Pinocembrin Ameliorates širdies nepakankamumas po infarkto, aktyvuojant Nrf2 / HO-1 signalizacijos kelią 1 dalis

Susisiekite suoscar.xiao@wecistanche.comdaugiau informacijos

Abstraktus

Fonas:Oksidacinis stresas yra svarbus veiksnys, lemiantis širdies nepakankamumo progresą. Dabartinis tyrimas buvo atliktas siekiant ištirti, ar pinocembrinas sugebėjo sumažinti širdies nepakankamumą po infarkto (PIHF) ir pagrindinius mechanizmus.

Norėdami sužinoti daugiau, spustelėkite čia

Metodai:Žiurkėms buvo atliktas kairiosios priekinės nusileidžiančios arterijos perrišimas miokardo infarktui sukelti, o vėliau jos buvo pakeltos 6 savaitėms, kad sukeltų lėtinį širdies nepakankamumą. Tada pinocembrinas buvo administruojamas kas antrą dieną 2 savaites. Poveikis buvo įvertintas echokardiografija, vakarine dėme, Massono dažymu, biocheminiais tyrimais, imunohistochemija ir fluorescencija. In vitro mes taip pat kultivavome H9c2 kardiomiocitus ir širdies miofibroblastus, kad dar labiau paliudytume mechanizmus.

Rezultatai:Mes nustatėme, kad PIHF sukeltas širdies funkcijų pablogėjimas buvo žymiai pagerintas administruojant pinocembriną. Be to, gydymas pinocembrinu taip pat susilpnino kolageno nusėdimą ir padidintą kraujagyslių endotelio augimo faktoriaus receptorių 2 infarkto pasienio zonoje kartu su susilpninta apoptoze, kuri buvo susijusi su oksidacinio streso pagerėjimu, kurį rodo reaktyviųjų deguonies rūšių (ROS) sumažėjimas širdies audinyje ir malondialdehidas (MDA) serume bei superoksido dismutazės (SOD) padidėjimas. Tai lydėjo branduolinio faktoriaus eritroido 2-ojo faktoriaus (Nrf2)/hemo deguonies-1(HO-1)kelio reguliavimas. Eksperimentai in vitro, kuriuos nustatėme, kad specifinis Nrf2 inhibitorius žymiai pakeitė pinocembrino poveikį, įskaitant antioksidantą, anti-apoptozę, anti-fibrozę ir neovaskuliarizaciją, o tai dar labiau parodė, kad PIHF pagerėjimas pinocembrinu buvo priklausomas nuo Nrf2 / HO-1 kelio.

Cistanche gali pagerinti imunitetą

Išvada:Pinocembrinas pagerino širdies funkcijas ir remodeliaciją, atsirandančią dėl PIHF rosminging ir Nrf2/HO-1 kelio aktyvacijos, kuri dar labiau susilpnino kolageno skaidulų nusėdimą ir apoptozę bei palengvino angiogenezę.

Raktažodžiai:Pinocembrinas, Širdies nepakankamumas, Oksidacinis stresas, Nrf2/HO-1

Įvadas

Širdies nepakankamumas (HF), kuriam būdingi įvairūs terminaliniai klinikiniai sindromai, atsirandantys dėl struktūrinių ir (arba) funkcinių širdies sutrikimų, išlieka pasauline sveikatos našta, o pagrindinė priežastis yra miokardo infarktas (MI), kurio pagrindinė priežastis yra miokardo infarktas (MI) (Ziaeian ir Fonarow 2016; Galli ir Lombardi 2016; Rengo ir kt.2013). Nepaisant didelės pažangos, kuri buvo pasiekta gydant ir užtikrinant HF priežiūros kokybę, apskaičiuota, kad visame pasaulyje kasmet serga 37,7 milijono žmonių, o po 50% mirtingumo yra 50% po HF diagnozės nustatymo (Go et al.2014). Dabartinė dilema gali iš dalies priskirti tai, kad HF po infarkto (PIHF)susideda iš daugybės patofiziologinių mechanizmų, į kuriuos dabartiniai terapiniai metodai negali visiškai nurodyti.

Kaupiamieji tyrimai parodė, kad oksidacinis stresas (BI) daugiausia susijęs su PIHF patologiniu progresavimu (Dubois-Deruy et al.2020; Ma ir kt. 2019; Bubb et al.2017; Habtemariam 2019). OS, daugiausia gaunama dėl pernelyg didelio laisvųjų radikalų ir (arba) reaktyviųjų deguonies rūšių (ROS), turinčių hidroksilo radikalo, superoksido, azoto oksido ir kt., kaupimosi (Dubois-Deruy et al. 2020; Habtemariam 2019), buvo pagrįsta, kad gali sukelti oksidacinį lipidų, baltymų ir DNR modifikavimą ar pažeidimą, su organelių sutrikimais, uždegimu, apoptoze miocituose ir intersticinės fibrozės superveningu (Dubois-Deruy et al.2020; Bubb et al.2017; Hermida ir kt. 2018). Dėl daugialypio neigiamo ROS poveikio į antioksidantus buvo atsižvelgta PIHF terapijoje, kurios mechanizmai susideda iš tiesioginio ROS valymo ir (arba) antioksidacinės gynybos, turinčios glutationo, superoksido dismutazės (SOD), katalazės ir kt., stimuliavimo (Habtemar-iam 2019). Tačiau buvo apgailestaujama, kad kai kurių antioksidantų naudojimas, nei vitaminas E(Lee et al.2005), nei resveratrolis(Made et al. 2015; Olesen et al. 2014), nesugebėjo patenkinti pasitenkinimo širdies ir kraujagyslių ligų terapija, kurią liudija širdies funkcijų pagerėjimo sutrikimas. Todėl PIHF terapijoje reikalingi efektyvesni antioksidantai.

Pinocembrinas (Pino)(cheminė struktūra parodyta 1A pav.)yra natūralus flavonoidų junginys, kurį galima išgauti iš medaus, propolio ir kelių kitų augalų (Lan et al.2015; Rasul et al.2013) be dirbtinės sintezės(Costa ir Leitao 2011), darančios priešuždegiminį, antibakterinį, priešvėžinį ir priešvėžinį poveikį (Rasul et al.2013; Ye et al.2019), kartu su pabrėžtu antioksidaciniu poveikiu (Kim et al.2020; Sangweni ir kt.2020). Kaip jau buvo įrodyta anksčiau, Pino fenolinė struktūra, atsakinga už tiesioginį ROS pašalinimą, taip pat tiek fenolinės, tiek nefenolinės struktūros, sustiprinančios antioksidacinę apsaugą (Habtemariam 2019)atspindi pino antioksidacinį poveikį, kuriuo Pino buvo ištirtas ir taikomas įvairiose ligose, tokiose kaip neurodegeneracinės ligos, aterosklerozė, doksorubicino sukeltas kardiomiocitų toksiškumas (Sangweni et al. 2020; Sang ir kt.2012; Liu ir kt.2014). Tačiau, atsižvelgiant į tai, kad kai kurie antioksidantai miokardo infarktui ir HF gydyti yra negaliojantys arba nepakankami, kad būtų galima pereiti prie klinikinio vartojimo, ar pino antioksidacinis poveikis gali būti įvykdytas gydant PIHF, tebėra menkai suprantama. Taigi šis tyrimas buvo atliktas siekiant ištirti, ar Pino vartojimas gali turėti teigiamą poveikį PIHE, manydamas, kad tai yra naujas, ar ne dominuojantis, bet bent jau pagalbinis gydymas.

Metodai ir medžiagos

Gyvūnų modelis ir eksperimento protokolas

56 Sprague-Dawley žiurkių patinai, įsigyti iš Kinijos trijų tarpeklių universiteto eksperimentų su gyvūnais centro,

buvo užauginti Uhano Nr.3 ligoninėje. Visi eksperimentai buvo oficialiai leistini ir atlikti Hubei pagrindinėje kardiologijos laboratorijoje, laikantis JAV nacionalinių sveikatos institutų išleisto laboratorinių gyvūnų priežiūros ir naudojimo vadovo (NIH leidinys Nr. 82-23, peržiūrėtas 1996 m.).

Žiurkėms iš pradžių buvo atlikta kairioji priekinė besileidžianti vainikinių arterijų (LAD) perrišimas arba fiktyvi operacija. Trumpai tariant, žiurkės buvo anestezuotos 3% pentobarbitalio (2 ml/kg; Sigma-Aldridge, St.Louis, JAV, intraperitoninė), po kurios seka trachėjos intubacija ir kvėpavimo palaikymas (potvynio tūris: 5-10 ml, dažnis: 70 kartų per minutę). Vėliau buvo atliktas širdies poveikis ir LAD buvo sujungtas 7-0 monofilamento nailono siūlais. Viršūnės ar ST segmento pakilimo blyškumo atsiradimas ant elektrokardiogramos I švino rodė MI indukciją. Fiktyviai operacijai buvo taikomos identiškos procedūros, išskyrus LAD ligaciją. Penicilinas (200 000 TV)buvo švirkščiamas į raumenis kartą per parą savaitę po operacijos.

Vėliau žiurkės buvo kruopščiai auginamos 6 savaites, kad susidarytų PIHF. Tada žiurkės atsitiktine tvarka buvo suskirstytos į 4 grupes:(i) sham+fiziologinis tirpalas (fiktyvi grupė);(i)sham+Pino grupė;(ii)LAD ligation+fiziologinis tirpalas(HF grupė);(iv)LAD ligation+Pino(HF+Pino grupė). Pinocembrinas(5 mg/kg, grynumas>98 %; Sigma-Aldridge)arba tas pats fiziologinio tirpalo kiekis buvo švirkščiamas į veną į veną kas antrą dieną 2 savaites. Dozė buvo susijusi su ankstesniu tyrimu (Lan et al.2017). Protokolas buvo iliustruotas 1B pav.

Kontrolines teigiamas kontrolines žiurkes sudarė 3 grupės: sham+fiziologinis tirpalas(fiktyvi grupė); LAD perrišimas +fiziologinis tirpalas (HF grupė); LAD perrišimas+enalaprilis (HF+ACEI grupė). Žiurkėms buvo atliktos atitinkamos operacijos, išskyrus tai, kad HF+ACEI grupės žiurkės buvo šeriamos per burną 20 mg/kg enalaprilio.

Echokardiografijos matavimai

Širdies funkcijos buvo įvertintos transtorakine echokardiografija, naudojant ultragarso vaizdavimo sistemą (Vevo 2100, Visual Sonics Inc., Torontas, Kanada), kaip anksčiau pranešta mūsų grupėje (Fo et al.2020). Kairiojo skilvelio vidinis matmuo galinėje diastolinėje stadijoje (LVIDd) ir pabaigos sistolinėje stadijoje (LVID), kairiojo skilvelio galinis sistolinis ir galinio diastolinis tūris (LVESV ir LVEDV) buvo registruojami dvimatėmis M režimo echokardiogramomis mažiausiai 3 ciklus iš eilės kiekvienai žiurkei. Vėliau buvo apskaičiuota kairiojo skilvelio išstūmimo frakcija (KSIF) ir frakcinis sutrumpinimas (FS), kurie atspindėjo sistolinę funkciją.

Mėginio paruošimas

Atlikus Pino ir echokardiografijos tyrimus, žiurkės vėl buvo anestezuojamos. Daugiau kaip 2 ml veninio kraujo buvo paimta iš uodegos venų į etilenediaminetetraacto rūgšties (EDTA) turinčius vakuuminius kraujo surinkimo vamzdelius, nuosekliai centrifuguojant 3000 r/min greičiu 15 min. ir 4 °CC temperatūroje, po to serumo supernatanto išskyrimas ir konservavimas esant 80 °C temperatūrai. Tada širdys buvo greitai surinktos. Dalis kiekvienos širdies negyvos pasienio zonos buvo nupjauta ir užšaldyta skystu azotu vakarinei dėmių analizei, o kitas širdies audinys buvo fiksuotas 4% paraformaldehido ilgiau nei 24 valandas.

Massono dažymas

Mes atlikome Massono dažymą, kad aptiktume kolageno nusėdimą infarkto pasienio zonoje. Paraformaldehido fiksuoti skilveliai buvo įterpti parafinu ir po to supjaustyti į 5-μm sekcijas. Vėliau sekcijos buvo nudažytos Masson trispalve, kur kolagenas buvo nudažytas mėlyna spalva, miokardas - rožine spalva, o branduolys - juoda spalva. Kolageno nusėdimo proporciją apskaičiavo "Image J" programinė įranga (NIH, Bethesda, MD) esant×200 padidinimui.

Imunohistocheminė analizė

Imunohistocheminė analizė buvo atlikta siekiant įvertinti kraujagyslių endotelio augimo faktoriaus receptoriaus 2 (VEGFR2) tankį, kurio pakėlimas skatino angiogenezę, kuri buvo sveikintina ir svarbi silpninant remodeliaciją (Rengo et al. 2013). Skilvelių sekcijos buvo pagamintos taip, kaip ir tos, kurios buvo atliekamos Masson dažymo metu, po to deparafinuotos ir rehidratuotos. Tada skyriai gavo šilumos sukeltą anti-genų paiešką ir buvo gydomi 3% H, O, kad blokuotų endogeninę peroksidazę, inkubuojant 1 ug/ml VEGFR2 antikūną (Abcam, ab9530)12h esant 4 °C temperatūrai. Toliau sekcijos buvo inkubuojamos arklio ridikėlių peroksidaze (HRP) pažymėtu antriniu antikūnu (1:200, Service, G1213) 50 min. 37 °C temperatūroje. Be to, 3,3'-diaminobenzidinas buvo naudojamas teigiamam dažymui, kuris buvo parodytas tawny, sukurti. Galiausiai vidutinį VEGFR2 optinį tankį išanalizavo ir apskaičiavo "Image-Pro Plus 6.0" programinė įranga ("Media Cybernetics", JAV).

Terminalo-deoksinukleotidilo transferazės tarpininkaujamo nicko galo ženklinimo (TUNEL) tyrimas

Apoptozė vėliau buvo nustatyta TUNEL tyrimo metu. Anksčiau pagamintos parafino masės, įterpiančios skilvelio audinį, tunel tyrimui buvo supjaustytos į kitas skilteles, po to tunel dažymas pagal gamintojo instrukcijas dėl komercinio tyrimo rinkinio (Roche, Šveicarija;11684817910). Trumpai tariant, skilvelių sekcijos buvo veikiamos TUNEL reagentu, kur TdT ir dUTP buvo sumaišyti su santykiu 1:9, 1 val. kambario temperatūroje, inkubavus proteinazę K ir plyšus ląstelių membranai. Galiausiai fluorescenciniai vaizdai buvo stebimi esant 530 nm bangos ilgiui, kurį sukėlė 450 nm emisijos bangos ilgis (×400 padidinimas). Kiekvienos grupės skilvelių audinių apoptotinį greitį analizavo ir apskaičiavo "Image Software".

Vakarų dėmė

Mes įgyvendiname vakarietišką dėmę, kad išsiaiškintume pagrindinius mechanizmus, kuriais Pino pagerino PIHF. Baltymų mėginių ekstrahavimo ir paruošimo procedūros buvo panašios į tas, apie kurias anksčiau buvo pranešta mūsų tyrime (Chen et al.2020a). Membranos buvo zonduojamos antikūnais prieš branduolinį faktorių eritroidą 2-ąjį faktorių 2(Nrf2), heme oksigenazę-1(HO-1;1:2000, Abcam, ab189491),p53(1:1000,ląstelių signalizacijos technologiją,2524S), BCL-2 (1:1000, ląstelių signalizacijos technologiją,2870P),bax (1:1000, Abcam, ab32503), susmulkintą kaspazę-3(1:1000, ląstelių signalizacijos technologiją, 9664 T), kolageną I(1:1000, Giminingumą, AF7001), gliceraldehidą-3-fosfato dehidrogenazę (GAPDH, Service, GB12002), su vėlesne vizualizacija HRP pažymėtais antriniais antikūnais (Service, G1213 ir G1214) ir chemiliuminescencijos aptikimo reagentais. Blot vaizdus pagaliau išanalizavo ir kiekybiškai įvertino "Image J" programinė įranga.

H9c2 kardiomiocitų kultūra ir šalinimas in vitro Žiurkių širdies skilvelių gauti H9c2 kardiomiocitai, įsigyti iš Amerikos tipo kultūros kolekcijos (CRL-1446), buvo kultivuojami siekiant toliau tikrinti Pino in vitro poveikį. H9c2 kardiomiocitai buvo kultivuojami e Dulbecco modifikuotoje Eagle terpėje (DMEM)/ F12 terpėje, kurioje buvo 10% vaisiaus galvijų serumo (Sijiqing, Hangzhou, Kinija), esant 37 °C temperatūrai ir 95% oro ir 5% CO atmosferai. Ląstelės buvo pasėtos į 6 duobučių plokšteles po augimo iki 90%, be to, serumo terpė, kurioje yra 25 uM izoprenalinas (ISO), vėliau buvo pakeista normalia terpe 3 šuliniuose, kad inkubuotų ląsteles 48 valandas, kad imituotų HF būseną, nes HF taip pat pasižymi simpatinio tono hiperaktyvavimu ir β adrenerginių receptorių stimuliacija sukuria ROS (Velusamy et al.2020). Tada ląstelės buvo suskirstytos į 6 grupes:(i)kontrolinė grupė;(ii) valdymo terpė pridėta su 25 μM Pino 4 h (kontrolė +Pino grupė); i) kontrolinė terpė, kokubuojama 25 μM Pino ir 5 μM ML385 4 h (Nrf2 inhibitoriui); MCE, Naujasis Džersis, JAV)(control+Pino+ML385 grupė);(iv)ISO grupė; v.ISO terpė su 4-h inkubacija 25 μM Pino (ISO+Pino grupė); vi.ISO+25 μM Pino+5 μM ML385 grupė. Vaistų koncentracija ir inkubavimo laikas, susijęs su ankstesniais tyrimais ar instrukcijomis (Jin et al.2015; Oliveira ir kt.2017).

Naujagimių žiurkių širdies miofibroblastų kultūra ir proliferacijos tyrimas

Naujagimių žiurkių širdies miofibroblastai (CMF) buvo kultivuojami siekiant ištirti Pino poveikį kolageno sekrecijai. CMF buvo atskirti naudojant 3 dienų amžiaus naujagimių žiurkes, remiantis anksčiau įrodytais metodais (Cui et al. 2021). Izoliuotas ir maltas širdis keletą kartų suvirškino 0,125% tripsino, po kurio sekė kokteilis, kuriame buvo 0,25% tripsino ir 0,08% kolagenazės, o centrifugavimas ir persodinimas į Petri lėkštę vėliau buvo atliktas siekiant surinkti ląsteles iš supernatanto. Tada terpę pakeitė serumo terpė, panaši į tą, kuri buvo naudojama H9c2 kardiomiocitų kultūrai po 90 min. sukibimo. CMF gavo identiškus šalinimą kaip ir H9c2 kardiomiocitai. Mes taip pat įdiegėme ląstelių skaičiavimo rinkinio-8 (CCK-8) tyrimą (Dojindo, Japonija), kad nustatytume CMF prolifų proliferaciją, kai kiekviename šulinyje pasiekiamas 1,5×10° tankis, išnaudojant mikroplokštelių skaitytuvą, kurio bangos ilgis yra 450 nm, kur didesnė vertė rodė padidintą proliferacijos aktyvumą.

ROS aptikimas

Pino gebėjimas iššvaistyti ROS buvo matuojamas fluorescenciniu zondu dihidroetidiumu (DHE; Beyotime, Šanchajus, Kinija). DHL, kuris buvo ištirpintas DMSO, buvo praskiestas iki 5 μM užšaldytoms sekcijoms arba pridėtas prie serumo terpės, kad būtų praskiestas iki tos pačios koncentracijos pagal instrukcijas. Paraformaldehido fiksuotos širdys buvo užšaldytos, po to supjaustytos iki 4 μm sekcijų. Sekcijos arba H9c2 kardiomiocitai buvo inkubuojami kartu su DHE tirpalu 30 min. 37 °C temperatūroje, po to nufotografuoti apverstu fluorescenciniu mikroskopu (IX70; Olimpas, Tokijas, Japonija). Trumpai tariant, branduolys, užpildytas DNR ir RNR, buvo nudažytas ryškia raudona spalva dėl afiniteto tarp nukleino rūgšties ir DHE. Be to, stipresnis fluorescencijos intensyvumas rodė didesnį ROS kaupimąsi.

Biocheminiai tyrimai

Biocheminiai tyrimai buvo atlikti siekiant ištirti BNP, SOD ir malondialdehido (MDA) serumo ir ląstelių supernatanto pokyčius serume ir ląstelių supernatante, kurie parodė atitinkamai HF fenotipą ir oksidacinę apsaugą. Koncentracija buvo išmatuota naudojant atitinkamus biocheminio tyrimo rinkinius pagal gamintojo instrukcijas (Jiancheng, Nanjing, Kinija).

Šis straipsnis paimtas iš Chen et al. Mol Med (2021) 27:100 https://doi.org/10.1186/s10020-021-00363-7