Išankstinio kondicionavimo aktyvuota AKT kontroliuoja neuronų toleranciją išemijai per MDM2–p53 keliąⅡ

3. Diskusija

Mūsų rezultatai rodo, kad IPC tarpininkaujant PI3K / AKT signalizacijos kelio aktyvacija sukelia neuronų IT, kontroliuodamas MDM2 – p53 kompleksą pirminiuose žievės neuronuose. Pirmiausia patvirtinome išankstinio kondicionavimo efektyvumą neuroprotekcijos požiūriu [33, 39–41], naudodami patvirtintą IPC eksperimentinį modelį.

Spustelėkite, jei norite pamatyti cistanche tubulosa šalutinį poveikį Neuron

Mes nustatėme, kad eksperimentinis IPC, sukeltas trumpo (20 min.) deguonies ir gliukozės trūkumo (OGD), o po to 2 val. deguonies prisotinimo, sukėlė neuroprotekciją, kaip rodo ir neuronų apoptozės, ir kaspazės -3 aktyvacijos, kurią sukelia ilgalaikis poveikis, prevencija. OGD (90 min.), po to 4 h reoksigenacija (OGD/R). Mes parodome, kad IPC sumažina kaspazės -3 aktyvaciją žievės neuronuose, o tai koreliuoja su mažesne apoptoze po vėlesnio ir sunkesnio išeminio pažeidimo.

Pro- ir antiapoptotinių signalų pusiausvyra yra esminė siekiant užtikrinti neuronų išgyvenimą po išemijos [3,33,38,42–44]. Nors tokių įvykių svarba buvo parodyta tiek hemoraginio, tiek išeminio insulto modeliuose [43, 45], mechanizmai, reguliuojantys šiuos signalizacijos kelius, dar nėra visiškai suprantami išeminės tolerancijos kontekste. Antiapopotinio AKT ir su juo susijusių kelių vaidmuo buvo plačiai ištirtas vėžio ląstelėse [46,47] ir smegenų audiniuose [38,48]; tačiau iki šiol AKT / MDM2–p53 signalizacijos kelio vaidmuo IPC tarpininkaujant neuronų tolerancijai išeminiam sužalojimui lieka sunkiai suprantamas.

Čia mes nustatėme, kad IPC sukeltas PI3K / AKT signalizacijos kelio aktyvavimas skatina MDM2 fosforilinimą Ser166, kuris sukelia jo branduolio translokaciją ir baltymų stabilizavimą, užkertant kelią p53-sukeltai apoptozei per kaspazės-3 aktyvavimą. po išemijos. AKT aktyvinimas per fosforilinimą skatina neuronų išgyvenimą [24, 49] ir gali prisidėti prie IT indukcijos [25, 50]. Mūsų rezultatai rodo, kad santykinis AKT baltymo gausa nesikeičia esant išeminiams ar išankstiniams dirgikliams. Įdomu tai, kad mes nustatėme, kad ankstyvas PI3K sukeltas AKT fosforilinimas Ser473 apsaugo nuo išemijos sukelto p53 stabilizavimo iš anksto kondicionuotuose neuronuose.

Poveikis atsirado ne dėl p53 mRNR lygio modifikacijų [33, 34, 44], o dėl sumažėjusio p53 baltymų kiekio dėl IPC prieš OGD/R. Kadangi MDM2 yra pagrindinis p53 stabilizavimo reguliatorius ir taip pat yra tiesioginis AKT taikinys, mūsų rezultatai rodo AKT / MDM2 – p53 signalizacijos kelio vaidmenį neuronų tolerancijai išemijai. MDM2 mRNR greitai didėja po OGD [34], tačiau MDM2 aktyvumą daugiausia kontroliuoja po transliacijos modifikacijos, ypač fosforilinimas [51]. Gerai sutikdami su tuo, mes nustatėme, kad aktyvavus fosforilinimą po IPC, AKT, savo ruožtu, fosforilina MDM2 liekanoje Ser166, esančioje šalia branduolio lokalizacijos signalo [52], ir šis poveikis išlieka po OGD / R pažeidimo.

Mūsų rezultatai rodo, kad MDM2 fosforilinimas Ser166 yra pakankamas, kad per p53 destabilizaciją būtų pasiektas IPC tarpininkaujamas neuroprotekcinis poveikis. Taigi, čia mes nustatėme nuo laiko priklausomą AKT / MDM2 – p53 kelio aktyvavimą po išeminio sužalojimo ir iš tikrųjų parodome, kad IPC aktyvuotas AKT sukėlė negimdinio MDM2 branduolinį perkėlimą, taip pat endogeninių baltymų stabilizavimą.

Be to, AKT išlieka aktyvus branduolyje, kur PI3K taip pat gali migruoti reaguodamas į oksidacinį stresą ir tada lemti AKT fosforilinimą [53]. PI3K sukelto AKT arba AKT numušimo fosforilinimo slopinimas skatina MDM2 baltymo susilaikymą citoplazmoje ir neleidžia MDM2 fosforilinti Ser166, taip pat IPC sukeltą neuroprotekciją nuo išemijos sukeltos neuronų apoptozės. Priešingai, mes parodėme, kad aktyvus AKT prisijungia prie branduolinio MDM2 baltymo.

Dėl to aktyvus AKT skatina tiek MDM2 fosforilinimą, tiek jo branduolio stabilizavimą, o tai prisideda prie IPC tarpininkaujamos neuroprotekcijos. Mūsų rezultatai rodo, kad IPC skatinama neuroprotekcija priklausė nuo PI3K sukeltos AKT aktyvacijos, kuri fosforilino MDM2 ties Ser166, skatindama MDM2 branduolio kaupimąsi po išeminio įžeidimo.

Atitinkamai, PI3K / AKT slopinimas wortmanninu arba AKT išeikvojimas siRNR panaikino IPC skatinamą neuroprotekciją, o tai lėmė p53 stabilizavimą ir vėlesnę neuronų apoptozę po išemijos. Taigi mūsų rezultatai padeda išsiaiškinti esminį nuo IPC priklausomo AKT – MDM2 kelio aktyvavimo vaidmenį neuronų išgyvenime nuo išeminio pažeidimo.

P53 baltymas dalyvauja kontroliuojant neuronų mirtį / išgyvenamumą, lemiančią prognozę pacientams, sergantiems insultu [34, 42, 54], taip pat pacientams, sergantiems TIA [3]. P53 stabilizavimas pažeidžia išankstinio kondicionavimo sukeltą neuroprotekciją iki išemijos / reperfuzijos pažeidimo [33]. Todėl MDM2–p53 sąveika bus labai svarbi neuronų išgyvenimui šiame kontekste [34] ir IPC sąlygojamai tolerancijai išeminiam sužalojimui [33].

Thus, the control of such interaction will also have an impact on stroke outcomes. In this context, we recently found that a single-nucleotide polymorphism (SNP) 309T>G MDM2 promotoriuje lemia MDM2 ekspresiją ir, savo ruožtu, moduliuoja pacientų, kenčiančių nuo insulto, atsigavimą [34].

Be to, mes pastebėjome, kad Tp53 geno SNP (rs1042522) moduliuoja mitochondrijų p53 stabilizavimą ir neuronų toleranciją išemijai, tuo pačiu prognozuodamas pacientų, kuriems prieš insultą sirgo TIA, funkcinį atsigavimą [3]. Todėl p53 apoptozinių takų kontrolė bus būtina norint užtikrinti neuroprotekcinį IPC poveikį.

Šie rezultatai suteikia tyrimo metodą, kuris ateityje galėtų būti įgyvendintas pacientų labui, ir jie kelia PI3K / AKT – MDM2 – p53 signalizacijos kelią kaip esminį išankstinio kondicionavimo skatinamų IT strategijų taikinį išeminio insulto atveju. Apibendrinant, mes parodome, kad IPC sustiprintas PI3K / AKT signalizacijos kelias skatina MDM2 fosforilinimą Ser166, o tai lemia MDM2 branduolio perkėlimą ir jo stabilizavimą, o tai sukelia neuronų IT, skatindamas p53 destabilizaciją ir vėlesnį apoptotinės mirties, sukeltos po išeminio įžeidimo, inaktyvavimą.

Mūsų rezultatai pabrėžia galimą ankstyvo AKT aktyvavimo naudą IPC sukeltai neuronų tolerancijai, kuri reguliuoja MDM2 – p53 apoptotinį kelią išeminio pažeidimo metu. Šios išvados parodo galimybę suprasti mechanizmus, reguliuojančius neuronų AKT – MDM2 – p53 signalizacijos kelią, siekiant sukurti naujas neuroprotekcines strategijas, skirtas su IT susijusiems sutrikimams.

4. Medžiagos ir metodai

4.1. Pirminės žievės neuronų kultūros

Neuronų kultūros buvo paruoštos iš C57Bl/6J arba p53-null (Tp53−/−, B6.129S2, The Jackson Laboratory) pelės embriono (14.5E) žievės. Neuronai buvo pasėti 1,8 × 105 ląstelių/cm2 Neurobasal terpėje, papildytoje 2 procentais B27 ir 2 mM glutamino (Invitrogen, Madridas, Ispanija), ir inkubuojami 37 ◦C temperatūroje drėgnoje 5 procentų CO2-turinčioje atmosferoje [ 55].

4.2. Gliukozės deguonies trūkumo ir išankstinio kondicionavimo modeliai

Po 9–1{{10}} dienų in vitro (DIV) neuronai buvo veikiami deguonies ir gliukozės trūkumo (OGD), inkubuojant ląsteles 37 ◦C temperatūroje 90 min. įrengtas oro užraktas ir nuolat dujinamas 95 procentais N2/5 procentais CO2. Inkubavimo terpė (buferinis Hankso tirpalas be gliukozės: 5,26 mM KCl, 0,43 mM KH2PO4, 132,4 mM NaCl, 4,09 mM NaHCO3, 0,33 mM Na2HPO4, 2 mM CaCl2 ir pH 9, 20 mM HEPES, 20 proc. /5 procentai CO2 30 min. Tokiomis sąlygomis deguonies koncentracija inkubacinėje terpėje buvo 6,7 ± 0,5 µM, matuojant Clark tipo deguonies elektrodu [56,57].

Kai nurodyta, neuronai buvo veikiami išeminiu išankstiniu kondicionavimu (IPC; trumpas OGD 20 min., po to 2 val. deguonies prisotinimas) prieš tolesnę užsitęsusią išemiją (OGD, 90 min.) ir 4 val. reoksigenaciją (IPC plius OGD/R) (S1B pav. ). Lygiagrečiai neuronai buvo inkubuojami normoksijoje (Nx) 37 ◦C temperatūroje drėgnoje atmosferoje, kurioje yra 95 procentai oro / 5 procentai CO2 arba išeminio išankstinio kondicionavimo (IPC). Kai nurodyta, neuronai buvo inkubuojami 30 minučių prieš IPC buferiniame Hankso tirpale (pH 7,4), nesant arba esant wortmannino (100 nmol/L), kaip aprašyta anksčiau [19].

4.3. Ląstelių transfekcijos

Neuronai (8 DIV) arba HEK-293T ląstelės buvo transfekuotos plazmidiniu vektoriumi, ekspresuojančiu YFP pažymėtą Mdm2 iš MDM2 žmogaus promotoriaus. MDM2p/Mdm2-YFP buvo dovana iš Uri Alon & Galit Lahav (Addgene plazmidės Nr. 53962, Watertown, MA, JAV) [58]. Jei reikia, tuščias vektorius (pYFP) buvo naudojamas kaip kontrolė tomis pačiomis sąlygomis. Plazmidės transfekcija buvo atlikta naudojant Lipofectamine® LTX (Invitrogen, Carlsbad, MA, JAV), pagal gamintojo instrukcijas. Ląstelės buvo transfekuotos 1,5 µg/µL plazmidinių vektorių ir panaudotos po 24 val.

AKT numušimas 6 DIV neuronuose buvo pasiektas transfekuojant mažais trukdančiais dvigrandžiais ribonukleotidais (siRNR). Tikslinės sekos buvo šios: 50–CUCAAGUACUCAUUCCAGAtt–30, antisensas: 5 0–UCUGGAAUGAGUACUUGAGgg–30 (pelė, s62216, atitinkanti 1006–1025 nukleotidus, GenBank prisijungimo numeris NM{{9]}. Kaip neigiamą kontrolę naudojome Silencer™ Select Negative Control Nr. 1 siRNA (siControl). Visos siRNR buvo įsigytos iš Ambion®, Invitrogen® ir Thermo Fischer Scientific (Offenbach, Vokietija). Pagal baltymų numušimo laipsnį siRNR transfekcijos efektyvumas buvo įvertintas 70–80 procentų praėjus 3 dienoms po transfekcijos. Nutildymo eksperimentams neuronai buvo transfekuoti siRNR (10 nM), naudojant Lipofectamine® RNAiMAX (Invitrogen), vadovaujantis gamintojo instrukcijomis. Prieš naudojimą neuronai toliau buvo inkubuojami Neurobasal terpėje 72 valandas.

4.4. Apoptozinių ląstelių mirties srauto citometrinis aptikimas

Neuronai buvo atsargiai atskirti nuo plokštelių naudojant 1 mM EDTA tetranatrio druską PBS (pH 7,4) ir nudažyti aneksinu V/APC ir 7-AAD, atlikta tiksliai taip, kaip aprašyta anksčiau [55].

4.5. Kaspazės{2}} aktyvumo tyrimas

Kaspazės -3 aktyvumas buvo įvertintas ląstelių lizatuose [33] ir pagal gamintojo instrukcijas naudojant SIGMA fluorometrinio tyrimo rinkinį CASP3F ir nuskaitytas esant 405 nm bangos ilgiui. Metodas pagrįstas fluorescencinės 7-amino4-metilkumarino (AMC) dalies išsiskyrimu. AMC koncentracija apskaičiuojama naudojant AMC standartą.

4.6. Imunoblotai ir bendro imunoprecipitacijos tyrimas

Neuronai buvo lizuojami buferyje, kuriame yra 1 proc. SDS, 2 mM EDTA, 150 mM NaCl, 12,5 mM Na2HPO4 ir 1 proc. Triton X-100 (NP40: 1 proc. NP40, EDTA diK plius 5 mM, Tris pH{13). }} mM, 135 mM NaCl ir 10 procentų glicerolio, papildytas fosfatazės inhibitoriais (1 mM Na3VO4 ir 50 mM NaF) ir proteazės inhibitoriais (100 mM fenilmetilsulfonilfluorido, 50 µg/mL anti-papaino, 50 µg/mL pestatino, 50 µg/ml µg/mL amastatino, 50 µg/mL leupeptino, 50 µg/mL bestatino ir 50 µg/mL sojų pupelių tripsino inhibitoriaus), laikomi ant ledo 30 min. ir virinami 5 min. Lizuotų ekstraktų alikvotinės dalys buvo paveiktos SDS poliakrilamido geliu (MiniProtean®, Bio-Rad) ir per naktį 4 ◦ C temperatūroje nusausintos antikūnais. Naudoti antikūnai buvo anti-AKT (9272), anti-p(Ser473)AKT (9271), anti-p(Ser473)AKT (9271), anti-skaldoma kaspazė-3 (Asp175, 9661) (Cell Signaling, Danvers, MA, JAV), anti-p53 ( 554157, BD Biosciences), anti-MDM2 (2A10, ab-16895), anti (Ser166)MDM2 (ab131355), anti-GFP (ab290; taip pat aptinka YFP) (Abcam, Cambridge, JK), anti-LAMIN B (sc-374015, Santa Cruz Biotechnology, Heidelbergas, Vokietija) ir antiGAPDH (Ambion, Kembridžas, JK) per naktį 4 ◦C temperatūroje. Po inkubacijos su krienų peroksidaze konjuguotu ožkų anti-triušio IgG (Pierce, Thermo Scientific) arba ožkos antipelės IgG (Bio-Rad), membranos buvo nedelsiant inkubuojamos su sustiprinta chemiliuminescencija SuperSignal West Dura (Pierce) 5 minutes prieš veikiant Kodak. XAR-5 filmą 1–5 min., o autoradiogramos buvo nuskaitytos. Juostos intensyvumas buvo kiekybiškai įvertintas naudojant ImageJ 1.48v programinę įrangą, kaip aprašyta anksčiau [60].

Atliekant bendrą imunoprecipitacijos tyrimą, neuronai buvo lizuojami lediniame buferyje, kuriame yra 50 mM Tris (pH 7,5), 150 mM NaCl, 2 mM EDTA, 1 procentas NP-40), papildytu aukščiau aprašytais fosfatazės inhibitoriais. Išvalius šiukšles centrifuguojant, neuronų lizatai (100 mg) buvo inkubuojami su 1 mg antikūno 24 valandas 4 °C temperatūroje, po to pridedama 10 ml baltymo A-agarozės (GE Healthcare Life Sciences) 2 valandas 4 °C temperatūroje. ◦C. Imunoprecipitatai buvo plačiai plaunami lizės buferiu ir išskiriami SDS-PAGE ir imunoblotingi su nurodytais antikūnais [61]. Santykinis baltymų kiekis parodytas S1 paveiksle. Visi blotai ir gelio nuskaitymai yra įtraukti į S3 paveikslą.

4.7. Imunocitochemija ir vaizdo analizė

Neuronai buvo auginami ant stiklinių dengiamųjų stiklelių ir fiksuojami 4 procentų (m/v, PBS) paraformaldehidu 30 min. ir imuniniu būdu dažomi triušio anti-fosfoAKT (Ser473; 9271; Cell Signaling, MA, JAV), pelės anti-MDM2 (2A10, ab-16895), pelės anti-MAP2 (1:500; M#1406, Sigma-Aldrich, Sent Luisas, MO, JAV) [55], pelės anti-p53 (1:200; 554157, BD Pharmingen , San Diegas, CA, JAV) ir anti-GFP (1:1000; ab290; taip pat patvirtintas YFP aptikimui). Imuninis žymėjimas buvo aptiktas naudojant antrinius antikūnus prieš triušio IgG-Cy3 arba anti-pelės IgG-Cy2 (1:500; Jackson ImmunoResearch. Cambridge, JK).

Branduoliai buvo nudažyti 40 6-diamidino-2 fenilindoliu (DAPI; D9542, Sigma-Aldrich). Dangteliai buvo nuplauti, pritvirtinti prie stiklinių stiklelių naudojant SlowFade šviesos antiblukimą reagentą (Invitrogen) ir ištirti naudojant mikroskopą (Nikon Inverted microscope Eclipse Ti-E, (NY, JAV) su 40 × objektyvu, iš anksto sucentruotu pluošto apšvietimu Nikon Intensilight. C-HGFI ir nespalvoto įkrovimo įrenginio skaitmeninis fotoaparatas Hamamatsu ORCAER arba skenuojantis lazerinis konfokalinis mikroskopas („Spinning Disk“ Roper Scientific Olympus IX81, Tokijas, Japonija) su trimis 405, 491 ir 561 nm lazeriais, įrengtas 40×, 63× ir 100× PL Apo panardinamasis objektyvas didelės raiškos vaizdams ir įrenginio skaitmeninei kamerai Evolve Photometrics.

Visi mikroskopo nustatymai buvo nustatyti taip, kad rinktų fluorescencinius vaizdus, ​​​​mažesnius nei sodrumas, ir buvo pastovūs visuose eksperimento metu padarytuose vaizduose. Vaizdai buvo analizuojami naudojant „ImageJ 1.48v“ programinę įrangą (Nacionaliniai sveikatos institutai). P (Ser473) AKT plus ir p53 plius neuronų procentas ir p (Ser473) AKT ir p53 maksimalaus baltymų fluorescencijos intensyvumo kiekybinis įvertinimas parodytas S2A paveiksle. MDM2-GFP transfekuotuose neuronuose MDM2-GFP nukleocitoplazminis pasiskirstymas buvo apskaičiuotas kaip branduolinės vidutinės fluorescencijos ir endogeninio MDM2 citoplazminės vidutinės fluorescencijos santykis, išmatuotas 24 neuronuose (šeši neuronai vienam būklė keturiose skirtingose ​​neuronų kultūrose) (S2B pav.) [62].

Norint kiekybiškai įvertinti maksimalų endogeninio MDM2 dažymo ir pSer473AKT branduolinės fluorescencijos intensyvumą, buvo išmatuota 40 neuronų (10 neuronų vienoje būsenoje keturiose skirtingose ​​kultūrose) (S2C pav.), kaip aprašyta anksčiau [44]. 5B paveiksle parodytuose tipiniuose skerspjūvio intensyvumo profiliuose p(Ser473)AKT ir MDM2 procentas, nurodytas žemiau kiekvienos sąlygos, buvo kiekybiškai įvertintas kaip branduolio vidutinė fluorescencija. Visais atvejais branduoliai buvo nustatyti dažant DAPI. Maksimalus branduolinės MDM2 fluorescencijos intensyvumas neuronuose, apdorotuose wortmannin arba siAkt, parodytas S2D paveiksle.

4.8. Statistinė analizė

Eksperimentiniai rezultatai buvo įvertinti taikant vienpusę dispersijos analizę, po to Bonferroni post hoc testą, naudojamą kelių grupių reikšmėms palyginti. Rezultatai išreiškiami vidurkiais ± SEM. Stjudento t testas buvo naudojamas dviejų verčių grupių palyginimui. Visais atvejais p < 0.05 buvo laikomas reikšmingu (* p < 0,05, palyginti su Nx; # p<0.05 versus OGD). Statistical analyses were performed using SPSS Statistics 24.0 for Macintosh (IBM).

Kaip Cistanche apsaugo neuronus?

Yra įrodymų, kad Cistanche gali apsaugoti neuronus mažindama apoptozę (užprogramuotą ląstelių mirtį) ir skatindama neuronų išgyvenimą. Apoptozė yra natūralus procesas, vykstantis organizme, siekiant pašalinti pažeistas ar nepageidaujamas ląsteles, tačiau ji gali būti žalinga, kai vyksta per daug arba netinkamai. Laboratorinių tyrimų metu nustatyta, kad Cistanche slopina apoptozę, ir šis poveikis gali padėti apsaugoti neuronus nuo pažeidimų.

Be to, Cistanche yra keletas biologiškai aktyvių junginių, kurie, kaip įrodyta, turi neuroprotekcinį poveikį. Pavyzdžiui, jame yra echinakozido, kuris, kaip įrodyta, apsaugo neuronus nuo oksidacinio streso ir uždegimo. Jame taip pat yra akteozido, kuris, kaip nustatyta, turi priešuždegiminių ir antioksidacinių savybių.

Nuorodos

1. Emberson, J.; Lees, KR; Lydenas, P.; Blackwell, L.; Albersas, G.; Bluhmki, E.; Brott, T.; Cohenas, G.; Davis, S.; Donnanas, G.; ir kt. Gydymo atidėjimo, amžiaus ir insulto sunkumo įtaka intraveninės trombolizės su alteplaze poveikiui esant ūminiam išeminiam insultui: individualių pacientų duomenų iš atsitiktinių imčių tyrimų metaanalizė. Lancet 2014, 384, 1929–1935. [CrossRef]

2. Wang, W.-W.; Chen, D.-Z.; Zhao, M.; Yang, X.-F.; Gongas, D.-R. Anksčiau buvę trumpalaikiai išemijos priepuoliai gali turėti neuroprotekcinį poveikį pacientams, sergantiems išeminiu insultu. Arch. Med. Sci. 2017, 5, 1057–1061. [CrossRef] [PubMed]

3. Ramosas-Araque'as, JAV; Rodriguezas, C.; Vecino, R.; Garcia, EK; Alfonsas, MDL; Barba, MS; Colàs-Campàs, L.; Purroy, F.; Arenillas, JF; Almeida, A.; ir kt. Neuronų išeminę toleranciją sąlygoja Tp53 Arg72Pro polimorfizmas. Vertimas Stroke Res. 2019, 10, 204–215. [CrossRef] [PubMed]

4. Iadecola, C.; Anrather, J. Insulto tyrimas kryžkelėje: smegenų teiravimasis nurodymų. Nat. Neurosci. 2011, 14, 1363–1368. [CrossRef] [PubMed]

5. Zhao, C.; Jiang, M.; Zhang, L.; Hu, Y.; Hu, Z.; Zhang, M.; Qi, J.; Su, A.; Lou, N.; Xian, X.; ir kt. Peroksisomų proliferatoriaus aktyvuotas gama receptorius dalyvauja įgyjant smegenų išeminę toleranciją, kurią sukelia išeminis išankstinis kondicionavimas per glialinį glutamato transporterį 1 in vivo ir in vitro. J. Neurochem. 2019, 151, 608–625. [CrossRef]

6. Rodriguezas, C.; Agulla, J.; Delgado-Esteban, M. Perorientuoti smegenis: nauji požiūriai į neuroprotekciją nuo išeminio sužalojimo. Neurochem. Res. 2021, 46, 51–63. [CrossRef] [PubMed] 7. Stenzel-Poore, MP; Stevensas, SL; Xiong, Z.; Lesovas, NS; Haringtonas, AC; Mori, M.; Meleris, R.; Rosenzweig, HL; Tobaras, E.; Shaw, ET; ir kt. Išeminio išankstinio kondicionavimo poveikis genomo atsakui į smegenų išemiją: panašumas į neuroprotekcines strategijas žiemos miego ir hipoksijai tolerantiškose būsenose. Lancet 2003, 362, 1028–1037. [CrossRef]

8. Gidday, JM Smegenų išankstinis kondicionavimas ir išeminė tolerancija. Nat. Kunigas Neurosci. 2006, 7, 437–448. [CrossRef] [PubMed]

9. Stetleris, RA; Leak, R.; Gan, Y.; Lūpa.; Zhang, F.; Hu, X; Jingas, Z.; Chen, J.; Zigmondas, MJ; Gao, Y. Išankstinis kondicionavimas suteikia neuroprotekciją CNS ligų modeliuose: paradigmos ir klinikinė reikšmė. Prog. Neurobiol. 2014, 114, 58–83. [CrossRef] [PubMed]

10. Kochas, S.; Della Morte, D.; Deivis, KR; Sacco, RL; Perez-Pinzon, AM biomarkeriai išeminiam išankstiniam kondicionavimui: atsakančių asmenų paieška. Br. J. Pharmacol. 2014, 34, 933–941. [CrossRef]

11. La Russa, D.; Frisina, M.; Secondo, A.; Bagetta, G.; Amantea, D. Smegenų parduotuvėje valdomo kalcio patekimo reguliavimo faktoriaus (SARAF) ir periferinio orai1 moduliavimas po židininės smegenų išemijos ir išankstinio kondicionavimo pelėms. Neuroscience, 2020, 441, 8–21. [CrossRef]

12. Sisalli, MJ; Annunziato, L.; Scorziello, A. Novel Cellular Mechanisms for neuroprotection in ischemic preconditioning: A View from Inside Organelles. Priekyje. Neurol. 2015, 6, 115. [CrossRef]

13. Durukan, A.; Tatlisumak, T. Išankstinio kondicionavimo sukelta išeminė tolerancija: langas į endogeninę smegenų apsaugą. Exp. Vertimas Insultas Med. 2010, 2, 2. [CrossRef]

14. Broughton, BR; Reutensas, D.; Sobey, CG; Simas, K.; Politei, J.; Banikazemi, M.; Lee, P. Apoptotiniai mechanizmai po smegenų išemijos. Insultas 2009, 40, 788–794. [CrossRef]

15. Zhao, H.; Sapolskis, RM; Steinberg, GK Phosphoinositide{1}}Kinazės / Akt išgyvenimo signalų keliai yra susiję su neuronų išgyvenimu po insulto. Mol. Neurobiol. 2006, 34, 249–270. [CrossRef]

16. Uzdensky, AB Apoptozės reguliavimas penumbra po išeminio insulto: pro- ir antiapopotinių baltymų ekspresija. Apoptozė 2019, 24, 687–702. [CrossRef] [PubMed]

17. Fukunaga, K.; Kawano, T. Akt yra molekulinis taikinys signalo perdavimo terapijai esant smegenų išeminiam pažeidimui. J. Pharmacol. Sci. 2003, 92, 317–327. [CrossRef] [PubMed]

18. Zhao, EY; Efendizade, A.; Cai, L.; Ding, Y. Akt (baltymų kinazės B) ir proteinkinazės C vaidmuo išemijos-reperfuzijos pažeidime. Neurol. Res. 2016, 38, 301–308. [CrossRef] [PubMed]

19. Delgado-Esteban, M.; Martín-Zanca, D.; Andresas-Martinas, L.; Almeida, A.; Bolanos, JP PTEN slopinimas peroksinitritu suaktyvina fosfoinozitido -3-kinazės/Akt neuroprotekcinį signalizacijos kelią. J. Neurochem. 2007, 102, 194–205. [CrossRef]

20. Manningas, BD; Toker, A. AKT/PKB signalizacija: naršymas tinkle. Ląstelė 2017, 169, 381–405. [CrossRef] [PubMed]

21. Diez, H.; Garrido, JJ; Wandosell, F. Specifiniai Akt izo formų vaidmenys apoptozėje ir aksonų augimo reguliavime neuronuose. PLoS ONE 2012, 7, e32715. [CrossRef]

22. Santi, SA; Lee, H. Akt izoformos yra skirtingose ​​tarpląstelinėse vietose. Esu. J. Physiol. Physiol. 2010, 298, C580–C591. [CrossRef]

23. Yang, C.; Talukder, MH; Varadharajas, S.; Velayutham, M.; Zweier, JL Ankstyvam išeminiam kondicionavimui reikalingas Akt ir PKA sukeltas eNOS aktyvinimas per serino1176 fosforilinimą. Širdies ir kraujagyslių. Res. 2012, 97, 33–43. [CrossRef] [PubMed]

24. Ouyang, Y.-B.; Tan, Y.; Šukos, M.; Liu, C.-L.; Martone, aš; Siesjö, BK; Hu, B.-R. Išgyvenimą ir mirtį skatinantys įvykiai po trumpalaikės smegenų išemijos: Akt fosforilinimas, citochromo C išsiskyrimas ir į kaspazę panašių proteazių aktyvinimas. Br. J. Pharmacol. 1999, 19, 1126–1135. [CrossRef] [PubMed]

25. Li, S.; Hafeezas, A.; Noorulla, F.; Gengas, X.; Shao, G.; Ren, C.; Lu, G.; Zhao, H.; Dingas, Y.; Ji, X. Neuroprotekcijos išankstinis kondicionavimas: nuo hipoksijos iki išemijos. Prog. Neurobiol. 2017, 157, 79–91. [CrossRef] [PubMed]

26. Mayo, LD; Donner, DB Fosfatidilinozitolio 3-kinazės/Akt kelias skatina Mdm2 perkėlimą iš citoplazmos į branduolį. Proc. Natl. Akad. Sci. JAV, 2001, 98, 11598–11603. [CrossRef]

27. Aškroftas, M.; Liudvikas, RL; Woods, DB; Copeland, TD; Weberis, HO; Macrae, EJ; Vousden, KH HDM2 fosforilinimas Akt. Onkogenas 2002, 21, 1955–1962. [CrossRef]

28. Džou, BP; Liao, J.; Xia, W. HER-2/neu sukelia p53 ubikvitinaciją per Akt sukeltą MDM2 fosforilinimą. Nat. Cell Biol. 2001, 3, 973–982. [CrossRef]

29. Grossman, SR; Perezas, M.; Kung, AL; Juozapas, M.; Mansur, C.; Xiao, Z.-X.; Kumaras, S.; Howley, P.; Livingston, DM p300/MDM2 kompleksai dalyvauja MDM{4}}tarpininkaujant p53 degradacijai. Mol. Cell 1998, 2, 405–415. [CrossRef]

30. Totas, A.; Niksonas, P.; Qin, LL; Erhardt, P. Diferencinis kardiomiocitų išgyvenimo ir hipertrofijos reguliavimas naudojant MDM2, E3 ubikvitino ligazę. J. Biol. Chem. 2006, 281, 3679–3689. [CrossRef]

31. Hausenloy, didžėjus; Tsangas, A.; Mocanu, MM; Yellon, DM Išeminis išankstinis kondicionavimas apsaugo aktyvuodamas prosurvival kinazes reperfuzijos metu. Esu. J. Physiol. Circ. Physiol. 2005, 288, H971–H976. [CrossRef] [PubMed]

32. Mocanu, MM; Yellon, DM p53 sumažėjęs reguliavimas: naujas molekulinis mechanizmas, susijęs su išeminiu išankstiniu kondicionavimu. FEBS Lett. 2003, 555, 302–306. [CrossRef]

33. Vecino, R.; Burguete, MC; Jover-Mengual, T.; Agulla, J.; Bobo-Jiménez, V.; Salom, JB; Almeida, A.; Delgado-Esteban, M. MDM2-p53 kelias yra susijęs su išankstinio kondicionavimo sukelta neuronų tolerancija išemijai. Sci. Rep. 2018, 8, 1610. [CrossRef] [PubMed]

34. Rodriguez, C.; Ramos-Araque, M.E.; Domínguez-Martínez, M.; Sobrino, T.; Sánchez-Morán, I.; Agulla, J.; Delgado-Esteban, M.; Gómez-Sánchez, J.C.; Bolaños, J.P.; Castillo, J.; et al. Single-Nucleotide Polymorphism 309T>G MDM2 promotoriuje nustato funkcinį rezultatą po insulto. Insultas 2018, 49, 2437–2444. [CrossRef]

35. Feng, J.; Parkas, J.; Cron, P.; Hess, D.; Hemmings, BA. PKB/Akt hidrofobinio motyvo ser-473 kinazės kaip nuo DNR priklausomos baltymų kinazės identifikavimas. J. Biol. Chem. 2004, 279, 41189–41196. [CrossRef]

36. Lai, TW; Zhang, S.; Wang, YT Eksitotoksiškumas ir insultas: naujų neuroprotekcijos tikslų nustatymas. Prog. Neurobiol. 2014, 115, 157–188. [CrossRef] [PubMed]

37. Konstantinas, LC; Binder, LB; Vandresen-Filho, S.; Viola, GG; Ludka, FK; Lopes, MW; Leal, RB; Tasca, CI Fosfatidilinozitolio{2}} kinazės kelio vaidmuo NMDA išankstiniam kondicionavimui: skirtingi traukulių ir chinolino rūgšties sukeltos hipokampo neuronų degeneracijos mechanizmai. Neurotox. Res. 2018, 34, 452–462. [CrossRef]

38. Xie, R.; Cheng, M.; Li, M.; Xiong, X.; Daadi, M.; Sapolskis, RM; Zhao, H. Akt izoformos skirtingai apsaugo nuo insulto sukeltų neuronų pažeidimų, reguliuodamos mTOR veiklą. Br. J. Pharmacol. 2013, 33, 1875–1885. [CrossRef]

39. Soriano, FX; Papadia, S.; Hofmannas, F.; Hardingham, NR; Badingas, H.; Hardingham, GE Išankstinio kondicionavimo NMDA dozės skatina neuroprotekciją, didindamos neuronų jaudrumą. J. Neurosci. 2006, 26, 4509–4518. [CrossRef]

40. Grabb, MC; Choi, DW išeminė tolerancija pelių žievės ląstelių kultūroje: kritinis NMDA receptorių vaidmuo. J. Neurosci. 1999, 19, 1657–1662. [CrossRef]

41. Chen, M.; Lu, T.-J.; Chen, X.-J.; Zhou, Y.; Chen, Q.; Feng, X.-Y.; Xu, L.; Duanas, W.-H.; Xiong, Z.-Q. Skirtingi NMDA receptorių potipių vaidmenys išeminėje neuroninių ląstelių mirtyje ir išeminėje tolerancijoje. Insultas 2008, 39, 3042–3048. [CrossRef]

42. Gomezas-Sanchezas, JC; Estebanas, medicinos mokslų daktaras; Rodriguezas-Hernandezas, I.; Sobrino, T.; De La Ossa, NP; Revertė, S.; Bolaños, JP; Gonzalez Sarmiento, R.; Castillo, J.; Almeida, A. Žmogaus Tp53 Arg72Pro polimorfizmas paaiškina skirtingas funkcines insulto prognozes. J. Exp. Med. 2011, 208, 429–437. [CrossRef]

43. Xu, W.; Gao, L.; Li, T.; Zheng, J.; Shao, A.; Zhang, J. Mesencefalinis astrocitų kilmės neurotrofinis faktorius (MANF) apsaugo nuo neuronų apoptozės aktyvuodamas Akt/MDM2/p53 signalizacijos kelią intracerebrinio hemoragijos žiurkės modelyje. Priekyje. Mol. Neurosci. 2018, 11, 176. [CrossRef] [PubMed]

44. Sánchez-Morán, I.; Rodríguezas, C.; Lapresa, R.; Agulla, J.; Sobrino, T.; Castillo, J.; Bolaños, JP; Almeida, A. Branduolinis WRAP53 skatina neuronų išgyvenimą ir funkcinį atsigavimą po insulto. Sci. Adv. 2020, 6, eabc5702. [CrossRef]

45. Burmistrova, O.; Olias-Arjona, A.; Lapresa, R.; Jimenezas-Blasco, D.; Eremejeva, T.; Šišovas, D.; Romanovas, S.; Zakurdajeva, K.; Almeida, A.; Fedichev, PO; ir kt. Nukreipimas į PFKFB3 palengvina smegenų išemijos ir reperfuzijos pažeidimus pelėms. Sci. Rep. 2019, 9, 1–13. [CrossRef]

46. ​​Tu, Y.; Kimas, E.; Gao, Y.; Rankin, GO; Li, B.; Chen, YC Theaflavin-3, 30 -galatas sukelia apoptozę ir G2 ląstelių ciklo sustabdymą per Akt/MDM2/p53 kelią cisplatinai atspariose kiaušidžių vėžio A2780/CP70 ląstelėse. Tarpt. J. Oncol. 2016, 48, 2657–2665. [CrossRef] [PubMed]

47. Wan, W.; Hou, Y.; Vangas, K.; Cheng, Y.; Pu, X.; Taip, X. LXR-623-sukelta ilga nekoduojanti RNR LINC01125 slopina krūties vėžio ląstelių dauginimąsi per PTEN/AKT/p53 signalizacijos kelią. Ląstelių mirtis Dis. 2019, 10, 248. [CrossRef] [PubMed]

48. Tao, J.; Cui, Y.; Duanas, Y.; Zhang, N.; Wang, C.; Zhang, F. Puerarin sumažina judėjimo ir pažinimo sutrikimus bei hipokampo neuronų pažeidimus per PI3K/Akt1/GSK-3 signalizacijos kelią smegenų išemijos in vivo modelyje. Oncotarget 2017, 8, 106283–106295. [CrossRef] [PubMed]

49. Janelidzė, S.; Hu, B.-R.; Siesjö, P.; Siesjö, BK Akt1 (PKB) ir p70S6K pokyčiai trumpalaikėje židinio išemijoje. Neurobiol. Dis. 2001, 8, 147–154. [CrossRef] [PubMed]

50. Pignataro, G.; Boscia, F.; Esposito, E.; Sirabella, R.; Cuomo, O.; Vinciguerra, A.; Di Renzo, G.; Annunziato, L. NCX1 ir NCX3: du nauji uždelsto išankstinio kondicionavimo veiksniai smegenų išemijoje. Neurobiol. Dis. 2012, 45, 616–623. [CrossRef]

51. Li, J.; Kurokawa, M. MDM2 stabilumo reguliavimas po DNR pažeidimo. J. Cell. Physiol. 2015, 230, 2318–2327. [CrossRef]

52. Olsonas, Kolumbija; Marechalis, V.; Momandas, J.; Chen, J.; Romockis, C.; Levine, AJ Kelių mdm-2 baltymų ir mdm-2-p53 baltymų kompleksų identifikavimas ir apibūdinimas. Oncogene 1993, 8, 2353–2360. [PubMed]

53. Uranga, RM; Katz, S.; Salvador, GA Sustiprinta fosfatidilinozitolio 3-kinazė (PI3K)/Akt signalizacija turi pleiotropinių taikinių hipokampo neuronuose, veikiamuose geležies sukelto oksidacinio streso. J. Biol. Chem. 2013, 288, 19773–19784. [CrossRef] [PubMed]

55. Almeida, A.; Sánchez-Morán, I.; Rodríguez, C. Mitochondrijų ir branduolinių p53 prekyba kontroliuoja neuronų jautrumą insultui. IUBMB Life 2021, 73, 582–591. [CrossRef] [PubMed]

55. Delgado-Esteban, M.; Garcia-Higuera, I.; Meistras, C.; Moreno, S.; Almeida, A. APC/C-Cdh1 koordinuoja neurogenezę ir žievės dydį vystymosi metu. Nat. Komun. 2013, 4, 2879. [CrossRef] [PubMed]

56. Constantino, LC NMDA receptorių vaidmuo kuriant smegenų atsparumą per išankstinį ir pokondicionavimą. Senėjimas Dis. 2014, 5, 430–441. [CrossRef]

57. Almeida, A.; Estebanas, medicinos mokslų daktaras; Bolaños, JP; Medina, JM Deguonies ir gliukozės trūkumas sukelia mitochondrijų disfunkciją ir oksidacinį stresą neuronuose, bet ne astrocituose pirminėje kultūroje. J. Neurochem. 2002, 81, 207–217. [CrossRef]

58. Lahavas, G.; Rosenfeldas, N.; Sigal, A.; Geva-Zatorsky, N.; Levine, AJ; Elowitz, MB; Alon, U. P53-Mdm2 grįžtamojo ryšio kilpos dinamika atskirose ląstelėse. Nat. Genet. 2004, 36, 147–150. [CrossRef]

59. Li, J.; Karaplis, AC; Huangas, Kolumbija; Siegel, PM; Camirand, A.; Yang, XF; Muller, WJ; Kremer, R. PTHrP skatina krūties naviko atsiradimą, progresavimą ir metastazes pelėms ir yra galimas gydymo tikslas. J. Clin. Ištirti. 2011, 121, 4655–4669. [CrossRef]

60. Maestre, C.; Estebanas, medicinos mokslų daktaras; Gomez-Sanchez, JC; Bolaños, JP; Almeida, A. Cdk5 fosforilina Cdh1 ir moduliuoja ciklino B1 stabilumą eksitotoksiškumu. EMBO J. 2008, 27, 2736–2745. [CrossRef]

61. De Tudela, MV-P.; Estebanas, medicinos mokslų daktaras; Meistras, C.; Bobo-Jiménez, V.; Jiménez-Blasco, D.; Vecino, R.; Bolaños, JP; Almeida, A. Mitochondrijų ciklino B1-nuo ciklino priklausomos kinazės-1 Bcl-xL-ATP sintazės sąveikos reguliavimas lemia neuronų išgyvenimą. J. Neurosci. 2015, 35, 9287–9301. [CrossRef] [PubMed]

62. Bobo-Jiménez, V.; Estebanas, medicinos mokslų daktaras; Angibaud, J.; Sánchez-Morán, I.; de la Fuente, A.; Yajeya, J.; Nägerl, UV; Castillo, J.; Bolaños, JP; Almeida, A. APC/CCdh1-Rock2 kelias valdo dendritinį vientisumą ir atmintį. Proc. Natl. Akad. Sci. JAV, 2017, 114, 4513–4518. [CrossRef] [PubMed]