1 DALIS A Cistanches Herba frakcija/𝛽-sitosterolis sukelia redoksui jautrią mitochondrijų atsijungimo indukciją ir nuo adenozino monofosfato priklausomo baltymo kinazės/peroksisomų proliferatoriaus aktyvuoto receptoriaus aktyvavimą 🌿 Sumažinimo efektas

Hoi Shan Wong, Jihang Chen, Pou Kuan Leong, Hoi Yan Leung, Wing Man Chan ir Kam Ming Ko

Gyvybės mokslų skyrius, Honkongo mokslo ir technologijos universitetas, Kowloon, Honkongas

Correspondence should be addressed to Kam Ming Ko; bcrko@ust.hk

Gauta 2014 m. rugpjūčio 29 d.; Priimta 2015 m. sausio 14 d. Akademinis redaktorius: Man Li Autoriaus teisės © 2015 m.

Hoi Shan Wong ir kt. Tai yra atviros prieigos straipsnis, platinamas pagal Creative Commons Attribution License, kuris leidžia neribotai naudoti, platinti ir dauginti bet kokioje laikmenoje, jei originalus darbas yra tinkamai cituojamas. Ankstesni tyrimai parodė, kad HCF1, pusiau išgryninta frakcijaCistanches Herba, sumažina įprastą mitybą ir daug riebalų turinčių dietų maitinamų pelių svorį. Svorio sumažėjimas buvo susijęs su mitochondrijų atsijungimo indukcija ir metabolinių fermentų aktyvumo pokyčiais pelių skeleto raumenyse. Siekiant toliau tirti biocheminį mechanizmą, kuriuo grindžiamas HCF1- sukeltas svorio mažinimas, buvo ištirtas HCF1 ir jo aktyvaus komponento ½-sitosterolio (BSS) poveikis C2C12 miotubams. Inkubavimas su HCF1 / BSS sukėlė trumpalaikį mitochondrijų membranos potencialo (MMP) padidėjimą, galbūt dėl ​​​​mitochondrijų vidinės membranos suskystinimo. MMP padidėjimas buvo lygiagretus mitochondrijų reaktyviųjų deguonies rūšių (ROS) gamybos padidėjimui. Savo ruožtu mitochondrijų ROS sukėlė redoksui jautrų mitochondrijų atsiejimo indukciją, atjungdamas 3 baltymą (UCP3). Biocheminė analizė parodė, kad HCF1 galėjo suaktyvinti nuo adenozino monofosfato priklausomą baltymų kinazės / peroksisomų proliferatoriaus aktyvuoto receptoriaus 👍 koaktyvatoriaus-1 kelią ir taip padidino citochromo c oksidazės ir UCP3 ekspresiją. Tyrimai su gyvūnais, naudojant mitochondrijų jungtį, taip pat patvirtino mitochondrijų atsiejimo vaidmenį HCF{16}}sukeltam svorio mažėjimui. Apibendrinant galima teigti, kad HCF1/BSS sukelia redoksui jautrų mitochondrijų atsiejimo indukciją ir AMPK/PGC -1 aktyvavimą C2C12 miotubuose, dėl to sumažėja kūno svoris ir sumažėja riebalų kiekis dėl padidėjusio energijos suvartojimo.

Norėdami gauti daugiau informacijos, kreipkitės:Joanna.jia@wecistanche.com

Cistanche deserticola turi daug efektų, spustelėkite čia, kad sužinotumėte daugiau

1. Įvadas

Nutukimas, kuris apibrėžiamas kaip nenormalus kūno riebalų kaupimasis, iškilo kaip grėsmė visuomenės sveikatai. Nepriklausomai nuo metaboliškai sveikų ar sutrikusios medžiagų apykaitos sąlygų, nustatyta, kad nutukimas yra susijęs su padidėjusia gretutinių ligų ir mirtingumo rizika [1]. Centrinis nutukimas, cholesterolio profilio anomalijos ir trigliceridų koncentracijos padidėjimas plazmoje, kurie yra bendri nutukusių asmenų bruožai, prisideda prie didelio 2 tipo cukrinio diabeto, širdies ir kraujagyslių ligų, mirties nuo širdies ir kraujagyslių ligų bei su nutukimu susijusių vėžio atvejų tarp nutukusių asmenų. 2]. Todėl kūno svorio ir nutukimo mažinimas buvo laikomas pagrindiniu su nutukimu susijusių padarinių sveikatai prevencijai. Nutukimo valdymas daugiausia pabrėžia optimalaus energijos balanso nustatymą didinant energijos sąnaudas ir (arba) mažinant energijos suvartojimą. Gyvenimo būdo keitimas, įskaitant fizinio aktyvumo didinimą ir sveikos mitybos modelių ugdymą, paprastai laikomas saugiu svorio metimo būdu. Tačiau paprastai buvo nustatyta, kad tokie metodai yra neveiksmingi Hindawi Publishing Corporation įrodymais pagrįstos papildomos ir alternatyvios medicinos tomas 2015 m., Straipsnio ID 142059, 12 puslapių http://dx.doi.org/10.1155/2015/1420592 Complementary and Based Alternatyvi medicina, skirta padidinti energijos sąnaudas arba sumažinti suvartojamos energijos kiekį [3]. Todėl šiuo metu aktyviai tiriamos strategijos, pagrįstos farmakologinių agentų vartojimu. Šiuo atžvilgiu mūsų ankstesnė išvada parodė, kad HCF1, pusiau išgryninta frakcijaCistanchesHerba(džiovintas visas augalas išCistanche deserticolaĮrodyta, kad YC Ma tradicinėje kinų medicinoje apibūdinama kaip „jangą gaivinanti“ tonizuojanti žolė), buvo veiksminga užkertant kelią dietos sukeltam nutukimui ir su juo susijusiems medžiagų apykaitos sutrikimams [4]. Vartojant per burną HCF1, normalia dieta (ND-) ir riebia dieta (HFD-) maitinamų pelių svoris sumažėjo, galbūt dėl ​​to, kad skeleto raumenyse atsiskyrė mitochondrijos, o tai padidino energijos sąnaudas [4] ]. Tačiau mechanizmas, kuriuo grindžiamas toks HCF{10}}sukeltas mitochondrijų atsiejimas (taigi ir svorio sumažėjimas), lieka neaiškus. Mitochondrijų atjungimas išsklaido protonų gradientus, įvesdamas alternatyvų protonų laidumo kelią per vidinę mitochondrijų membraną (IMM), dėl to sumažėja mitochondrijų membranos potencialas ir mitochondrijų ATP susidarymas. Šis bergždžias protonų pernešimo ciklas sunaudoja didelę medžiagų apykaitos energijos dalį įvairiuose audiniuose ir yra atsakinga už didelę kasdienių energijos sąnaudų dalį, o vėliau sunaudojama daugiau kuro molekulių (pvz., riebalų rūgščių), todėl mažėja svoris ir. nutukimo sumažėjimas [5, 6]. Norint patvirtinti HCF1 sukeltą mitochondrijų atjungimo efektą, HCF1 poveikis MMP ir UCP3 ekspresijai buvo tiriamas C2C12 miotubuose, kurie yra diferencijuotos raumenų ląstelės, gautos iš C3H pelių šlaunies raumenų. Mūsų tikslas buvo ištirti biocheminį mechanizmą, kuriuo grindžiamas HCF1 suteikiamas svorio mažinimas. Palyginimui taip pat buvo tiriamas aktyvus HCF1 komponentas -sitosterolis (BSS). Galimas mitochondrijų atsiejimo poveikis HCF1-sukeltam HFD maitinamų nutukusių pelių svorio sumažėjimui buvo toliau tiriamas kartu su HCF1 skiriant cheminiu jungikliu 6-ketocholestanoliu (kCh). Nuo adenozino monofosfato priklausoma baltymų kinazė (AMPK), visur ekspresuojama serino / treonino baltymų kinazė, yra svarbus ląstelių energijos apykaitos kontrolės centras. Po aktyvavimo AMPK integruoja vidinius / tarpląstelinius signalus ir sukelia ląstelių atsakus per įvairias ląstelių signalizacijos kaskadas [7, 8]. AMPK gali moduliuoti ląstelių metabolizmą, reguliuodamas metabolinių fermentų aktyvumą tiesioginiu fosforilinimo būdu. AMPK taip pat sukelia ilgalaikį poveikį transkripcijos lygmeniu, fosforilinant peroksisomų proliferatoriaus aktyvuotą receptorių koaktyvatorių-1 (PGC-1), o tai lemia prisitaikančius genų ekspresijos pokyčius, susijusius su energijos apykaita ir mitochondrijų funkcija. [9, 10]. Šiuo atžvilgiu taip pat ištyrėme HCF1/BSS poveikį AMPK/PGC-1 signalizacijos keliui C2C12 miotubuose.

cistanchedeserticola nauda

2. Medžiagos ir metodai

2.1. Žolelių ekstrahavimas.

Cistanches Herba, džiovintas visas augalasCistanche deserticolaYC Ma (Orobanchaceae) buvo įsigytas iš vietinio vaistažolių pardavėjo (Lee Hoong Kee). Žolės autentiškumą patvirtino tiekėjas, o kupono pavyzdys (HKUST00301) buvo deponuotas Honkongo mokslo ir technologijų universiteto (HKUST) Gyvybės mokslų skyriui. ACistanchesŽolelių ekstraktas buvo gautas etanoliu ekstrahuojant sumaltą augalinę medžiagą, kaitinant su grįžtamu šaldytuvu 78 °C temperatūroje 2 valandas, kaip aprašyta anksčiau [11], išeiga 14 procentų (m/m). Ekstraktas toliau frakcionuojamas naudojant silikagelio chromatografiją [12]. HCF1 buvo gautas 1,14 % (m/m) išeiga. Ekstraktas džiovinamas išgarinant tirpiklį sumažintame slėgyje 50 °C temperatūroje, o džiovintas ekstraktas prieš naudojimą buvo laikomas -20 °C temperatūroje.

2.2. Chemikalai.

Anti-𝛽-aktino antikūnas, BSS (CAS 83-46- 5), proteazės inhibitorių kokteilis ir fosfatazės inhibitoriaus kokteilis 3 buvo įsigyti iš Sigma (St Louis, MO). Anti-AMPK𝛼1/2 antikūnas, anti-p-AMPK𝛼1/2 antikūnas, anti-PGC-1 (H-300) antikūnas, anti-UCP3 (E-18) antikūnas, {{16} [4- (2-piperidin-1-il-etoksi)-fenil)]-3-piridin-4-il-pirazolo[1,5-a ]-pirimidinas (CC) ir 6-ketocholestanolis (kCh) buvo įsigyti iš Santa Cruz Biotechnology (Santa Krusas, Kalifornija, JAV). Anti-COX antikūnas buvo nupirktas iš Cell Signaling (Danvers, MA). Anti-lamino B1 antikūnas buvo nupirktas iš Abcam (Kembridžas, MA). Bio-Rad tyrimo reagentas buvo įsigytas iš Bio-Rad Laboratories (Richmond, CA, JAV). Visos kitos cheminės medžiagos buvo perkamos iš Sigma (St. Louis, MO, JAV).

2.3. Ląstelių kultūros.

C2C12, C3H pelių skeleto raumenų gautą mioblastų kultūrą [13] iš Amerikos tipo kultūrų kolekcijos (ATCC), maloniai pateikė profesorius Zhenguo Wu (Gyvybės mokslų skyrius, HKUST). Ląstelių linija buvo kultivuojama Dulbecco modifikuotoje Eagle terpėje (DMEM) (Gibco BRL Life Technologies, Grand Island, NY), papildyta 10 procentų (t/v) galvijų vaisiaus serumo (FBS), 100 TV/mL penicilino ir 100 𝜇g. /mL streptomicino ir 17 mM NaHCO3. C2C12 mioblastų diferenciacija į C2C12 miotubelius buvo paskatinta pakeičiant visą auginimo terpę diferenciacijos terpe, kurioje vietoj 10 procentų (t/v) FBS yra 2 procentai (t/v) arklio serumo (HS). Ląstelės buvo auginamos 5 procentų (t/v) CO2 atmosferoje 37 C temperatūroje.

Cistancheturisvorio metimo efektas

2.4. Biocheminė analizė C2C12 miotubuose

2.4.1. MMP.

Mitochondrijų membranos potencialas buvo išmatuotas naudojant fluorescencinį katijoninį dažiklį 5,5,6,6 -tetrachloro- 1,1,3,3 -tetraetilbenzimidazolil-karbocianino jodidą (JC- 1). [14]. Ląstelės buvo auginamos 10 × 104 ląstelių tankiu 96-šulinėlių mikrotitravimo plokštelėse. Po stabilaus prisitvirtinimo ląstelės buvo iš anksto nudažytos 20 µM JC-1 (ištirpsta auginimo terpėje) 37 ∘ C temperatūroje 10 min. Po išankstinio dažymo ląstelės du kartus plaunamos Hanko subalansuotu druskos tirpalu (HBSS), papildytu 0, 1 procento galvijų serumo albumino (BSA). MMP matavimas buvo pradėtas pridedant HCF1/BSS turinčios terpės. JC-1 molekulių J agregato, susidarančio didelio membranos potencialo mitochondrijų vidinėje membranoje, kiekis buvo nustatytas stebint JC-1 raudonąją fluorescenciją (Ex 485 nm/Em 580 nm) Įrodymai -Pagrįsta papildoma ir alternatyvia medicina 3 37 °C temperatūroje 1 val. MMP buvo įvertintas iš tiriamų mėginių fluorescencijos intensyvumo atėmus tuščiųjų mėginių (ty tik su terpe) fluorescencijos intensyvumą. HCF1 / BSS inkubuotų ląstelių MMP vertės buvo normalizuotos su atitinkamomis ne HCF1 / BSS inkubuotomis kontrolinėmis vertėmis ir išreiškiamos kaip kontrolė procentais.

2.4.2. Nuo adenozino monofosfato priklausomos baltymų kinazės (AMPK) aktyvinimas.

C2C12 miotubeliai buvo pasėti (1,5 × 105 ląstelės) į 6-šulinėlių mikrotitravimo plokšteles. Po stabilaus pritvirtinimo ląstelės buvo iš anksto inkubuojamos su HCF1 / BSS turinčia terpe 8 valandas. Po to iš anksto inkubuotos ląstelės buvo lizuojamos su 300 µl natrio dodecilsulfato (SDS-) lizės buferio (20 mM Tris-Cl, 2 mM etilendiaminotetraacto rūgšties (EDTA), 3 mM etilenglikolio tetraacto rūgšties (EGTA), 1 proc. v) Triton X- 100, 10 procentų (m/t) glicerolio, 5 procentų SDS, 1 mM ditiotreitolio (DTT), proteazės inhibitorių kokteilio ir fosfatazės inhibitorių kokteilio 3, pH 7,5). Lizatas toliau centrifuguojamas 12 000 × g 4 ° C temperatūroje 10 minučių, kad būtų pašalintos ląstelių liekanos. AMPK aktyvacijos mastas buvo įvertintas pagal santykinį fosforo-AMPK𝛼 (p-AMPK) ir AMPK𝛼 santykį Western blot analize, naudojant anti-p-AMPK𝛼1/2 antikūnus ir anti-AMPK𝛼1/2 antikūnus po SDS-PAGE analizės. 10 procentų (t/v) akrilamido atskyrimo gelis. Ląstelių lizatas (20 𝜇g) buvo įdėtas ir 𝛽-aktinas buvo naudojamas kaip atskaitos žymuo. Imuniniu būdu nudažytos baltymų juostos buvo analizuojamos densitometrijos metodu (Quantiscan, Biosoft), o p-AMPK ir AMPK kiekiai (savavališki vienetai) buvo normalizuoti, atsižvelgiant į ½-aktino lygį (savavališki vienetai) mėginyje.

2.4.3. PGC-1 Branduolinė translokacija.

C2C12 miotubeliai buvo auginami 2.0×106 ląstelių tankiu 100 mm auginimo plokštelėse. Po 8 valandų HCF1/BSS išankstinio inkubavimo ląstelės buvo tripsinizuojamos ir inkubuojamos su 1 ml ledo šalto hipotoninio buferio (10 mM HEPES, 1,5 mM KCl ir 1,5 mM MgCl2, pH 7,9) 4 °C temperatūroje 10 min. Po inkubacijos ląstelės buvo surinktos centrifuguojant 500 x g 4 ° C temperatūroje 10 minučių. Surinktos ląstelės buvo resuspenduojamos 300 µl hipotoniniame buferyje, papildytame 0,5 mM DTT, 0,1 % (m/v) nonilfenoksi-polietoksietanolio (NP-40) ir proteazės inhibitorių kokteiliu, kad būtų lengviau išgauti tirpius citozolinius baltymus. . Gautas lizatas buvo centrifuguojamas 12 000 × g 4 ° C temperatūroje 1 minutę, kad būtų gautos citozolinės (supernatanto) ir branduolinės (granulių) frakcijos. Branduoliniai baltymai buvo izoliuoti, granules inkubuojant su 25 µl ledo šalto hipertoninio buferio (20 mM HEPES, 25 % (m/t) glicerolio, 400 mM NaCl, 1,5 mM MgCl2, 0,2 mM EDTA, 0, 5 mM DTT. proteazės inhibitorių kokteilis, pH 7,9) 4 °C temperatūroje 30 min., po to centrifuguojamas 12000 xg 4 °C temperatūroje 5 min. PGC-1 branduolio translokacijos mastas buvo įvertintas pagal santykinį PGC-1 lygio santykį citozolinėse ir branduolinėse frakcijose, naudojant Western blot analizę po SDS-PAGE analizės, kaip aprašyta aukščiau. Buvo pakrauta ir citozolinė, ir branduolinė frakcija (20 𝜇g), o 🌿aktinas ir laminas B1 buvo naudojami atitinkamai kaip citozoliniai ir branduoliniai etaloniniai žymenys. PGC-1 kiekiai (savavališki vienetai) buvo normalizuoti, atsižvelgiant į atitinkamai 𝛽-aktino ir lamino B1 lygius (savavališki vienetai) mėginyje.

2.4.4. Mitochondrijų atsiejamo baltymo 3 (UCP3) ir citochromo c oksidazės (COX) ekspresija.

C2C12 miotubeliai buvo pasėti (20 × 106 ląstelės) į 100 mm auginimo plokšteles. Po stabilaus pritvirtinimo ląstelės buvo iš anksto inkubuojamos su HCF1 / BSS turinčia terpe 37 C temperatūroje 48 valandas. Pašalinus HCF1 / BSS turinčią terpę, ląstelės buvo tripsinizuojamos ir lizuojamos pridedant 300 ml SDS lizės buferio. Ląstelių lizatas buvo centrifuguojamas 12 000 × g 4 ° C temperatūroje 10 minučių, kad būtų pašalintos ląstelių liekanos. UCP3 ir COX lygiai supernatante buvo nustatyti Western blot analize, naudojant anti-UCP3 (E- 18) antikūnus ir anti-COX antikūnus, atlikus SDS-PAGE analizę, kaip aprašyta aukščiau. Ląstelių lizatas (50 𝜇g) buvo pakrautas, o 𝛽-aktinas buvo naudojamas kaip etaloninis žymeklis. UCP3 ir COX kiekiai (savavališki vienetai) buvo normalizuoti, atsižvelgiant į ½-aktino lygį (savavališki vienetai) mėginyje.

2.5. Gyvūnų priežiūra.

ICR pelės (8 savaites; nuo 30 iki 35 g patinams ir nuo 25 iki 30 g patelėms) buvo laikomos 12 valandų tamsos/šviesos ciklu oro/drėgmės kontroliuojamoje aplinkoje, maždaug 22 °C temperatūroje ir leido valgyti bei vandenį ad libitum. Honkongo mokslo ir technologijų universiteto (HKUST) gyvūnų ir augalų priežiūros įstaigose (APCF). Visas eksperimentines procedūras patvirtino Mokslinių tyrimų praktikos komitetas (HKUST) (gyvūnų protokolo patvirtinimo numeris 2013049; patvirtinimo data: 2013 m. rugsėjo 25 d.; eksperimento trukmė: 3 metai).

2.6. Gydymo protokolas.

Norint ištirti 6-ketocholestanolio (kCh) poveikį HCF1- sukeltam HFD maitinamų pelių svorio sumažėjimui, gyvūnai buvo atsitiktinai suskirstyti į 6 grupes, kiekvienoje po 10–15 pelių: (1 ) normalios mitybos (ND, 13 proc. energijos gaunama iš riebalų, pirkta iš LabDiet, produkto numeris 5010) kontrolė; (2) ND plius kCh (kai paros dozė yra 9 mg/kg); (3) HFD (60 proc. energijos gaunama iš riebalų; pirkta iš Research Diet Inc., produkto numeris D12492) kontrolė; (4) HFD plius HCF1 (vartojant 45 mg/kg paros dozę); (5) HFD plius kCh; ir (6) HFD plius HCF1 plius kCh. Nustatyta, kad HCF1, vartojant 45 mg/kg paros dozę, žymiai sumažino pelių patinų svorį [4], o kCh, vartojant 9 mg/kg paros dozę, panaikino HCF1- sukeltas atjungimo efektas mitochondrijose, išskirtose iš pelių skeleto raumenų (duomenys nerodomi). Gyvūnams į skrandį buvo skiriama kCh, HCF1 arba HCF1/kCh 5 dienas per savaitę 8 savaites (ty iš viso 40 dozių). Kontrolinės pelės gavo tik nešiklį (alyvuogių aliejų). Eksperimento metu kas savaitę buvo stebimas pelių kūno svoris ir maisto suvartojimas. Kūno svorio pokyčiai buvo kiekybiškai įvertinti apskaičiuojant plotą po kreive (AUC) diagramoje, kurioje vaizduojamas procentas pradinio kūno svorio pagal laiką (nuo 1 iki 8 savaitės), ir išreikštas savavališkais vienetais. Pelės buvo numarintos išniriant gimdos kaklelį praėjus 24 valandoms po paskutinės dozės (su kCh, HCF1 arba HCF1/kCh) po naktinio badavimo. Gastrocnemius raumenų mėginiai buvo iškirpti mitochondrijų kvėpavimui matuoti. Riebalinės pagalvėlės (lytinės liaukos, retroperitoniniai ir mezenteriniai riebalai) buvo išpjaustytos ir pasvertos. Konkrečios riebalų pagalvės svorio ir kūno svorio santykis buvo įvertintas ir išreikštas kaip „riebalų pagalvėlės indeksas“.

Cistancheyra natūrali žolė, turinti svorio metimo efektą

2.7. Biocheminė pelių analizė

2.7.1. Mėginių paruošimas.

Susmulkinti gastrocnemius raumenų audiniai buvo sumaišyti su 10 ml kolagenazės tirpalo (0,075 proc. (m/t)) buferyje (100 mM KCl, 50 mM MOPS, pH 7,2), ir mišiniai inkubuojamas 4∘ C temperatūroje 20 min. Suvirškinti audinių mišiniai buvo centrifuguojami 600 × g 4 ° C temperatūroje 20 min. Supernatantas buvo pašalintas; suvirškinti audiniai buvo sumaišyti su 20 ml ledo šalto homogenizuojančio buferio (50 mM sacharozės, 200 mM manitolio, 5 mM KH2PO4, 1 mM EGTA ir 5 mM MOPS, pH 7,2) ir homogenizuojami ant ledo su tefloninio stiklo homogenizatoriumi. esant 4000 aps./min., 25–30 pilnų smūgių. Po to homogenatai buvo centrifuguojami 600 x g 4 °C temperatūroje 10 min., todėl gaunama frakcija be branduolio (supernatantas). Mitochondrijų granulės buvo paruoštos iš raumenų homogenatų, centrifuguojant 9200 × g 4 ° C temperatūroje 30 minučių. Mitochondrijų frakcijos buvo gautos suspenduojant granules buferyje, kuriame yra 125 mM KCl, 10 mM Tris-Base, 2 mM KH2PO4, 0,5 mM EGTA ir 20 mM MOPS, pH 7,5 [15].

2.7.2. Mitochondrijų kvėpavimas.

Kvėpavimo dažnis mitochondrijose, išskirtose iš pelių skeleto raumenų, buvo nustatytas taip, kaip aprašyta Wong ir Ko [12]. Trumpai tariant, mitochondrijų kvėpavimas buvo matuojamas poliarografiškai, naudojant Clark tipo elektrodą (Hansatech Instruments, Norfolkas) 30 C temperatūroje. Mitochondrijų frakcijos (1 mg baltymo/ml) buvo inkubuojamos kvėpavimo buferyje (3{{17}). } mM KCl, 6 mM MgCl2, 75 mM sacharozės, 1 mM EDTA ir 20 mM KH2PO4, pH 7,0). Pridėtas substrato tirpalas, kuriame yra 15 mM natrio piruvato ir 5 mM natrio malato. Po pusiausvyros, 3 būsenos kvėpavimas buvo inicijuotas pridedant ADP (galutinė koncentracija 0,6 mM). Kai visas pridėtas ADP buvo sunaudotas ATP generavimui, buvo pridėta oligomicino, kad sukeltų 4 būsenos kvėpavimą. Kvėpavimo kontrolės koeficientas (RCR) buvo įvertintas apskaičiuojant 3 būsenos ir 4 būsenos kvėpavimo dažnių santykį [16].

2.7.3. Mitochondrijų UCP3 ekspresija pelės skeleto raumenyse.

Mitochondrijų UCP3 lygiai buvo įvertinti Western blot analize, naudojant anti-UCP3 (E-18) antikūnus, atlikus mitochondrijų frakcijos SDS PAGE analizę, naudojant 10 procentų akrilamido atskyrimo gelį. Mitochondrijų frakcijos, išskirtos iš pelių skeleto raumenų (∼ 60 𝜇g), buvo užteptos ant gelio, o citochromo c oksidazė (COX) buvo naudojama kaip etaloninis žymeklis. Imuninės spalvos baltymų juostos buvo analizuojamos densitometrijos metodu, o UCP3 kiekiai (savavališki vienetai) buvo normalizuoti, atsižvelgiant į COX lygį (savavališki vienetai) mėginyje.

2.8. Baltymų tyrimas.

Baltymų koncentracija buvo nustatyta naudojant Bio-Rad baltymų tyrimo rinkinį. Mitochondrijų/ląstelių lizato mėginio alikvotinė dalis (10 𝜇L) buvo praskiesta 40 𝜇L vandens. Tada į 96-šulinėlio mikrotitravimo plokštelės šulinėlį buvo įpilta alikvotinė dalis (10 𝜇L) praskiesto mėginio, o po to įpilta 200 𝜇L praskiesto Bio-Rad tyrimo reagento (5- karto praskiedimas). Mišiniui buvo leista stovėti kambario temperatūroje 5 minutes, tada buvo išmatuota reakcijos mišinio absorbcija esant 570 nm. Baltymų koncentracija buvo nustatyta pagal kalibravimo kreivę, naudojant galvijų serumo albuminą (BSA) kaip standartą.

2.9. Statistinė analizė.

Visi duomenys buvo išreikšti kaip vidurkis ± standartinė vidurkio paklaida (SEM), jei nenurodyta kitaip. Duomenys buvo analizuojami taikant vienpusę dispersijos analizę (vienpusė ANOVA), jei nenurodyta kitaip, o tarpgrupiniai skirtumai buvo aptikti naudojant Tukey diapazono testą su 𝑃<>

Cistanchedeserticola turidaug efektų

3. Rezultatai

3.1. HCF1 / BSS poveikis MMP C2C12 myotubes.

Inkubuojant cheminį atjungiklį, karbonilcianidą {{0}} (trifluormetoksi) fenilhidrazoną (FCCP), esant 1 𝜇M koncentracijai, MMP sumažėjo priklausomai nuo laiko, o sumažėjimo mastas buvo 29 proc. matavimo pabaiga (1 ir 2 pav.). Priešingai, HCF1 ir BSS, esant 30 ng/mL ir 10 𝜇M koncentracijoms, padidino MMP atitinkamai 5 ir 4 procentais per pirmąsias 10 HCF1/BSS inkubacijos minučių (1 ir 2 pav.). . Pradinis HCF1/BSS sukeltas padidėjimas sekė laipsniškas MMP sumažėjimas iki atitinkamai 95 ir 93 procentų atitinkamos pradinės vertės matavimo pabaigoje (60 min. HCF1/BSS inkubacija) (1 ir 2 paveikslai). HCF1 / BSS sukelti MMP pokyčiai buvo apibūdinti naudojant specifinius inhibitorius. Rotenonas (0,1 nM), mitochondrijų komplekso I inhibitorius, ir cholesterolis (0,3 𝜇M), membranos standumo stipriklis, slopino HCF1/BSS sukeltus MMP pokyčius viso matavimo metu (1 ir 2 pav.). Kita vertus, inkubacija su specifiniu UCP inhibitoriumi BVP, cheminiu jungikliu 6-ketocholestanoliu (kCh) arba antioksidantu dimetiltiokarbamidu (DMTU) sumažino HCF1-sukeliamą MMP vėlesniu HCF1 inkubacijos metu (1 pav.). BVP, kCh ir DMTU taip pat sumažino BSS sukeltą MMP sumažėjimą vėlesniu BSS inkubacijos metu, kai MMP vertė buvo 110 procentų, palyginti su atitinkama laiko atitikimo kontrole (2 pav.).

3.2. HCF1 / BSS poveikis AMPK aktyvinimui C2C12 myotubes.

HCF1 poveikis AMPK buvo ištirtas išmatuojant fosforilinto AMPK (p-AMPK𝛼) ir bendro AMPK (AMPK𝛼) santykį, o tai rodo AMPK aktyvacijos mastą. Inkubuojant su HCF1, esant 30 ir 100 ng/ml koncentracijoms, padidėjo nuo laiko priklausomas AMPK aktyvacijos padidėjimas, o šio padidėjimo mastas buvo atitinkamai 32 ir 43 procentai po 8 HCF1 inkubacijos valandų, palyginti su atitinkamu laiku. suderintą kontrolę (3 pav.). Lygiagrečiai su HCF1, išankstinis inkubavimas su BSS (10 𝜇M) žymiai padidino AMPK aktyvacijos mastą 25 procentais, palyginti su neinkubuota kontrole (5 pav.). HCF1 / BSS sukeltas AMPK aktyvavimas C2C12 miotubuose buvo visiškai panaikintas kartu su kCh (atjungikliu) arba DMTU (4 ir 5 paveikslai, papildomos medžiagos, kurią galima rasti internete, 1 ir 2 lentelės).

3.3. HCF1/BSS poveikis PGC-1 branduolio translokacijai C2C12 miotubuose.

PGC-1 aktyvavimas gali būti netiesiogiai išmatuotas pagal PGC-1 branduolio translokacijos mastą. Išankstinė inkubacija su HCF1 ir BSS reikšmingai padidino PGC-1 branduolio translokaciją atitinkamai 25 ir 28 procentais, kaip rodo padidėjęs PGC-1 santykis branduolyje ir citoplazmoje (6 ir 7 pav.). Specifinis AMPK inhibitorius, 6-[4-(2-piperidin-1-il-etoksi)-fenil)]-3-piridin-4-ilpirazolo[ 1,5-a]-pirimidinas (CC), kurio koncentracija 10 µM, slopino HCF1/BSS sukeltą PGC-1 branduolio translokacijos padidėjimą atitinkamai 156 ir 235 procentais C2C12 miotubuose ( 1 ir 2 lentelės). HCF1 / BSS sukeltas PGC -1 branduolinis perkėlimas taip pat buvo apsaugotas kartu su kCh arba DMTU (6 ir 7 paveikslai, papildomos medžiagos 1 ir 2 lentelės).

3.4. HCF1 / BSS poveikis mitochondrijų UCP3 ir citochromo c oksidazės (COX) ekspresijai C2C12 miotubuose.

Norint nustatyti HCF1/BSS sukeltos aktyvacijos svarbą AMPK/PGC-1 kelyje, HCF1/BSS poveikis mitochondrijų atsijungimui ir biogenezei, įvertintas UCP3 ir COX lygiais (patikimas mitochondrijų masės rodiklis). ląstelėse), atitinkamai buvo tiriami. Išankstinis inkubavimas su HCF1/BSS reikšmingai padidino mitochondrijų UCP3 ir COX lygį – šis padidėjimas siekė 37 ir 23 procentus (inkubuotuose HCF1-miovamzdeliuose) (8 pav.) ir 52 ir 24 procentus (BSS inkubuotuose miotubuose) ) (9 pav.), atitinkamai, lyginant su atitinkama neinkubuota kontrole. HCF1 / BSS sukeltas UCP3 ir COX lygių padidėjimas buvo visiškai apsaugotas HCF1 kartu inkubuojant su kCh, DMTU arba

CC (papildomos medžiagos 1 ir 2 lentelės). Reikėtų pažymėti, kad šiame eksperimente naudotos kCh ir CC koncentracijos buvo atitinkamai pakoreguotos iki 20 ir 1 µM, kad būtų išvengta citotoksinio kCh ir CC poveikio C2C12 miotubams (nepublikuotas stebėjimas).

3.5. Mitochondrijų atsiejimo vaidmuo HCF{2}}sukeltame HFD sukeltų nutukusių pelių svorio mažinime.

Galimas mitochondrijų atsiejimo vaidmuo HCF{0}}sukeltam svorio mažėjimui buvo toliau tiriamas naudojant cheminę jungtį kCh (papildomos medžiagos 3 lentelė). HCF1 sukėlė mitochondrijų atsijungimą pelių skeleto raumenyse, kaip rodo mitochondrijų kvėpavimo kontrolės santykio (RCR) sumažėjimas ir mitochondrijų UCP3 ekspresijos padidėjimas tiek ND, tiek HFD maitinamose pelėse. kCh per se (vartojant 9 mg/kg paros dozę) reikšmingai padidino mitochondrijų RCR 23 procentais ND maitinamoms pelėms (bet ne HFD maitinančioms pelėms). HCF1-sukeltas mitochondrijų atsijungimas HFD maitinamose pelėse buvo visiškai slopinamas gydant kCh. HCF1 sumažino ND ir HFD maitinamų pelių svorį. Šis poveikis buvo susijęs su HFD sukelto visceralinių riebalų indekso padidėjimo slopinimu. Priešingai nei HCF1, kCh nepadarė aptinkamo poveikio ND ir HFD gyvūnų svorio padidėjimui per 8-savaitę eksperimentą. KCh vartojimas kartu su HCF1 panaikino HCF1-sukeliamą slopinamąjį poveikį HFD sukeltam pelių kūno svorio ir visceralinio riebalų indekso padidėjimui (papildomos medžiagos 3 lentelė).