizmų iki galimų terapinių priemonių. Virol Sin. 2020 m.; 35(3):266–71. Epub 2020/03/04. https://doi.org/ 10.1007/s12250-020-00207-4 PMID: 32125642; PubMed Central PMCID: PMC7090474.

Pastaba:aukščiau pateiktas ne visas nuorodų sąrašas