Ⅰ dalis. Maisto baltymų ir skaidulų kiekio poveikis žąsų augimui, podagrai, žarnyno mikrobų bendrijoms ir imunoreguliacijai žąsiukų žarnų inkstų ašyje
May 06, 2023
Abstraktus
Šiame tyrime buvo įvertintas mitybos baltymų ir skaidulų kiekio poveikis žąsų augimui, podagrai, žarnyno mikrobų bendruomenėms ir imunoreguliacijai žąsų žarnyno ir inkstų ašyje. Buvo priimtas visiškai atsitiktinis 2 £ 3 faktorinis modelis su 2 KP lygiais (180 [18 CP] ir 220 [22 CP] g/kg) ir 3 žalios pluošto (CF) lygiais (30 [mažas CF], 50 [vidutinis CF], ir 70 [didelis CF] g/kg). Dėl didelio CP arba mažo CF dietos žąsiukai buvo linkę sirgti podagra. Daug baltymų turinčios dietos pablogino inkstų funkciją; UA ir Cr koncentracija serume, taip pat XOD aktyvumas 9-dienų žąsiukų, šertų 22 proc. CP dieta, buvo žymiai padidėjusi. Nors CF lygis nuo 3 iki 7 procentų neturėjo tiesioginės įtakos inkstų sveikatai, didėjantis CF lygis gali pagreitinti probiotikų padidėjimą žąsų aklojoje žarnoje ir sulaikyti kenksmingas bakterijas, taip palengvinant žarnyno disbiozę, kurią sukelia dieta, kurioje gausu baltymų. Aklosios žarnos mikrobiotos analizė, naudojant 16Sr RNR seką, atskleidė, kad Enterococcus gausa 22CP grupėje buvo didesnė nei 18CP grupėje, bet mažėjo didėjant CF lygiui 9 d. Lactobacillus gausa didėjo didėjant CF lygiui. Be to, didesnė LPS ir priešuždegiminių citokinų koncentracija serume ir padidėjęs mRNR ekspresijos lygis aklųjų žarnų, tonzilių ir inkstų audiniuose parodė, kad dietos, kuriose gausu baltymų, gali suaktyvinti TLR4 / MyD88 / NFkB kelią ir sukelti žarnyno ir inkstų uždegimą jauniems žąsliams. Nustatyta, kad 9 d. LPS koncentracija serume mažėja didėjant CF, nors kintantys CF lygiai su maistu neturėjo tiesioginės įtakos žąsų imuninių rodiklių serume. Apibendrinant galima teigti, kad dieta su dideliu CP neigiamai paveikė podagros atsiradimą, mikrobų bendruomenes ir imunoreguliaciją žąsų žarnyno ir inkstų ašyje, o atitinkamai padidėjęs maistinių skaidulų kiekis padėjo išlaikyti žarnyno pusiausvyrą ir sumažino LPS koncentraciją serume. Siūlome 18 procentų CP ir 5 procentų CF dietą kaip optimalų derinį žąsų pašarams.
Raktažodžiai
žaliavinė ląsteliena, baltymai, žąsų podagra, žarnyno mikrobų bendruomenės, žarnyno ir inkstų ašis,Cistanche privalumai.
Spustelėkite čia, kad sužinotumėtekoks yra Cistanche poveikis inkstams
Įvadas
Žąsys, kurios yra žolėdžiai, priklauso nuo maistinių skaidulų, kad galėtų atlikti įprastą veiklą. Žinoma, kad vidutinis žalios skaidulos (CF) kiekis dietoje padidina atsparumą ligoms ir skatina naminių paukščių augimą, moduliuodamas žarnyno mikroekologinę pusiausvyrą ir stiprindamas imunines funkcijas (Jha ir Mishra, 2021) Wils-Plotz ir kt. (2013). pranešė, kad su maistu gaunamo pektino įtraukimas padidino IL- 12 ekspresijos reguliavimą klubinės žarnos gleivinėje ir padidino interferono g gamybą aklųjų žarnų tonzilėse. Keletas tyrimų parodė, kad mažo CF dieta sumažina mikrobų įvairovę ir santykinį naudingos mikrobiotos gausą žąsų aklojoje žarnoje 70 d., todėl neigiamai veikia šių žąsų augimą, maistinių medžiagų panaudojimą ir žarnyno gleivinės imunitetą (Li ir kt., 2017; Li ir kt., 2018a). Dietinis CF gali padėti išlaikyti žarnyno barjerinę funkciją, nes stiprina gleivinės struktūrą ir funkciją, taip pat didina komensalinių bakterijų populiaciją ir įvairovę virškinimo trakte. Dar svarbiau, kad jauni paukščiai yra jautresni mitybos maistinių medžiagų ir žarnyno mikrobų bendruomenių pokyčiams nei suaugusieji (Gao ir kt., 2017). Tačiau tyrimų apie dietinio CF kiekio poveikį žarnyno mikrobiotai ir žąsų atsparumui ligoms yra nedaug.
Paukščių augimas yra mažiau jautrus baltymų kiekio pokyčiams nei mitybos energijos pokyčiams pašaruose, kad būtų patenkintas jų pirminis savanoriškas pobūdis (Shi ir kt., 2006). Buvo pranešta, kad žąsų, kurių baltymų kiekis maiste svyravo nuo 16 iki 22 procentų, svorio padidėjimo reikšmingo skirtumo nepastebėta, o tai atrodo pernelyg bendra apimtimi (Summers ir kt., 1986). Ir atvirkščiai, baltymų koncentracijos maiste daro didelį poveikį naminių paukščių žarnyno floros pusiausvyrai ir atsparumui ligoms (Lee ir kt., 2020). Visceralinė podagra, kuria dažniausiai serga paukščiai, yra medžiagų apykaitos liga, kurią sukelia sutrikusi inkstų funkcija, vėliau įvairiuose organuose kaupiasi uratų kristalai (Zhang ir kt., 2018). Ankstesnis mūsų tyrimas parodė, kad daug baltymų turinčios dietos buvo susijusios su inkstų pažeidimu ir žarnyno mikrobiotos disbioze, susijusia su žąsų podagra (Xi ir kt., 2020a). Šio tyrimo rezultatai parodė, kad žąsiukai, šeriami 16 ir 18 procentų žalių baltymų (CP) dieta, žąsiukai, šeriami 22 procentų CP dietomis, patyrė žarnyno epitelio ląstelių pažeidimą ir aklųjų žarnų mikrobiotos disbiozę, dėl kurios buvo pažeisti inkstai ar net susirgo podagra. Atrodo, kad virškinimo trakto mikrobiota ir jos metabolitai atlieka pagrindinį vaidmenį stiprinant naminių paukščių žarnyno ir inkstų ašies imunitetą (De Cesare ir kt., 2019; Xi ir kt., 2020b). Taigi, tinkamos mitybos programos, kurioje dėmesys sutelkiamas į su maistu gaunamo CF ir CP lygio poveikį, nustatymas gali padėti sumažinti podagros dažnį ir sustiprinti imunitetą palaikant žarnyno mikroekologinę pusiausvyrą ir gerinant santykinį žąsų imuninį reguliavimą.
Žarnyno mikrobiomas daro didelį poveikį žarnyno imuninei reguliacijai, o tai paveikia sisteminį imunitetą ir prisideda prie imuninės pusiausvyros. Maisto sudėties pokyčiai, įskaitant CP ir CF lygius, turi įtakos mikrobiotos, kuri prisitaiko prie žarnyno aplinkos, sudėčiai ir metabolinei veiklai (Liu ir kt., 2014). Naminiams paukščiams bet koks mikrobiomo sutrikimas gali sukelti sisteminio imuniteto disbalansą ir sumažinti atsparumą ligoms. Ankstesniame mūsų tyrime nustatėme, kad žarnyno mikrobiotos disbiozė padidino žąsų visceralinės podagros riziką, padidindama uždegimą ir iš žarnyno gauto lipopolisacharido (LPS) perkėlimą į žarnyno ir inkstų ašį. Šioje sudėtingoje kaskadoje LPS ligavimas suaktyvina branduolinį faktorių, aktyvuotų B ląstelių (NF-kB) kelio kappa lengvosios grandinės stipriklį ir priešuždegiminių citokinų, tokių kaip interleukinas 1b (IL1b) ir naviko nekrozės faktorius, gamybą. a (TNFa), taip skatinant imunologinės tolerancijos vystymąsi žąsų žąsų žarnyne ir inkstuose (Xi ir kt., 2019). Šiame tyrime daugiausia dėmesio buvo skiriama mikrobų bendruomenėms, gyvenančioms žąsų, maitinamų skirtingu CP ir CF, aklojoje žarnoje, ir išmatuoti podagros pasireiškimo pokyčiai, analizuojant imunoreguliaciją ir uždegiminius atsakus, sukeltus žarnyno ir inkstų ašyje.
Standartizuota Cistanche
medžiagos ir metodai
1. Etinis patvirtinimas
Tyrimą patvirtino Dziangsu žemės ūkio mokslų akademijos tyrimų komitetas ir jis buvo atliktas vadovaujantis Eksperimentinių gyvūnų reikalų administravimo reglamentu (2014 m. liepos 8 d. Jiangsu žemės ūkio mokslų akademijos įsakymas Nr. 63). Visi eksperimentai buvo atlikti pagal ARRIVE (Animal Research: Reporting of In Vivo Experiments) gaires.
2. Eksperimentinis dizainas
Šis tyrimas buvo atliktas lapkričio 2–17 d., 2020, Jiangsu žemės ūkio mokslų akademijos Eksperimentinių gyvūnų centre (Nandzingas, Kinija). Iš viso 1,620 vienadienių Taidžou žąsų (Anser domestica, 100 proc.), tiekiamos Tianzhijiao Breeding Geese Limited Company (Chuzhou, Kinija), buvo atsitiktinai priskirtos 6 eksperimentinės grupės. Kiekvienas gydymas turėjo 6 pakartojimus, o kiekviename pakartojime buvo 45 paukščiai. Eksperimentui buvo naudojamas visiškai atsitiktinis 2 £ 3 faktorinis dizainas. Buvo paruoštos šešios dietos su 2 CP lygiais ir trimis CF lygiais (1 lentelė). 2 KP lygiai buvo 18 0 (18 CP) ir 22 0 (22 CP) g/kg, o trys CF lygiai buvo 30 (mažas CF), 50 (vidutinis CF) ir 70 (aukštas). CF) g/kg. Visi žąsiukai buvo auginami termostatiniame namelyje su vienodo dydžio nerūdijančio plieno narvais (1,20 £ 1,00 £ 0,50 m3, 9 žąsiukai narve, gyvulių tankumas: 7,5 paukščio/m2), kurie buvo pastatyti 0,50 m virš žemės. Žąsiukai buvo šeriami standartinėmis valdymo sąlygomis granulėmis ir ad libitum vandeniu. Viso tyrimo metu kiekviename narve pakako pakabinamų tiektuvų ir girdyklių su speneliais. Aplinkos temperatūra buvo palaikoma 30 laipsnių nuo d 0 iki 3, 29 laipsniai nuo d 4 iki 6, 28 laipsniai nuo d 7 iki 9 ir 26 laipsniai nuo d 10 iki eksperimento pabaigos. Santykinė oro drėgmė per 21-d eksperimentinį laikotarpį buvo maždaug 60 proc. Šviesos šaltiniai (balta šviesa, 400–760 nm) buvo suvienodinti iki 15 § 0,3 liukso apšvietimo paukščio galvos lygyje, o šviesos grafikas buvo 22 h šviesa nuo d 0 iki 3, 18 h šviesa nuo d 4–14 ir 16 h šviesos nuo 15 iki 21 d. 24-h ciklu.
The basal diet was formulated to meet or exceed National Research Council (NRC, 1994) nutrient requirements for growing geese. The composition of experimental diets is presented (Table 1). Dietary samples (>1 proc. šviežių pašarų), atsitiktinai gautų iš 5 vietų, buvo sumaišyti analizei. CP ir CF buvo išmatuoti pagal GB/T6432 (Kinijos nacionalinis standartas: žalių baltymų nustatymas pašaruose) ir GB/T6434 (Kinijos nacionalinis standartas: žalios ląstelienos nustatymas pašaruose).
Žąsų ADFI ir BW (gyvasis svoris) buvo užregistruoti naudojant elektronines svarstykles (YP60001, Hengji, Šanchajus, Kinija) prieš šėrimą bandymo metu, o ADG ir pašarų konversijos koeficientas (FCR) buvo apskaičiuotas eksperimento pabaigoje. Be to, pasibaigus eksperimentiniam laikotarpiui, buvo sumuojamas visų pakartojimų (kiekvienoje pakartojime buvo 45 paukščiai) bendras sergamumas podagra tarp skirtingų gydymo būdų. Podagros atrankos standartas buvo apibrėžtas kaip žąsiukas, turintis didelių inkstų pažeidimų ir šlapimo rūgšties (UA) koncentracija serume viršija ribinę uratų pertekliaus vertę (patinas, 416 mmol/l, o patelė – 357 mmol/l). Tipiški vyraujantys stambūs inkstų pažeidimai yra blyškūs, margi ir patinę, o inkstų kanalėliai ir šlapimtakiai yra išsiplėtę dėl uratų pertekliaus (Xi ir kt., 2020a).
Herba Cistanche
3. Serumo metabolito matavimas
Trisdešimt šeši žąsiukai (n=6 žąsiukai per gydymą) buvo atsitiktinai atrinkti nedelsiant paimti kraują (5 ml vienam žąsiui) po galvos nukirtimo per kraujo paėmimo mėgintuvėlius be antikoagulianto atitinkamai 9 ir 18 d. Visi kraujo mėginiai buvo inkubuojami 37 laipsnių temperatūroje 2 valandas po paėmimo ir centrifuguojami esant 1,5{{10}}0 £ g 15 min. Gauti serumai buvo laikomi 0, 6 ml Eppendorf mėgintuvėliuose 80 laipsnių temperatūroje iki tolesnės analizės. UA kiekis serume buvo nustatytas naudojant fosfotungsto rūgšties kolorimetriją. Kreatinino (Cr) ir karbamido azoto (JT), taip pat ksantino oksidazės (XOD) aktyvumo koncentracijos buvo nustatytos fermentine kolorimetrija, naudojant mikroplokštelės spektrofotometrą (Promega Corporation, Madison, WI). Šiuos rinkinius tiekė Jiancheng bioinžinerijos institutas (Nandzingas, Kinija); kodai buvo C012 (UA), C011-2 (Cr), C013-2 (UN) ir A002 (XOD). IgM, IgA ir IgG koncentracijos eksperimentinėse žąsyse buvo išmatuotos naudojant žąsų imunoglobulino ELISA rinkinius, įsigytus iš Shanghai J&I Biotechnology Co., Ltd (Šanchajus, Kinija). Serumo cirkuliuojantys imuniniai kompleksai (CIC), IL-1b ir TNF-a koncentracija buvo nustatyti naudojant komercinį žąsies ELISA rinkinį (Jiancheng Bioinžinerijos institutas, Nankinas, Kinija). Diamino oksidazės (DAO) aktyvumas buvo matuojamas fermentine kolorimetrija, naudojant automatinį biocheminį analizatorių (Hitachi, Tokijas, Japonija). Serumo LPS buvo matuojamas naudojant tradicinį Limulus tyrimą (Limulus Assay Biotechnology Company Ltd., Xiamen, Kinija). LPS aptikimo diapazonas Limulus tyrime svyravo nuo 0,015 iki 0,6 EU/mL. Visos medžiagos, naudojamos kraujo paėmimui ir endotoksinų matavimui, buvo be pirogenų. Visi tyrimai buvo atlikti pagal gamintojo instrukcijas. Serumo mėginiai buvo tiriami trimis egzemplioriais. Tyrimų vidiniai ir tarplaboratoriniai variacijos koeficientai buvo<10% and <15%, respectively.
4. Histomorfologinis stebėjimas
36 žąsiukų (n=6 žąsiukų per gydymą) akloji žarna (ilgis {0}} cm) buvo paimta 9 ir 18 dienomis paėmus kraujo mėginius histologinei analizei. Mėginiai, paimti iš žąsiukų, buvo fiksuoti 4 procentų paraformaldehidu, įterpti į parafiną ir padalinti į dalis (griežinėlio storis: 3 mm; 4 griežinėliai vienam žąsiui). Šviesos mikroskopu (OLYMPUS, Tokijas, Japonija) tirti patologiniai aklosios žarnos pakitimai (maždaug 7 cm distaliau nuo pylorinio sfinkterio) po dažymo hematoksilinu ir eozinu (HE). Aklosios žarnos storio aukštis ir kriptos gylis buvo išmatuoti naudojant „ImageJ“ programinę įrangą (1.8.0 versija; Nacionaliniai sveikatos institutai, Bethesda, MD). Buvo užfiksuoti aštuoni skirtingų nepažeistų gaurelių matavimai vienoje pjūvėje (8 matavimai 3 iš eilės regėjimo laukuose). Statistinė histologinių matavimų analizė buvo atlikta remiantis vidutiniškai 32 matavimais vienam žąsiui (4 griežinėliai vienam žąsiui ir 8 matavimai vienam žąsiui). Taurės ląstelių tankis buvo apskaičiuotas kaip taurės ląstelių skaičius, padalytas iš atitinkamo gaurelio ilgio, kuris vėliau buvo apskaičiuotas ir išreikštas kaip taurės ląstelių skaičius 100 mm gaurelio ilgio.
Cistanche tubulosa
5. Cecum turinio 16S rRNR sekos nustatymas
Žąselių aklosios žarnos turinys (6 žąsiukai/gydymas, 6 £ 6 grupės £ mėginių ėmimas du kartus=72 žąsiukų) buvo surinktas 9 ir 18 dieną į 2 ml sterilius kriogeninius buteliukus su vidiniu sriegiu ir nedelsiant laikomas skystame azote 16S rDNR analizei atlikti. . DNR iš aklosios žarnos turinio mėginių buvo išskirta naudojant MicroElute Genomic DNA Kit (D3096-01, Omega Biotek Inc., Norcross, GA) pagal gamintojo instrukcijas. Mėginių ruošiniai, sudaryti iš nepanaudotų tamponų, buvo apdoroti ekstrahuojant DNR, ir buvo patikrinta, ar jie nesukuria 16S amplikono. Visa DNR buvo išplauta 50 ml eliuavimo buferio naudojant modifikuotą gamintojo aprašytą procedūrą (QIAGEN, Diuseldorfas, Vokietija) ir laikoma 80 laipsnių temperatūroje.
Naudodami bendrą mėginių DNR kaip šabloną ir 16S rDNR pradmenis (343F - 50 - TACGGRAGGCAGCAG -30; 798R - 50 - AGGGTATCTAATCCT-30), amplifikavome bakterijos V3–V4 sritį. 16S rRNR. Visos reakcijos buvo vykdomos 25 ml (bendras tūris) mišinyje, kuriame buvo 25 ng genominės DNR ekstrakto, 12,5 ml PGR premikso, 2,5 ml kiekvieno pradmens ir PGR lygio vandens, kad būtų galima sureguliuoti tūrį. PGR produktai buvo normalizuoti naudojant AxyPrep Mag PCR normalizatorių (Axygen Biosciences, Union City, CA), kuris leido praleisti kiekybinio nustatymo etapą, neatsižvelgiant į sekos nustatymui pateiktą PGR tūrį. Amplicon baseinai buvo paruošti sekos nustatymui naudojant AMPure XT granules (Beckman Coulter Genomics, Danvers, MA; atliko OebioTech Co., Ltd, Šanchajus, Kinija). Amplikonų bibliotekos dydis ir kiekis buvo įvertinti atitinkamai naudojant LabChip GX (Perkin Elmer, Waltham, MA) ir Kapa Library Quantification Kit for Illumina (Kapa Biosciences, Woburn, MA). PhiX Control biblioteka (v3) (Illumina) buvo sujungta su amplikonų biblioteka (tikimasi 30 proc.). Biblioteka buvo sugrupuota maždaug 570 K/mm2 tankiu. Bibliotekos buvo suskirstytos pagal 300PE MiSeq paleidimus, kai viena biblioteka buvo sekvenuota abiem protokolais naudojant standartinius Illumina sekos pradmenis, taip pašalinant trečiojo (arba ketvirto) indekso skaitymo poreikį. Skaitymai buvo filtruojami naudojant kiekybines įžvalgas apie mikrobų ekologijos (QIIME;) kokybės filtrus. CDHIT dujotiekis buvo naudojamas operaciniams taksonominiams vienetams (OTU) parinkti, parengiant OTU lentelę. OTU buvo priskirtos 97 procentų panašumo sekos. Kiekvienai OTU buvo parinktos reprezentacinės sekos, o taksonominiai duomenys buvo priskirti kiekvienai reprezentacinei sekai, naudojant ribosomų duomenų bazės projekto (RDP) klasifikatorių. Šių OTU nukleotidų sekų GenBank prisijungimo numeris yra SAMN21014082. Norint įvertinti alfa įvairovę, OTU lentelė buvo retinama ir apskaičiuotos šios 4 metrikos: Chao1 metrika turtingumui įvertinti; stebimų rūšių metrika kaip unikalių mėginyje rastų OTU skaičius; Šenono indeksas; ir Simpsono indeksą.
6. Realaus laiko PGR
9 ir 18 d. buvo renkami žąsiukai (n {{0}} žąsiukai per gydymą) realaus laiko PGR (RT-PGR) analizei. Visa RNR buvo išgauta iš audinių, naudojant TRIzol reagentą (Life Technologies, Grand Island, NY), ir atvirkštinė transkribuota naudojant Reverse Transcription Levels rinkinį (TaKaRa, Dalian, Kinija), pagal gamintojo protokolą. b-aktinas buvo naudojamas kaip nekintama kontrolė. Gruntai buvo sukurti naudojant Primer Premier 5.0 programinę įrangą, o jų sekos yra išvardytos (2 lentelė). RT-PCR buvo atlikta naudojant SYBR Premix Ex Taq (Roche, Bazelis, Šveicarija). Visi RT-PCR buvo atlikti trimis egzemplioriais. Santykiniai tikslinių genų ekspresijos lygiai buvo nustatyti naudojant 2 DDCt metodus.
7. Duomenų analizė
Eksperimentiniai duomenys, gauti iš 6 pakartojimų vieno gydymo metu, buvo analizuojami naudojant IBM SPSS Statistics 16 programą (IBM Corporation, Somers, NY). Kiekvienas pakartojimas buvo laikomas eksperimentiniu vienetu, o naudojama statistinė procedūra buvo daugiamatė dispersijos analizė, naudojant bendrąją linijinio modelio procedūrą (GLM). Kai buvo nustatyti reikšmingi skirtumai, gydymo priemonės buvo atskirtos ir palygintos naudojant Duncan kelių diapazonų testą. Dviejų krypčių testas buvo laikomas statistiškai reikšmingu, kai tikimybės lygis buvo mažesnis nei 5 procentai (P < 0,05).
Yumeng Xi *, Yuanpi Huang, y Yue Li *, Yunmao Huang #, Junshu Yan * ir Zhendan Shi *.
* Žemės ūkio ir kaimo reikalų ministerijos pagrindinė augalininkystės ir gyvulininkystės integruoto ūkininkavimo laboratorija, Gyvulininkystės institutas, Jiangsu žemės ūkio mokslų akademija, Nankinas 210014, Kinija;
# Gyvūnų mokslo koledžas, Zhongkai žemės ūkio ir inžinerijos universitetas, Guangdžou 510000, Kinija.