1 dalis: Homoargininas pagerina diabetinę nefropatiją, nepriklausomą nuo azoto oksido sintazės-3

kontaktastina.xiang@wecistanche.com

Abstraktus

Neseniai parodėme, kad homoarginino papildymas suteikia inkstų apsaugą diabetinių pelių modeliuose. Šiame tyrime išbandėme, ar apsauginis homoarginino poveikis yra nepriklausomas nuo azoto oksido sintazės -3 (NOS3) sergant diabetine nefropatija (DN). Eksperimentai buvo atlikti su NOS3 deficito (NOS3-7) pelėmis ir jų laukinio tipo vadu, naudojant kelias mažas nešiklio arba streptozotocino dozes ir gydomas homoargininu užgeriant geriamuoju vandeniu 24 savaites. Homoarginino papildymas 24 savaites cukriniu diabetu sergančioms NOS3-/pelėms žymiai sumažino albuminurija, padidėjusį šlapalo azoto kiekį kraujyje, histopatologinius pokyčius ir inkstų fibrozę, inkstų fibrozinius žymenis ir inkstų makrofagų prisitraukimą, palyginti su nešikliu gydytų diabetinių NOS3- / pelės. Be to, homoarginino papildymas atkūrė inkstų mitochondrijų funkciją po diabeto. Svarbu tai, kad tarp visų grupių reikšmingų inkstų NOS1 ar NOS2 mRNR ekspresijos pokyčių nebuvo. Be to, homoarginino papildymas pagerino širdies funkciją ir sumažino širdies fibrozę po diabeto. Šie duomenys rodo, kad apsauginis homoarginino poveikis nepriklauso nuo NOS3, o tai galiausiai pakeis mūsų supratimą apie mechanizmą (-us), kuriuo (-iais) homoargininas sukelia inkstų ir širdies apsaugą DN. Apsauginis homoarginino poveikis DN gali būti tarpininkaujamas gerinant mitochondrijų funkciją.

Raktažodžiai: širdies funkcija, diabetinė nefropatija, homoargininas, NOS3

Spustelėkite, kad sužinotumėte, kam naudojama cistanche

1. ĮVADAS

Diabetasyra rimta ir vis dažniau pasitaikanti sergamumo ir mirštamumo priežastis Jungtinėse Amerikos Valstijose, o apytiksliai 12-14 procentai suaugusiųjų serga cukriniu diabetu, o tarp etninių mažumų – dar daugiau (Gao ir kt., 2016; Menke ir kt., 2015). . Ekonominiai ir produktyvumo nuostoliai dėl diabeto komplikacijų viršija 245 milijardus JAV dolerių ir sukelia fiziologinius bei psichologinius padarinius, įskaitant sisteminiusuždegimas, inkstų ir širdies funkcijos sutrikimas, depresija ir socialinis nerimas (Jha ir kt., 2018; Menke ir kt., 2015; Moreno ir kt., 2018; Tao ir kt., 2015; Vanstone ir kt., 2015). Diabetinė nefropatija (DN) yra lėtinė progresuojanti liga, sukelianti greitą nuosmukį ir galutinės stadijos inkstų nepakankamumą. Per pastarąjį dešimtmetį sergamumas inkstų nepakankamumu dėl diabeto išaugo dvigubai. Tradiciniai gydymo būdai, įskaitant kraujospūdžio ir gliukozės kontrolę bei kitus gyvenimo būdo pokyčius, tik nežymiai padėjo sulėtinti inkstų nepakankamumo progresavimą. Taigi svarbu nustatyti diabeto vystymosi ir progresavimo mechanizmusinkstų liga. Cistanche deserticolapriklauso tradicinei kinų medicinai ir yra inkstus tonizuojantis vaistas. Jis daugiausia naudojamas esant inkstų yang trūkumui, pvz., nugaros skausmui, nugaros skausmui, impotencijai ir kt. Tačiau daugumai diabetu sergančių pacientų trūksta yin, o jei jiems trūksta yang, jie gali jį tinkamai vartoti. Tačiau jį reikia vartoti atsargiai esant neigiamam karščiui, pavyzdžiui, karščio ir naktinio prakaitavimo baimei ir burnos džiūvimui. Bet kokiu atveju pirmiausia kreipkitės į gydytoją.

Homoargininas, endogeninis arginino analogas, nedalyvaujantis baltymų sintezėje, atsirado kaip naujas žaidėjas sveikatos ir ligų srityje (Pilz ir kt., 2015). Homoargininą sintetina mitochondrijų argininas: glicino amidinotransferazė (AGAT) inkstuose, kaip substratus naudojant L-argininą ir L-liziną (Choe ir kt., 2013; Ryan & Wells, 1964), ir katabolizuojamas naudojant alaniną: glioksilato aminotransferazę2 (AGXT2)2. (Rodionovas ir kt.2016). Homoarginino koncentracija plazmoje yra atvirkščiai koreliuojama su širdies ir kraujagyslių ligų rizika ir bendru mirtingumu (Jud ir kt., 2018; Marz ir kt., 2010), padidėjusia mirtinų insultų rizika (Haghikia ir kt., 2017), staziniu širdies nepakankamumu ir kairiojo skilvelio hipertrofija (Atzler ir kt., 2013, 2017; Bahls ir kt., 2018; Pilz, Edelmann ir kt., 2014), senėjimas (Atzler, Schwedhelm ir kt., 2014; Marz ir kt., 2010) , rūkymas (Atzler, Gore ir kt., 2014; Sobczaket al., 2014; Vogler al., 2015; Zwan ir kt., 2013), kūno masės indeksas (Atzler, Gore ir kt., 2014; Marz ir kt., 2010 m. Pilz, Teerlink ir kt., 2014) ir nėštumas (Valtonen ir kt., 2008). Žemas homoarginino kiekis rodo širdies veiklos sutrikimą, susijusį su dideliu asimetrinio dimetilarginino (ADMA) kiekiu (Atzler, Schwedhelm ir kt., 2014; Jud ir kt., 2018; Kayacelebiet al., 2014; Pilzet al., 2015). Vogler al, 2015). Mažo homoarginino poveikis azoto oksido (NO) gamybai / veikimui buvo susijęs su padidėjusia insulto ir aterosklerozės rizika (Haghikia ir kt., 2017). Endotelio azoto oksido sintazė (NOS3) yra konstituciškai ekspresuojama endotelio ląstelėse ir reguliuoja tarpląstelinį NO lygį, reaguodama į kalcio kiekį (Zanchi ir kt., 2000). Homoargininas gali prisidėti prie NO sintezės, nes yra NOS substratas, nes homoargininas, net ir turintis silpnesnį afinitetą NOS, palyginti su argininu, gali būti metabolizuojamas į NO ir homocitruliną (Drechsler ir kt., 2011). Inkstuose mažas homoarginino kiekis. yra stiprus staigios širdies mirties ir mirties dėl širdies nepakankamumo rizikos veiksnys hemodializuojamiems pacientams (Drechsler ir kt., 2011). Be to, mažas homoarginino kiekis yra susijęs su padidėjusia širdies ir kraujagyslių ligų rizika pacientams, kuriems persodintas inkstas (Kayacelebi ir kt., 2017). Tiek gyvūnams (Banchaabouchi ir kt., 2001; Tofuku ir kt., 1985), tiek žmonėms (Drechsler ir kt. 2013), sergant lėtiniais inkstų pažeidimais, sumažėja homoarginino kiekis, o žemas homoarginino kiekis plazmoje buvo reikšmingai susijęs su sumažėjusiu glomerulų filtracijos greičiu (GFR) ir proteinurija (Ravani ir kt., 2013). Nors epidemiologiniai duomenys parodė, kad sumažėjęs homoarginino kiekis buvo susijęs su padidėjusiu mirtingumu nuo inkstų ir širdies ir kraujagyslių ligų (Drechsler ir kt., 2015; Jud ir kt., 2018; Marz ir kt., 2010; Ravani ir kt., 2013), tiesioginis fiziologinis homoarginino mechanizmas (-ai) lieka neaiškus. Anksčiau parodėme, kad homoargininas yra veiksmingas DN gydymas (Wetzel ir kt., 2019). Tačiau homoarginino veikimo mechanizmas esant inkstų ir širdies veiklos sutrikimams nėra žinomas.

Šiame tyrime išbandėme hipotezę, kad apsauginis homoarginino poveikis inkstų ir širdies funkcijoms sergant diabetu nepriklauso nuo NOS3. Mūsų rezultatai rodo, kad homoargininas tarpininkauja diabetinių NOS3-一 pelių inkstų ir širdies apsaugai, o tai galiausiai pakeis mūsų supratimą apie mechanizmą (-us), kuriuo (-iais) homoargininas pagerina diabetinį inkstų pažeidimą. Apsauginis homoarginino poveikis DN gali būti skatinamas gerinant mitochondrijų funkciją.

2. MEDŽIAGOS IR METODAI

2.1 Diabetinės pelės modelis

Visi eksperimentai su gyvūnais buvo atlikti su{0}}savaičių pelių patinais (The Jackson Laboratory, Bar C57BL/6J arba NOS3-1-Harbor, ME). Pelės buvo laikomos 23 laipsnių C temperatūroje ir 12:12 šviesos ir tamsos cikle su laisva prieiga prie standartinio maisto ir vandens. Cukrinis diabetas buvo sukeltas į pilvaplėvės ertmę įšvirkščiant 50 mg/kg streptozotocino (STZ) arba kontroliuojant fiziologinį tirpalą po 6-h badavimo 5 dienas iš eilės. Visos procedūros buvo atliekamos ryte viso tyrimo metu. Gliukozės kiekis kraujyje buvo matuojamas nevalgiusių pelių, naudojant Contour Next EZ gliukometrą su Contour Next juostelėmis iš pelių uodegos venų, o diabetu sergančių pelių gliukozės kiekis kraujyje viršija 350 mg/dl. L-homoargininas (Sigma, St. Louis MO, katės Nr.: H1007) buvo papildytas geriamuoju vandeniu, kurio koncentracija buvo 50 mg / l, kaip aprašyta anksčiau (Wetzel ir kt., 2019), ir keičiama kas 4 dienas. Tyrimo pabaigoje (24 savaitės) buvo paimti 24-h šlapimo mėginiai, pelės buvo eutanazuotos intraperitonine ketamino/ksilazino kokteilio injekcija; plazma buvo gauta atliekant širdies punkciją, o inkstai ir širdys buvo pašalinti tolesniems tyrimams. Šlapimui paimti pelės buvo atskirai patalpintos į medžiagų apykaitos narvelius 16 valandų su laisva prieiga prie geriamojo vandens, o šlapimas buvo surinktas į surinkimo vamzdelius, kuriuose yra 200 ul mineralinės alyvos, kuri neleidžia šlapimui išgaruoti. Kraujas buvo paimtas atliekant širdies punkciją ir centrifuguojamas 3000 g 3 minutes 4 laipsnių kampu, kad būtų atskirta plazma. Po paėmimo visi mėginiai buvo laikomi -80 ° C temperatūroje iki analizės. Pelių skaičius vienoje grupėje pateiktas 1 lentelėje. Mėginiai, gauti iš Ins2Aita pelių, buvo paimti taip, kaip aprašyta anksčiau (You et al., 2015). Visus eksperimentus su gyvūnais patvirtino Teksaso universiteto sveikatos mokslų centras San Antonijaus instituciniame gyvūnų priežiūros ir naudojimo komitete.

2.2 Imunohistochemija

Pelės inkstų audiniai buvo fiksuoti 10 procentų formalinu ir įterpti į parafiną, o 3- μm pjūviai buvo supjaustyti. Imunohistochemija buvo atlikta su parafinu įterptose sekcijose su anti-pelės Mac-2 antikūnu (klonas M3/38; Cedarlane, Burlington, NC), kaip aprašyta anksčiau (Youet al., 2013, 2014). Nuotraukos buvo padarytos naudojant Olympus BX60 mikroskopą ir Olympus Q-Color3 skaitmeninę kamerą naudojant Q-capture Pro 7 vaizdo programinę įrangą. Glomerulų makrofagų skaičius buvo skaičiuojamas 20 glomerulų per pjūvį (makrofagų skaičius glomeruluose padalintas iš glomerulų skaičiaus) aklu būdu, padidinus 40 kartų, ir apskaičiuotas vidurkis, kaip aprašyta anksčiau (Morris ir kt., 2011; Wetzel ir kt., 2019; Jūs ir kt., 2013, 2014).

2.3 Inkstų ir širdies histopatologija

Inkstai ir širdys buvo fiksuoti 4 procentų paraformaldehidu, įterpti į parafiną ir supjaustyti 5-μum pjūviai. Pjūviai buvo nudažyti Massono trichromo arba periodinės rūgšties-Schiff (PAS) dėmėmis, tiriami aklu būdu, o balų vidurkis buvo apskaičiuotas. Norint nustatyti procentinį fibrozės plotą, Massono trichrominės nuotraukos buvo gautos 10 kartų ir analizuojamos ImageJ, kad būtų išmatuotas fibrozės plotas procentais. Reprezentatyvūs vaizdai buvo padaryti naudojant Olympus BX60 mikroskopą ir Olympus Q-Color3 skaitmeninę kamerą naudojant Q-capture Pro 7 vaizdo programinę įrangą. Glomerulinės charakteristikos buvo išmatuotos naudojant Bioquant Osteo programinę įrangą (Bioquant Image Analysis Corporation, Nashville, TN), o procentinis sužalojimo indeksas buvo apskaičiuotas, kaip aprašyta anksčiau (Mohan ir kt., 2008). Kiekvienam inkstams gavome 12 vaizdų ir išanalizavome kiekvieno lauko glomerulą, kad statistinei analizei būtų apskaičiuotas kiekvieno gyvūno vidurkis.

2.4 Analitinė metodika

Albumino koncentracija šlapime buvo matuojama ELISA metodu, naudojant Albuwell M rinkinį (Excell, Philadelphia, PA), kaip aprašyta anksčiau (Awad, You, Gao, Gvritishvili ir kt., 2015). Kreatinino kiekis šlapime buvo matuojamas naudojant Diazyme Creatinine Assay (Diazyme Laboratories, Poway, CA) (Awad ir kt., 2011; Awad, You, Gao, Cooper ir kt., 2015). Kraujo karbamido azotas (BUN) buvo nustatytas naudojant QuantiChrom karbamido tyrimo rinkinį (BioAssay Systems, Hayward, CA), kaip aprašyta anksčiau (You et al., 2017). Pelės sistolinis spaudimas buvo matuojamas naudojant CODA neinvazinę kraujospūdžio sistemą (Kent Scientific Corporation, Torrington CT), kaip aprašyta anksčiau (Awad, You, Gao, Gvritishvili ir kt., 2015). Prieš pradedant rodmenis, pelės buvo aklimatizuotos 10 minučių 26 laipsnių temperatūroje. Visoms grupėms rodmenys buvo imami tuo pačiu paros metu, kad būtų išvengta bet kokių paros pokyčių.

2.5 Širdies funkcijos matavimai

Serijinė B ir M režimo echokardiografija buvo atlikta naudojant „Vevo 2100 Imaging Platform“ („VisualSonics“, Torontas, Kanada) naudojant 30-MHz linijinį keitiklį, kad būtų galima tiksliai stebėti širdies hemodinamikos parametrus ir įvertinti pelių širdies struktūrą po 22 savaičių. gydymas homoargininu. Kairiojo skilvelio išstūmimo frakcija (EF) ir kairiojo skilvelio frakcijinis susitraukimas (FS) buvo kiekybiškai įvertinti naudojant M režimą, kaip aprašyta anksčiau (lorga ir kt., 2016, 2018).

2.6 RNR išskyrimas ir realaus laiko PGR

RNR buvo išskirta Trizol ekstrakcija iš visų inkstų sekcijų ir atvirkštine transkribacija į cDNR, naudojant Bio-Rad (Hercules, CA) scenarijaus DNR sintezės rinkinį. Realaus laiko PGR buvo atlikta naudojant CFX384realaus laiko sistemą (Bio-Rad, Hercules, CA), naudojant Tagman pradmenis, skirtus pelės MCU (Mm{6}}m1), fibronektinui (Mm01256744_m1), naviko augimui. faktorius (TGF, Mm01178820_m1), NOS1 (Mm00435175_m1), NOS2 (Mm00440502_m1) ir Rn18S (Mm03928990_gl) (Thermo Fisher, Waltham, MA). Ct reikšmės buvo normalizuotos iki 18S ir palygintos su NOS3 mėginiais. Lygiųjų raumenų aktino pradmenys (FW:5'-CTGCCGTTTTCCCCCTTCCTG-3', RV:5'-TTGCTTCCTCCTCCTTTG-3'),E-kadherinas (FW: 5'-TGAGTGTGTGGGTGCTGA-3',RV:5'-CGGTTTC AATGGCTTACCTTTTCC-3') ir -aktinas (FW:5'-GC TGGTTGTGTAAGGTAAGGTGTGC-3',RV: 5'-GAGG GGGTTGAGGTGTTGAGG-3) buvo gauti iš Integrated DNA Technologies (Coralville, IA). cDNR mėginiai buvo analizuojami naudojant SYBR Green Master Mix (Thermo Scientific, Rockford IL), kaip aprašyta anksčiau (Morris ir kt., 2011), ir normalizuoti. į -aktiną, kad būtų galima palyginti su NOS3-/- mėginiais.

2.7 Western blotting

Inkstų audinys buvo homogenizuotas RIPA buferyje, kuriame yra {{0}},1 proc. Triton X-100, papildyto proteazės inhibitoriais (Roche Diagnostics, Indianapolis, IN) ir išvalytas centrifuguojant 10,{{4} } g 10 min 4 laipsnių temperatūroje, ir supernatantas buvo surinktas. Baltymų koncentracija buvo nustatyta Bicinchonic Acid (BCA) tyrimu (Thermo Scientific, Waltham, MA). 50 ug inkstų lizato mėginys buvo atskirtas 4-12 procentų Bis-Tris geliu (Life Technologies, Carlsbad, CA) ir perkeltas ant PVDF membranų prieš blokuojant 5 procentų sausu pienu. Western blot buvo atliktas naudojant šiuos antikūnus: MiCU1 (0,4 ug/ml; Sigma-Aldrich, St Louis, MO) ir -aktino (1:1000; Cell Signaling, Danvers, MA) antikūnus. Western blotai buvo kiekybiškai įvertinti naudojant „ImageJ“ programinę įrangą (NIH, Bethesda, MD) ir normalizuoti iki aktino baltymo ekspresijos.

2.8 Statistinė analizė

Visų grupių palyginimai buvo atlikti naudojant GraphPad Prism programinę įrangą (7.04 versija, San Diegas, CA). Rezultatai išreiškiami kaip vidurkis ± SEM. Grupių reikšmingumui palyginti buvo naudojamas vienpusis ANOVA ir Fišerio mažiausio reikšmingumo skirtumo testas. Vertė p<0.05 represented="" a="" significant="">