2 dalis: inkstų pažeidimo molekulė-1 yra potencialus SARS-CoV receptorius-2

Norėdami gauti daugiau informacijos. kontaktastina.xiang@wecistanche.com

Klinikinės koronaviruso apraiškos

1. Inkubacinis laikotarpis yra ilgas, o pagrindiniai simptomai yra karščiavimas, nuovargis, gerklės skausmas ir kosulys. Karščiavimas gali būti didelis karščiavimas, vidutinis karščiavimas arba mažas karščiavimas;

2. Kūdikiai ir pagyvenę žmonės nebūdingi, juos dažnai lydi švokštimas ir dusulys. Sunkiais atvejais gali atsirasti kelių sistemų pažeidimas;

3. Sausas kosulys ankstyvoje stadijoje daugiausia yra priepuolių formos ir sunkus, panašus į kokliušą, kuris turi įtakos miegui ir veiklai; vėlesnėje stadijoje kosulys yra skrepliavimas, skrepliai yra pikti, kartais juose yra nedidelis kraujo kiekis, o kai kuriuos lydi švokštimas;

4. Kai kuriems pacientams simptomai yra lengvi ir jie gali nekarščiuoti. Daugumos pacientų prognozė yra gera, o nedidelė dalis pacientų sunkiai serga ar net miršta;

5. Ūminis kvėpavimo distreso sindromas, septinis šokas, refrakterinė metabolinė acidozė ir krešėjimo disfunkcija.

Kaip apsisaugoti nuo naujojo koronaviruso, stiprinti savo imunitetą – veiksmingiausia kovos su virusu priemonė. Cistanche, kuris nuo seno buvo naudojamas kaip maitinamasis lobis, žinomas kaip "dykumaženšenis“ ir yra imuniteto stiprinimo karalius. Cistanche – Imuniteto stiprinimo karalius

Šiuolaikiniai medicinos tyrimai įrodė, kad be organizmo maitinimo ir stiprinimo funkcijų, Cistanche turi reikšmingą gydomąjį poveikį auglių prevencijai, senėjimą stabdymui, aritmijai stabdymui, apoptozės slopinimui ir imuniteto gerinimui. palankumą.

Thevisų Cistanche gliukozidųyra aktyvūs ženšenio komponentai, reguliuojantys imuninę funkciją, o tai gali pagerinti imuninę funkciją ne tik normaliems žmonėms, bet ir žmonėms, kurių imuninė funkcija silpna.

Klinikiniai stebėjimai patvirtino, kad Cistanche turi tam tikrą gydomąjį poveikį piktybiniams navikams ir akivaizdžiai padidina leukocitų kiekį. Ženšenio vartojimas radioterapijos ir chemoterapijos metu gali sumažinti toksinį ir šalutinį radioterapijos ir chemoterapijos poveikį, pagreitinti pažeistų audinių atstatymą ir užkirsti kelią leukopenijai;

Diskusija

Norėdami kovoti suCOVID{0}} pandemija, gilus supratimas, kaipSARS-CoV-2įsiskverbia į žmogaus ląsteles. Tyrimai parodė tiesioginę SARS-CoV-2 užkrėtimąinkstasbe plaučių (Braun ir kt., 2020; Farkash ir kt., 2020). Tačiau ACE2 išlieka vienintelis gerai atpažįstamas receptorius, galintis tarpininkauti šiai invazijai. Be to, SARS-CoV-2 ir susijęs inkstų tropizmasinkstų pažeidimasatrodo nepaaiškinami santykinai sumažėjusiu ACE2 kiekiu po viruso invazijos (Kuba ir kt., 2005). Mūsų tyrimas rodo, kad KIM1, drastiškai padidintas inkstų pažeidimo biomarkeris (Yang ir kt., 2015), tarpininkauja SARS-CoV-2 inkstams kaip receptorius.

Taip pat nustatėme, kad SARS-CoV-2-RBD prie KIM1 jungiasi didesniu afinitetu nei SARS-CoV-RBD ir MERS-COV-RBD, o tai tikriausiai yra stipresnio SARS-CoV užsikrėtimo{8}} pagrindas. (Rabaan ir kt., 2020); Todėl verta persvarstyti inkstų infekciją ir KIM1 vaidmenį šiose sunkiose kvėpavimo takų ligose. Pažymėtina, kad mūsų rezultatai rodo skirtingas KIM1 ir ACE2 surišimo vietas viruso UBR, todėl verta ištirti, ar KIM1 ir ACE2 tarpininkauja SARS-CoV-2 invazijai šiuose organuose ir kaip. Be to, kadangi KIM1 endocituojamas per nuo klatrino priklausomus kelius (Zhao ir kt., 2016), taip pat būtų įdomu toliau tirti KIM{21}}priklausantį procesą po viruso prisijungimo prie ląstelės membranos.

ACE2 yra labiausiai ištirtas SARS-CoV receptorius-2, tačiau jis nėra idealus COVID-19 gydymo taikinys, nes jis plačiai išreiškiamas keliuose organuose ir atlieka lemiamą vaidmenį reguliuojant kraujospūdį. ir užkirsti kelią širdies ir (arba) inkstų pažeidimams (Imai ir kt., 2005; Li ir kt., 2020d). Priešingai, KIM1 turi stipresnį ryšį su inkstų funkcija ir yra labai išreikštas tik po to, kaiinkstų pažeidimas(Kondratowicz ir kt., 2011; Yuan ir kt., 2015; Costafreda ir Kaplan, 2018), todėl tai yra konkretesnis ir galbūt saugesnis gydymo tikslas COVID{3}} pacientams, sergantiems inkstų ligomis.

Apibendrinant galima teigti, kad mūsų duomenys rodo, kad KIM1 vaidina svarbų vaidmenį SARS-CoV-2 inkstų tropizme kaip potencialus SARS-CoV-2 receptorius. Čia siūlome KIM1 ir ACE2 tarpininkaujamo „užburto ciklo“ modelį (5G pav.), kuris gali paaiškinti SARS-CoV-2 inkstų tropizmą pacientams, sergantiems COVID{10}}. Pradiniame SARS-CoV-2 invazijos etape dėl aukštesnio fiziologinio lygio (papildomas S1 paveikslas) ir surišimo afiniteto (papildoma lentelė S1) ACE2 yra pagrindinis taikinys, kuris nėra būdingas inkstams. Tačiau prasidėjus viruso sukeltam AKl, susidaręs drastiškai sureguliuotas KIM1 greitai skatina antrinę virusinę infekciją, kurią sukelia KIM1 ir ACE2, kuri yra labiau specifinė inkstams, todėl užburtame cikle pablogėja inkstų pažeidimai (5G pav.). Metodai, galintys nutraukti SARS-CoV-2 ir KIM1 sąveiką, įskaitant anti-KIM1 antikūnus, mažų molekulių inhibitorius ir KIM{29}}išvestus antagonistinius peptidus, gali atskleisti COVID-19 gydymas.

medžiagos ir metodai

Medžiagos

Recombinant SARS-CoV-2-RBD (T80302) was obtained from Genscript. Antagonist peptide 1 (AP1, SCSLFTCQNGIV, purity >95%) and antagonist peptide 2 (AP2, SCSLFTCQNGGGWF, purity >95 procentai) buvo chemiškai susintetinti Genscript. Antikūnas prieš pelės lgG (p/n 18-8816-33) ir antikūnas prieš triušio lgG (p/n 18-8817-33) buvo gauti iš Rockland. IgG su SureBeads" Protein G magnetiniai karoliukai (J2112LB-02) buvo įsigyti iš Bio-Rad. DAPI (D9542) buvo iš Sigma. Alex Flour 594 pažymėtas faloidinas (C2205S) buvo iš Beyotimes. Antikūnai prieš {{KIM1 (NBP) Naudota 15}}, Novus Biologicals), Flag (F1804, Sigma), HA (H6908, Sigma) ir ACE2 (2115-1-AP, Proteintech).

KIM1 ir ACE2 raiškos profilių gavimas ir analizė

Norėdami gauti išsamius KIM1 ir ACE2 transkripto ir baltymų profilius žmogaus audiniams, surinkome ir išanalizavome transkripto duomenis ir imunohistochemijos pagrindu sukurtus baltymų profilius iš Human Protein Atlas (HPA, https://www.proteinatlas.org), kurie parodė žmogaus baltymų ekspresija ir lokalizacija audiniuose ir organuose, remiantis gilia RNR (RNR seka) seka iš 37 normalių audinių ir imunohistochemija audinių mikrogardelėse, kuriose yra 44 audinių tipai (Uhlen ir kt., 2015). Baltymus koduojančio geno HPA RNR-seq audinys buvo užregistruotas kaip vidutiniai baltymus koduojantys transkriptai milijonui (pTPM), atitinkantys vidutines kiekvieno audinio mėginių vertes. Histologija pagrįsti baltymų ekspresijos lygiai buvo analizuojami rankiniu būdu į keturis lygius (neaptikta, žema, vidutinė ir didelė). Papildomame S1 paveiksle yra išvardyti 10 geriausių KIM1 ir ACE2 audinių transkripcijos lygių ir histologija pagrįstų baltymų ekspresijos lygių, taip pat apibendrinamas sutampantis KIM1 ir ACE2 ekspresijos profilis.

Molekulinis prijungimas ir dinamikos modeliavimas

Prijungimas buvo atliktas per Z-Dock (http://zdock. umassmed.edu/). SARS-CoV-RBD (PBD ID 2AJF), ​​SARS-CoV-2-RBD (PDB ID 6MOJ), MERS-COV-RBD (PDB ID 4L3N), ACE2 (PDB ID 1R42) ir KIM1 Ig kristalinės struktūros V domenas (PDB ID 5DZO) buvo naudojamas ieškant galimų surišimo modelių. Geriausius balus surinkę baltymų kompleksai buvo atrinkti sekantiems molekulinės dinamikos modeliavimui, kurį atliko Desmond serveris ir išanalizavo Pymol2.3 ir Maestro11.8.012. 50 ns dinamikos modeliavimo diagrama buvo pritaikyta baltymų kompleksų dinaminiams parametrams tirti. . MM-GBSA surišimo laisvąją energiją apskaičiavo HawkDock (Misini lgnjatovic ir kt., 2016).

Vidutinis kvadratinis nuokrypis (RMSD) ir vidutinis kvadratinis svyravimas (RMSF)

RMSD buvo naudojamas vidutiniam tam tikro rėmo atrinktų atomų poslinkio pokyčiui įvertinti, kaip aprašyta (Li ir kt., 2011). RMSF buvo atliktas siekiant ištirti poslinkio pokyčius baltymų grandinėje (Li ir kt., 2011). .

AKI pelės modeliai ir qPCR

I / R sužalojimas buvo atliktas C57BL / 6 pelėms, kaip aprašėme anksčiau (Chen ir kt., 2015, 2017). Cisplatinos sukeltai AKI gydyti, 30 mg/kg kūno svorio cisplatina buvo švirkščiama į pilvaplėvės ertmę 8-savaičių senumo pelių patinams, o po 3 dienų pelės buvo numarintos. Kraujo ir inkstų mėginiai buvo paimti tolesnei analizei, n =4 kiekvienai eksperimentinei gyvūnų grupei. Bendra RNR buvo išskirta iš inkstų naudojant RNAiso Plus (TaKaRa) ir atvirkštiniu būdu perrašyta į cDNR, naudojant M-MLV pirmosios grandinės sintezės sistemą (Invitrogen). Specifinių genų transkriptų gausa buvo įvertinta qPCR. Pateikiami tyrime naudojami gruntai (papildoma S4 lentelė).

Konstrukcijos

Žmogaus KIM1, KIM1 Ig V (KIM1 liekanos aa 20-127), KIM1 △lg V (sutrumpintos KIM1 be liekanų aa 20-127), KIM1-CFP, KIM1 lg žinduolių ekspresijos plazmidės V-CFP, ACE2, SARS-CoV-2-RBD (SARS-CoV-2-S likučiai aa 319-541), SARS-CoV-2-S, SARS-CoV{{20 }}RBD-YFP ir TIM{22}}YFP buvo sukurti. Atitinkamų cDNR fragmentų PCR amplifikacijos produktai buvo klonuoti į pRK promotoriaus pagrįstą vektorių, turintį HA arba FLAG žymą. Su SARS CoV{25}}susijusios plazmidės buvo malonios dovanos iš daktaro PHWango iš Šandongo universiteto.

Ląstelių kultūra ir transfekcija

Žmogaus inkstų kanalėlių ląstelių linija HK-2 (gauta iš Kinijos tipo kultūrų kolekcijos centro) buvo kultivuojama DMEM/F12 terpėje (Hyclone), turinčioje 17,5 mM gliukozės ir 10 procentų galvijų vaisiaus serumo. Siekiant įvertinti SARS-CoV-2 poveikį ląstelėms, HK-2 ląstelės buvo transfekuotos SARS-CoV-2-S ir SARS-CoV-2-RBD plazmidėmis ir surinktos tolesnis aptikimas.

Bendras IP

Nurodytos HK-2/HEK293T ląstelės (1 × 10) buvo lizuojamos 1 ml išankstinio lizės buferio (25 mM Tris-HCl, pH 7,4, 150 mM NaCl, 1 proc. NP-40, 1 mM EDTA, 5). procentų glicerolio), kuris yra sukurtas ištraukiamiesiems ir IP tyrimams bei kaip granulių plovimo buferis. IP ląstelių lizatas buvo imunoprecipituotas nurodytu antikūnu arba atitinkamu gG su SureBeadsTM Protein G magnetinėmis granulėmis per naktį 4 °C temperatūroje. Po plovimo išankstinio lizės buferiu, kuriame yra 500 mM NaCl, karoliukai buvo virinami įkrovimo buferyje ir buvo tiriami imunoblotingu (Wan ir kt., 2017).

FRET tyrimas

Ląstelinė sąveika tarp KIM1 ir SARS-CoV-2-RBD buvo aptikta standartiniu FRET tyrimu (Karpova ir McNally, 2006), naudojant KIM1-CFP ir SARS-CoV-2-RBD-YFP . Trumpai tariant, žinduolių ekspresijos plazmidės, ekspresuojančios KIM1-CFP arba KIM1 Alg V-CFP, buvo kotransfekuotos SARS-CoV-2-RBD-YFP į-293T ląsteles. Fluorescenciniu spektrofotometru pagrįsto aptikimo metu ląstelės buvo surinktos ir lizuojamos praėjus 24 valandoms po transfekcijos, o lizatas buvo aptiktas F-2700 fluorescenciniu spektrofotometru (Hitachi) naudojant bangos ilgio skenavimą (500-600nm) ir laiko nuskaitymą (435). /527 nm, sužadinimas / emisija). Konfokaliniam aptikimui ląstelės buvo vaizduojamos naudojant Leica TCS SP8 konfokalinį mikroskopą po didelės galios objektyvo objektyvu (40 ×) (CFP kanalas: 435/485 nm, sužadinimas / emisija; YFP kanalas :485/527nm, sužadinimas / emisija; FRET kanalas: 435/527 nm, sužadinimas / emisija) (Li ir kt., 2020b). Nekonjuguoto CFP ir YFP kotransfekcija buvo įtraukta kaip neigiama kontrolė, kaip aprašyta (Karpova ir McNally, 2006). KIM1 ir jo ligando TIM4 sąveika buvo aptikta FRET tyrimu kaip teigiama kontrolė (Rong ir kt., 2011).

CRISPR-Cas{1}}tarpininkaujant KIM1 nokautas

CRISPR-Cas{1}}pagrįsti genomo inžinerijos protokolai buvo naudojami taip, kaip aprašyta (Zhang ir kt., 2017). Pateikiamos KIM1 orientacinės RNR tikslinės sekos (papildoma S4 lentelė).

FITC žymėjimas ir konfokalinė mikroskopija

FITC etiketė buvo atlikta taip, kaip aprašėme anksčiau (Li ir kt., 2020b; Zhang ir kt., 2020). Trumpai tariant, SARS-CoV-2-RBD buvo inkubuojamas su FITC (molinis santykis 1:5) per naktį, o po to buvo pridėta 5 mM NHCl, kad būtų sustabdyta reakcija ir užgesintas nesureagavęs FITC. Tirpalas buvo du kartus dializuojamas ir liofilizuotas tolesniam naudojimui.

HEK293T ląstelės (5×109) arba HK-2 ląstelės (1×107) buvo inkubuojamos su laisvu FITC arba FITC-SARS-CoV-2-RBD (100 ug/ml 2). Atliekant peptidų pagrindu atliekamus internalizacijos tyrimus, AP1 arba AP2 (50 μM) buvo pridėtas kartu su FITC-SARS-CoV{18}}RBD (100 ug/m). Po fiksavimo 4 procentų (m/v) formaldehidu, ląstelių membranos buvo nudažytos Alex Flour 594 pažymėtu faloidinu (2 ug/ml), o branduoliai buvo nudažyti DAPI (1 ug/m) ir vaizduojami naudojant Leica TCS. SP8 konfokalinis mikroskopas. Kiekvienoje grupėje į vertinimą buvo įtraukta mažiausiai 100 ląstelių iš penkių laukų po didelės galios objektyvo lęšiu (64 ×). Buvo pristatyti reprezentatyvūs vaizdai. Vaizdų kiekybinį įvertinimą atliko ImageJ1.8.0.

Ląstelių gyvybingumo tyrimai

Ląstelės buvo dedamos po 3000-4000 ląstelių viename šulinyje į 96-šulinėlių plokšteles. Esant 80 procentų santakai, ląstelės, inkubuotos su SARS-CoV-2-RBD (100 ug/ml) buvo apdorotos su AP1 arba AP2 (10,50,100 μM) arba be jų. Po to į kiekvieną buvo pridėta 10 ul MTT (5 mg/ml).

4 valandas, terpė buvo pašalinta ir pridėta DMSO. Absorbcija, išmatuota esant 490 nm, buvo normalizuota atitinkamai kontrolinei grupei.

Statistinė analizė

Duomenys buvo išreikšti kaip vidurkis ± SD. Reikšmingi skirtumai buvo įvertinti dviejų krypčių Studento testu. Dvipusė P reikšmė<0.05 was="" considered="" statistically="" significant.="" analyses="" were="" performed="" with="" excel="" 2017="" and="" graphpad="" prism="">