Išankstinio kondicionavimo aktyvuota AKT kontroliuoja neuronų toleranciją išemijai per MDM2–p53 keliąⅠ

Abstraktus

Vienas iš svarbiausių išankstinio kondicionavimo tarpininkaujančios neuroprotekcijos mechanizmų yra ląstelių apoptozės susilpnėjimas, sukeliantis smegenų toleranciją po vėlesnės žalingos išemijos. Šiame kontekste antiapoptotinis PI3K / AKT signalizacijos kelias vaidina pagrindinį vaidmenį reguliuojant ląstelių diferenciaciją ir išgyvenimą.

Spustelėkite norėdami cistanche tubulosa milteliusneuroprotekcija

Yra žinoma, kad aktyvus AKT padidina pelių dvigubos minutės -2 (MDM2), E3-ubikvitino ligazės, kuri destabilizuoja p53, ekspresiją, kad paskatintų vėžio ląstelių išlikimą. Neuronuose neseniai parodėme, kad MDM2 – p53 sąveiką sustiprina farmakologinis išankstinis kondicionavimas, pagrįstas subtoksiniu NMDA glutamato receptorių stimuliavimu, kuris užkerta kelią išemijos sukeltai neuronų apoptozei.

Tačiau, ar šis mechanizmas prisideda prie neuronų tolerancijos išeminio išankstinio kondicionavimo (IPC) metu, nežinoma. Čia parodome, kad IPC sukėlė PI3K sukeltą AKT fosforilinimą Ser473, o tai savo ruožtu fosforilino MDM2 Ser166. Šis fosforilinimas sukėlė MDM2 branduolinį stabilizavimą, dėl kurio destabilizavosi p53, taip užkertant kelią neuronų apoptozei po išeminio įžeidimo. PI3K / AKT kelio slopinimas wortmannin arba AKT nutildymas sukėlė citozolinio MDM2 kaupimąsi, panaikinant IPC sukeltą neuroprotekciją.

Taigi, IPC sustiprina PI3K / AKT signalizacijos kelio aktyvavimą ir skatina neuronų toleranciją, kontroliuodamas MDM2 – p53 sąveiką. Mūsų išvadose pateikiamas naujas mechaninis būdas, susijęs su IPC sukelta neuroprotekcija moduliuojant AKT signalizaciją, o tai rodo, kad AKT yra galimas terapinis taikinys prieš išeminį sužalojimą. Raktiniai žodžiai: AKT; MDM2; p53; PI3K; išeminė tolerancija; išankstinis kondicionavimas

1. Įvadas

Žmonėms trumpalaikis išemijos priepuolis (TIA) buvo atskleistas kaip endogeninė išankstinė būklė, turinti naudą insulto pacientų funkciniams rezultatams [1–3]. Endogeninė neuroprotekcija, kurią sukelia trumpas subtoksinis išeminis stimulas, žinoma kaip išeminis išankstinis kondicionavimas (IPC), yra laikoma strategija besiformuojančioje neuroprotekcijos nuo išeminio pažeidimo srityje [4–6].

Įrodymai rodo, kad IPC skatinama neuroprotekcija priklauso nuo transkripcijos, transliacijos ir potransliacinių mechanizmų, kurie keičia pagrindinių baltymų funkciją po išemijos [6–11]. Tačiau mechanizmas, susijęs su IPC sukelta išemine tolerancija (IT), žmogaus smegenyse nebuvo iki galo išaiškintas [12,13].

Naujų eksperimentinių metodų, kaip suprasti IPC sukeltą neuroprotekciją, kūrimas yra galinga priemonė endogeniniams smegenų IT mechanizmams iššifruoti [6], kurie gali atskleisti naujus terapinius tikslus, kuriais siekiama sumažinti smegenų pažeidimą pacientams, patyrusiems insultą. Per pastaruosius du dešimtmečius apoptozinė neuronų ląstelių mirtis tapo esminiu mechanizmu, susijusiu su smegenų išeminiu pažeidimu [14–16]. Šia prasme baltymų kinazė B arba AKT, serino/treonino kinazė, kuriai reikia aktyvuoti funkcinę fosfoinozitido kinazę (PI3K), buvo laikoma esminiu neuroprotekcinės terapijos taikiniu po išemijos [17,18].

Neseniai parodėme, kad PI3K / AKT signalizacijos kelio slopinimas padidina neuronų jautrumą eksitotoksiškumui [19]. AKT dalyvauja sudėtingame anti-apoptotiniame signalizacijos tinkle [20], kurio komponentai gali būti skirtingose ​​tarpląstelinėse vietose, priklausomai nuo audinio tipo [21,22]. Širdyje AKT dalyvavo išankstinio kondicionavimo skatinamoje kardioprotekcijoje [23].

Įrodymai taip pat rodo, kad fosforilintas AKT skatina neuronų išgyvenimą prasidėjus smegenų išemijai [24]. Nors AKT aktyvinimas gali prisidėti prie IT indukcijos smegenyse [25], tikslus mechanizmas, susijęs su jo IPC tarpininkaujamu aktyvavimu, lieka sunkiai suprantamas. Naviko ląstelėse PI3K / AKT signalizacijos kelio aktyvinimas sukelia MDM2 fosforilinimą Ser166/186, kuris skatina MDM2 [26, 27] branduolinį perkėlimą ir padidina jo ubikvitinacijos aktyvumą [28].

Branduolyje MDM2 jungiasi prie p53 ir skatina jo ubikvitinaciją bei vėlesnį proteasomų skaidymą, o tai slopina p53 funkciją [29]. Streso sąlygomis p53 taip pat gali sukelti MDM2 per didelę ekspresiją, kuri, atvirkščiai, slopina p53 aktyvaciją neigiamo grįžtamojo ryšio kilpoje [30]. PI3K slopinimas apsaugo nuo AKT aktyvacijos [31] ir MDM2 fosforilinimo iš anksto kondicionuotoje širdyje [32].

Šiame kontekste anksčiau mes nustatėme, kad smegenų išankstinis kondicionavimas in vivo sumažino infarkto tūrį po trumpalaikio vidurinės smegenų arterijos okliuzijos (tMCAO), padidindamas MDM2 baltymo ekspresiją. Vadinasi, MDM2–p53 kompleksas susilpnino išemijos sukeltą p53/PUMA/kaspazės{5}} signalizacijos kelio aktyvavimą pirminiuose žievės neuronuose [33].

Čia mes gilinamės į PI3K / AKT signalizacijos kelio vaidmenį IPC tarpininkaujant neuronų tolerancijai vėlesniam išeminiam sužalojimui, taip pat pagrindinį mechanizmą, ir daugiausia dėmesio skiriame galimam ryšiui tarp AKT aktyvacijos ir MDM2 – p53 komplekso. .

2. Rezultatai

2.1. IPC skatinama neuroprotekcija

Tarpininkauja AKT fosforilinimas ties Ser473, MDM2 fosforilinimas ties Ser166 ir p53 destabilizacija Anksčiau aprašėme MDM2–p53 sąveikos įtaką neuronų jautrumui išemijai [34] ir IT [33]. Čia mes ištyrėme galimą AKT vaidmenį IPC tarpininkaujamoje neuroprotekcijoje kaip kandidatą dalyvauti MDM2 – p53 kelyje.

Pirma, patvirtinome, kad išemija skatino AKT aktyvaciją neuronuose, kaip rodo AKT fosforilinimas Ser473. Kaip parodyta 1A paveiksle, trumpas (20 min.) OGD reikšmingai sukėlė p (Ser473) AKT ir MDM2 ekspresiją, o AKT baltymų lygis išliko nepakitęs (S1A pav.). Tačiau AKT fosforilinimas nebuvo pastebėtas, kai neuronai buvo veikiami ilgo OGD (90 min.). Be to, MDM2 baltymų lygis buvo mažesnis, o tai atitinka didesnę p53 baltymo ekspresiją, kaip parodyta 1A paveiksle.

Nuo laiko priklausomas Mdm2 ekspresijos reguliavimas po OGD (1B pav.) patvirtina, kad poūmė išemija gali būti svarbi skatinant mechanizmus, kurie užkerta kelią p53 stabilizavimui po OGD, kaip aprašyta anksčiau [33]. Kaip IPC modelį naudojome trumpą OGD (20 min.), po to 2 val. deguonies pakeitimą (S1B pav.) [33]; taigi, mes analizavome neuronų ekstraktus, surinktus po 4 valandų reoksigenacijos po OGD (OGD / R) arba po OGD, prieš kurį buvo taikomas IPC protokolas (IPC ir OGD / R). Lygiagrečiai neuronai buvo inkubuojami normoksijos (Nx) arba išankstinio kondicionavimo (IPC) nustatymuose (S1B pav.).

Kaip parodyta 1C ir S1C paveiksluose, IPC sukėlė ankstyvą AKT aktyvavimą, kaip parodė fosforilinimas Ser473 [35], po to MDM2 baltymų stabilizavimas ir fosforilinimas Ser166. IPC taip pat užkirto kelią p53 stabilizavimui, kurį sukėlė OGD/R (1C pav.). Įdomu tai, kad 1D paveiksle parodyti imunofluorescenciniai vaizdai atskleidė, kad IPC skatino AKT fosforilinimą ties Ser473 neuronuose, kurie daugiausia kaupėsi branduolyje, ir sumažino p53 stabilizavimą po OGD/R (IPC plius OGD/R), lyginant su nekondicionuotais neuronais (OGD). /R).

Vadinasi, IPC užkirto kelią neuronų apoptozei ir kaspazės -3 aktyvacijai, kurią sukėlė OGD/R, atitinkamai matuojant srauto citometrijos (S1D pav.) ir fluorimetrijos tyrimais (S1E pav.). Norėdami patvirtinti p53 vaidmenį IPC tarpininkaujamoje neuroprotekcijoje, naudojome neuronus, ekspresuojančius (laukinio tipo; wt) arba ne (knockout; ko) p53 baltymą. Mūsų rezultatai rodo, kad neuronai, kuriems trūksta p53 (S1F pav.), buvo atsparesni OGD sukeltai apoptozei nei p53 wt neuronai.

Be to, apoptozės lygis p53KO neuronuose buvo panašus į tuos, kurie buvo stebimi iš anksto kondicionuotuose (IPC ir OGD/R) wt neuronuose (S1G pav.), taigi patvirtina pagrindinį p53 destabilizacijos vaidmenį IPC tarpininkaujamoje neuronoje [33]. Mūsų rezultatai rodo, kad IPC sukėlė neuroprotekciją nuo išeminio įžeidimo per mechanizmą, kuris apima AKT fosforilinimą Ser473, MDM2 stabilizavimą ir fosforilinimą Ser166 bei p53 destabilizavimą.

2.2. IPC suaktyvina MDM2 fosforilinimą Ser166 per PI3K / AKT kelią

PI3K/AKT signalizacijos kelias yra susijęs su neuronų IT tiek in vitro [36], tiek in vivo [37]. Tačiau IPC tarpininkaujamo PI3K / AKT kelio aktyvavimo vaidmuo reguliuojant MDM2 – p53 kompleksą lieka neištirtas. Norėdami tai išsiaiškinti, neuronai buvo inkubuojami su negrįžtamu ir specifiniu PI3K/AKT kelio inhibitoriumi wortmannin [19].

Kaip parodyta 2A paveiksle, wortmannin panaikino IPC sustiprintą (Ser473) AKT fosforilinimą ir p53 destabilizavimą, kaip parodyta 1D paveiksle. Šie rezultatai rodo tiesioginį ryšį tarp AKT aktyvacijos ir p53-sukeliamos neuronų apoptozės (S1D pav.) ir kaspazės -3 aktyvacijos (S1E pav.), sukeltos po OGD/R, slopinimo. Pagrindinis p53 stabilizavimo reguliatorius MDM2 yra AKT taikinys [26], kuris fosforilina MDM2 ties Ser166 ir Ser186 [26]. PI3K slopinimas wortmannin neleido fosforilinti tiek (Ser473)AKT, tiek (Ser166)MDM2, kurį sukėlė IPC (2B pav.).

Specifinis Akt tarpininkaujantis MDM2 fosforilinimas Ser166, sukeltas IPC, buvo patvirtintas naudojant mažą interferuojančią RNR (siRNR), specialiai sukurtą prieš AKT1 baltymą (siAkt), labai ekspresuojamą žievės neuronuose ir kurios aktyvumas yra būtinas neuronų išgyvenimui po išemijos. 38]. Kaip parodyta 3 paveiksle, siAkt sumažino bendrą AKT ir p(Ser473)AKT baltymų kiekį 3 dieną po transfekcijos tiek HEK-293T ląstelėse (3A pav.), tiek žievės neuronuose (3B pav.).

Be to, AKT numušimas (siAkt) užkirto kelią (Ser166) MDM2 fosforilinimui (3B pav.). Šie rezultatai rodo, kad IPC aktyvuotas PI3K / AKT signalizacijos kelias skatina MDM2 fosforilinimą Ser166, kuris gali būti atsakingas už MDM2 stabilizavimą ir dėl to p53 destabilizavimą po išeminio sužalojimo.

2.3. IPC aktyvuotas AKT sukelia branduolinio MDM2 baltymų stabilizavimą po išemijos

AKT aktyvinimas buvo susijęs su MDM2 branduolio perkėlimu naviko ląstelėse [26]. Atsižvelgdami į branduolinio MDM2 stabilizavimo svarbą neuronų išgyvenimui po išemijos [34] ir, konkrečiau, į jo neuroprotekcinį vaidmenį IPC [33], nusprendėme toliau tirti PI3K/AKT signalizacijos kelio svarbą reguliuojant MDM2 tarpląstelinę lokalizaciją. baltymas.

Taigi, neuronai arba HEK{0}}T ląstelės buvo transfekuotos žmogaus MDM2-pažymėtu baltymu (MDM2-GFP). Reprezentatyvūs transfekuotų HEK-293T ląstelių blotai ir vaizdai iš neuronų, negimdiškai ekspresuojančių žmogaus MDM2 baltymą po keturių skirtingų eksperimentinių sąlygų (Nx, IPC, OGD/R ir IPC plius OGD/R), parodyti 4A ir S1H paveiksluose. , atitinkamai.

Negimdinė MDM{0}} GFP ekspresija patvirtino, kad IPC skatina MDM2 branduolio kaupimąsi, palyginti su iš anksto nenumatytais išeminiais (OGD/R) arba normoksiniais (Nx) neuronais (4A, B pav.), kaip parodyta kiekybiškai įvertinus branduolio ir citozolinės fluorescencijos santykį. (S2B pav.) ir MDM{4}}GFP branduolio fluorescencijos intensyvumą (S2C pav.).

2.4. IPC skatina p(Ser473)AKT ir MDM2 sąveiką, kuri sustiprina MDM2 stabilizavimą branduolyje ir sumažina sukeltą neuronų apoptozę po išemijos

Įrodžius IPC sustiprinto PI3K / AKT kelio aktyvavimo vaidmenį MDM2 branduoliniame stabilizavime, toliau tyrėme, ar p (Ser473) AKT ir MDM2 sąveikavo branduolyje (6A pav.). MDM2 imunoprecipitacija iš branduolinių baltymų ekstraktų, po to imunoblotavimas prieš MDM2 ir p(Ser473)AKT, atskleidė, kad IPC paskatino p(Ser473)AKT ir MDM2 sąveiką po OGD/R, taip užkertant kelią OGD/R sukeltam branduolinio p53 stabilizavimui. kaip parodyta branduolio įvestyje (6A pav.).

Galiausiai, mes ištyrėme žalingą PI3K / AKT kelio sutrikimo poveikį neuronų apoptozei (6B pav.). AKT slopinimas neutralizavo apsauginį IPC poveikį prieš OGD, o tai patvirtina neuroprotekcinį AKT – MDM2 vaidmenį IT kontekste. Taigi mūsų rezultatai rodo, kad IPC sukelia AKT fosforilinimą ir aktyvavimą, kuris skatina MDM2 fosforilinimą Ser166 ir branduolio translokaciją, kur jis sąveikauja su p (Ser473) AKT. Šis mechanizmas gali prisidėti prie sustiprinto MDM2 branduolinio stabilizavimo, kuris atlieka esminį vaidmenį IPC sukeltai išeminei tolerancijai.

Kaip Cistanche apsaugo neuronus?

Yra įrodymų, kad Cistanche gali apsaugoti neuronus mažindama apoptozę (užprogramuotą ląstelių mirtį) ir skatindama neuronų išgyvenimą. Apoptozė yra natūralus procesas, vykstantis organizme, siekiant pašalinti pažeistas ar nepageidaujamas ląsteles, tačiau ji gali būti žalinga, kai vyksta per daug arba netinkamai. Laboratorinių tyrimų metu nustatyta, kad Cistanche slopina apoptozę, ir šis poveikis gali padėti apsaugoti neuronus nuo pažeidimų.

Be to, Cistanche yra daug biologiškai aktyvių junginių, kurie, kaip įrodyta, turi neuroprotekcinį poveikį. Pavyzdžiui, jame yra echinakozido, kuris, kaip įrodyta, apsaugo neuronus nuo oksidacinio streso ir uždegimo. Jame taip pat yra akteozido, kuris, kaip nustatyta, turi priešuždegiminių ir antioksidacinių savybių.

Tęsinys...

Emilia Barrio 1,†, Rebeca Vecino 1,2,†, Irene Sánchez-Morán 1, Cristina Rodríguez 1,2,3, Alberto Suárez-Pindado 1, Juanas P. Bolañosas 1,2,3,4, Angelesas Almeida 1, 2,3 ir Maria Delgado-Esteban 1,2,3,*

1 Funkcinės biologijos ir genomikos institutas, Salamankos universitetas, CSIC, 37007 Salamanka, Ispanija; emibg7@gmail.com (EB); rebecavecino@usal.es (RV); irene_sm@usal.es (IS-M.); c.rodriguez@usal.es (CR); Alsuap77@gmail.com (AS-P.); jbolanos@usal.es (JPB); aaparra@usal.es (AA)

2 Salamankos biomedicininių tyrimų institutas, Salamankos universiteto ligoninė, Salamankos universitetas, CSIC, 37007 Salamanka, Ispanija

3 Biochemijos ir molekulinės biologijos katedra, Salamankos universitetas, 37007 Salamanka, Ispanija 4 Centro de Investigación Biomédica en Red de Fragilidad y Envejecimiento Saludable (CIBERFES), Instituto de Salud Carlos III, 28029 Madridas, Ispanija} * Corres mdesteban@usal.es ; Tel.: plius 34-923-29-4908