Privilegijuotieji chinolilnitronai, skirti kombinuotam išeminio insulto ir Alzheimerio ligos gydymuiⅡ

3. Medžiagos ir metodai

3.1. Sintezė

Tiksliniai QN buvo paruošti ir išgryninti, kaip parodyta papildomoje medžiagoje.

3.2. Neuroprotekcijos analizė išemijos eksperimentiniame modelyje

3.2.1. Pirminės neuronų kultūros

Pirminės neuronų kultūros buvo paruoštos iš smegenų žievės, kaip aprašyta anksčiau [16]. Smegenų žievės buvo gautos iš E16 Sprague-Dawley žiurkių embrionų, homogenizuotos ir pasėtos ant plastikinių kelių lėkštelių, iš anksto padengtų 0,05 mg/ml poli-Dlizinu, kurio tankis 2,5 × 105 ląstelės/cm2. Ląstelių kultūros buvo laikomos 6,5 proc. CO2 atmosferoje 37 ◦C temperatūroje, didelės gliukozės Dulbecco terpėje, papildytoje 15 procentų termiškai inaktyvuotu (56 ◦C, 30 min.) veršelio vaisiaus serumu. Po 24 valandų auginimo terpė buvo pakeista terpe be serumo (Dulbecco's/Ham's F12, 1:1 tūrio/tūrio, 5 mg/mL gliukozės, 2 mM L-glutamino ir 1 mM natrio piruvato ir papildyta 100 µg. /mL transferino, 100 µM putrescino, 20 nM progesterono, 30 nM natrio selenito ir 5 µg/mL insulino).

Spustelėkite, jei norite cistanche tubulosa kapsulių nuo Alzheimerio ligos

Praneštuose eksperimentuose buvo naudojamos 6-–7- dienų in vitro (DIV) neuronų kultūros, kuriose buvo 90 procentų III izotipo tubulino teigiamų brandžių neuronų, kaip aprašyta anksčiau [17]. Visas procedūras, susijusias su eksperimentais su gyvūnais, leido Ramón y Cajal ligoninės (Madridas, Ispanija) etikos komitetas.

3.2.2. Eksperimentinė neuronų kultūros ir gydymo išemija

Eksperimentinei išemijai sukelti pirminės neuronų kultūros buvo paveiktos deguonies ir gliukozės trūkumo (OGD) [18]. Nuo 6- iki 7-DIV kultūros buvo nuplaunamos ir dedamos į Dulbecco terpę be gliukozės, kuri prieš tai 30 min. buvo burbuliuojama 95 % N2/5 % CO2, ir laikomos drėgnoje anaerobinėje kameroje, kurioje yra 95 procentų N2/5 procentų CO2 dujų mišinys 37 ◦C temperatūroje 4 valandas (OGD4h). Kontrolinė grupė buvo patalpinta į Dulbecco terpę, papildytą gliukoze, ir 4 valandas laikoma normoksiniame inkubatoriuje. Po 4 valandų inkubacijos anoksinėmis (OGD4h) arba normoksinėmis (kontrolinėmis) sąlygomis kultūros ląstelės buvo greitai patalpintos į normoglikeminę auginimo terpę be serumo ir reoksigenacijos sąlygas, tada buvo pridėta junginių arba nešiklio ir ląstelės buvo palaikomos normaliomis ir normoglikeminėmis sąlygomis, kad atsigautų. 24 val.

Transporto priemonių eksperimentinėje grupėje (R24h) buvo toks pat kiekis nešiklio, kaip ir tirtų junginių (galutinė koncentracija be teksto 0,5 proc. etanolio). Po 24 valandų atsigavimo buvo nustatytas ląstelių gyvybingumas. Kiekvienai tirtai grupei buvo paskirta atsitiktinė tvarka aklai atlikti eksperimentinę procedūrą. Sudėtinių tyrimai buvo atlikti nepriklausomai nuo keturių iki aštuonių skirtingų kartų su skirtingomis kultūrų partijomis, ir kiekvienas eksperimentas buvo atliktas keturiais egzemplioriais.

3.2.3. Ląstelių gyvybingumo tyrimas

Siekiant įvertinti neuroprotekcinį junginių poveikį prieš OGD, ląstelių gyvybingumas buvo įvertintas kiekybiškai įvertinus gyvas, metaboliškai aktyvias ląsteles, nustatytas fotometrine 3-(4,5-dimetiltiazolo{{3) redukcija. }}il)-2,5-difeniltetrazolio bromidas (MTT) (Roche) į mėlyną formazano produktą.

MTT tyrimas buvo atliktas po atsigavimo laikotarpio, išskyrus OGD 4 val. grupę, kuriai MTT buvo pridėta iškart pasibaigus OGD periodui, be atsigavimo, apdorojant ląsteles 0,2 mg/mL MTT. auginimo terpėje 1,5 valandos 37 ◦C temperatūroje 6,5 procento CO2 atmosferoje. Po inkubacijos ląstelės buvo lizuojamos vienodu tūriu lizės tirpalu (10 mM HCl, 10 procentų SDS) per naktį. MTT sumažėjimas buvo kiekybiškai įvertintas absorbcijos matavimu esant 595 nm (690 nm kaip etaloninis). Sumažėjęs MTT aktyvumas reiškia mitochondrijų funkcijos sutrikimą ir yra laikomas ląstelių pažeidimo požymiu.

3.3. Neuroprotekcijos analizė AD eksperimentiniuose modeliuose

3.3.1. SHSY-5Y ląstelių kultūra

Neuroblastomos SH-SY5Y ląstelių linija buvo gauta iš Sigma-Aldrich (Madridas, Ispanija), palaikoma ir kultivuojama 1:1 Eagle's minimalios esminės terpės (EMEM) ir F12 terpės mišinyje, papildytu 10 procentų galvijų vaisiaus serumo (FBS). ), pagal anksčiau aprašytas procedūras [8].

Kultūros buvo sėjamos į kolbas ir palaikomos 37 ◦C temperatūroje drėgnoje atmosferoje, kurioje yra 5 procentai CO2 ir 95 procentai oro. Gyvybingumo tyrimams SH-SY5Y ląstelės buvo pasėtos į 96-šulinėlių plokšteles 50,000 ląstelių/šulinėlių tankiu, laikantis aprašytos procedūros [8]. Šiame tyrime visos ląstelės buvo naudojamos mažam pasėjimo skaičiui (<14).

3.3.2. Neuroprotekcijos tyrimai

Norint ištirti galimą neuroprotekcinį junginių poveikį, ląstelės buvo iš anksto inkubuojamos su junginiais 0.3, 1, 3 arba 10 µM 24 valandas. Tada ląstelės buvo inkubuojamos su 30 µM Rotenono ir 10 µM oligomicino-A (R/O) [19], Okadaic Acid (20 nM) [20] arba amiloido - 25-35 (30 µM) (Sigma-Aldrich, Madridas, Ispanija) su skirtingų koncentracijų junginiais arba be jų 24 valandas. Eksperimento pabaigoje ląstelių gyvybingumas buvo matuojamas MTT metodu, aprašytu 3.2.3 skyriuje.

3.4. Statistinė analizė

Kiekvieno gydymo rezultatai buvo apskaičiuojami ir nepriklausomai analizuojami, o informacija apie gydymą buvo slepiama viso tyrimo metu. Duomenys buvo pateikti kaip vidurkis ± SE. Dispersijos analizė (ANOVA) buvo atlikta siekiant palyginti kelių koncentracijų duomenis, atlikus post hoc testą, kai dispersijos analizė buvo reikšminga. Statistinis reikšmingumo lygis buvo nustatytas {{0}}.05 naudojant Prism statistikos programinę įrangą 5.0 (GraphPad).

3.5. ADME analizė

Junginio MC903 ADME savybės buvo įvertintos naudojant Schrödinger QikProp modulį (QikProp, versija 5.1, Schrödinger, LLC, Niujorkas, NY, JAV, 2017 m. sausio mėn.) [21–23].

4. Išvadausijos

Šiame darbe atskleidėme preliminarius rezultatus, kuriuos gavome ieškant pavienių ir naujų agentų galimam kombinuotam išeminio insulto ir AD gydymui. Priešingai nei kiti aprašyti metodai [14,15], čia pirmą kartą nagrinėjome racionaliai pagrįstą vaistų dizainą, naudodami fragmentais pagrįstą vaistų projektavimo strategiją, pagrįstą pasirinktų QN23 ir Contilisant, mūsų pažangiausių švino junginių, farmakoforų sugretinimu. atitinkamai išeminiam insultui ir AD gydymui.

Taigi, ieškodami naujų nitronų, kaip neuroprotekcinių antioksidantų, galinčių ne tik sumažinti ROS lygį, bet ir prisijungti prie biologinių taikinių bei padidinti neurotransmiterių kiekį – tai pagrindinis trūkumas AD pacientų smegenyse – susintetinome QN JMA101A, JMA98C. , DDI89, DDI88, JMA12A, JMA11A, MC903 ir MC902 (1 pav.) ir jiems buvo atlikti atitinkami fenotipiniai išeminio pažeidimo ir AD tyrimai. Dėl to MC903 galėjome identifikuoti kaip agentą, su kuriuo susidūrėte. Kalbant apie struktūrą, MC903 turi tas pačias funkcines grupes tose pačiose padėtyse kaip ir QN23, išskyrus N-propargilo piperaziną, pakeistą kitoje azotoje linijiniu trijų metileno motyvu, susietu su O (C6), o ne metoksi grupe.

Atsižvelgiant į čia pateiktus preliminarius SAR rezultatus, šis funkcinis ir farmakoforinis susitarimas atrodo labai svarbus stebimai veiklai ir į jį turėtų būti atsižvelgta tolesnėje raidoje. Taigi, MC903 yra naujas ir mažas QN potencialiai kombinuotam išeminio insulto ir AD gydymui, pasižymintis stipriomis neuroprotekcinėmis savybėmis pirminėse neuronų kultūrose OGD sąlygomis kaip eksperimentinis išemijos modelis ir neuronų linijos ląstelėse prieš R/O, OA arba 25–35 gydymo būdai, kurie imituoja AD poveikį.

Remiantis šiais daug žadančiais rezultatais, mūsų pastangos dabar yra nukreiptos į stebimą hit-MC903 farmakologinį profilį, kuriant, sintezuojant ir biologiškai įvertinant naujus susijusius QN, įskaitant susijusias fermentų ir receptorių surišimo analizes, ieškant švino-QN. atlikti tinkamus išeminio insulto ir AD gyvūnų modelius. Dabartiniai rezultatai atveria kelią naujoms terapinėms įžvalgoms ir plėtrai ieškant naujų vaistų, skirtų kombinuotam išeminio insulto ir AD gydymui.

Cista mechanizmasnche neuroprotekcinis poveikis

Cistanche yra tradicinė kinų žolė, turinti neuroprotekcinį poveikį. Šio poveikio mechanizmai nėra visiškai suprantami, tačiau mokslininkai siūlo keletą galimų mechanizmų:

1. Antioksidacinis aktyvumas: Nustatyta, kad cistanche ekstraktai pasižymi stipriu antioksidaciniu aktyvumu, kuris gali apsaugoti nuo oksidacinio streso sukeltos neuronų žalos.

2. Priešuždegiminis poveikis: uždegimas yra dažna neurodegeneracinių ligų priežastis, o cistanche ekstraktai turi priešuždegiminį poveikį, kuris gali susilpninti neuronų pažeidimus.

3. Mitochondrijų funkcijos apsauga: Mitochondrijų disfunkcija yra pagrindinis neuronų pažeidimo ir ląstelių mirties veiksnys, o cistanche ekstraktai apsaugo nuo mitochondrijų pažeidimo ir pagerina mitochondrijų funkciją.

4. Neurotrofinių faktorių aktyvinimas: Neurotrofiniai veiksniai yra cheminės medžiagos, skatinančios neuronų augimą ir išlikimą, o cistanche ekstraktai padidina neurotrofinių faktorių, tokių kaip smegenų kilmės neurotrofinis faktorius (BDNF) ir nervo augimo faktorius (NGF) raišką. .

References

1 Carney, JM; Starke-Reed, PE; Oliveris, CN; Landum, RW; Cheng, MS; Wu, JF; Floydas, RA Su amžiumi susijusio smegenų baltymų oksidacijos padidėjimo, fermentų aktyvumo sumažėjimo ir laiko bei erdvinės atminties praradimo panaikinimas, nuolat vartojant sukimąsi sulaikančio junginio N-tret-butil-alfa-fenilnitroną. Proc. Natl. Akad. Sci. JAV 1991, 88, 3633–3636. [CrossRef]

2. Klevai, KR; Žalia, AR; Floydas, RA su nitronu susijusi terapija. CNS Drugs 2004, 18, 1071–1084. [CrossRef] [PubMed]

3. Zhang, Q.; Gao, T.; Luo, Y.; Chen, X.; Gao, G.; Gao, X.; Zhou, Y.; Dai, J. Trumpalaikė židininė smegenų išemija / reperfuzija sukelia ankstyvus ir lėtinius aksoninius pokyčius žiurkėms: jos svarba Alzheimerio ligos rizikai. PLoS ONE 2012, 7, e33722. [CrossRef]

4. Kim, HA; Milleris, AA; Drummond, GR; Amanda, G.; Thrift, AG; Arumugam, televizorius; Fanas, TG; Srikanthas, VK; Sobey, CG Kraujagyslių pažinimo sutrikimas ir Alzheimerio liga: smegenų hipoperfuzijos ir oksidacinio streso vaidmuo. Naunyn-Schmiedeberg arka. Pharmacol. 2012, 385, 953–959. [CrossRef] [PubMed]

5. Ženas, G.; Kim, YT; Li, RC; Yocum, J.; Kapoor, N.; Langeris, J.; Dobrowolskis, P.; Maruyama, T.; Narumiya, S.; Doré, S. PGE2 EP1 receptorius padidino neurotoksiškumą smegenų išemijos ir Alzheimerio ligos pelių modelyje. Neurobiol. Senėjimas 2012, 33, 2215–2219. [CrossRef]

6. Macrae, MI; Allanas, SM Stroke: praeitis, dabartis ir ateitis. Smegenų neurozės. Adv. 2018, 2, 1–5. [CrossRef]

7. Čioua, M.; Martìnez-Alonso, E.; Gonzalo-Gobernado, R.; Ayuso, MI; Escobar-Peso, A.; Infantes, L.; Hadžipavlou-Litina, D.; Montoya, JJ; Montaner, J.; Alkazaras, A.; ir kt. Nauji chinolilnitronai insulto gydymui: antioksidantas ir neuroprotekcinis (Z)-N-tret-butil-1-(2-chloro-6-metoksichinolin-3-il) metenamino oksidas (kaip naujas švinas – junginys išeminiam insultui gydyti. J. Med. Chem. 2019, 62, 2184–2201. [CrossRef] [PubMed]

8. Bautista-Aguilera, OM; Hagenow, S.; Palomino-Antolìn, A.; Farré-Alìns, V.; Ismaili, L.; Joffrin, P.-L.; Jimeno, ML; Soukup, O.; Janockova, J.; Kalinovskis, L.; ir kt. Daugiaplaniai ligandai, jungiantys cholinesterazės ir monoaminooksidazės slopinimą su histamino H3R antagonizmu neurodegeneracinėms ligoms. Angew. Chem. Tarpt. Red. 2017, 56, 12765–12769. [CrossRef] [PubMed]

9. Bautista-Aguilera, OM; Budni, J.; Mina, F.; Medeiros, EB; Deuther-Conrad, W.; Entrena, JM; Moraleda, I.; Iriepa, I.; LòpezMunoz, F.; Marco-Contelles, J. Contilisant, tetra tikslinė maža molekulė, skirta Alzheimerio ligos gydymui, derinanti cholinesterazę, monoaminooksidazės slopinimą ir H3R antagonizmą su S1R agonizmo profiliu. J. Med. Chem. 2018, 61, 6937–6943. [CrossRef] [PubMed]

10. Bolea, I.; Juàrez-Jiménez, J.; de los Rìos, C.; Chioua, M.; Pouplana, R.; Luque, FJ; Unzeta, M.; Marco-Contelles, J.; Samadi, A. Donepezilo ir n-[(5-(benziloksi)-1-metil-1h-indol-2-il)metilo sintezė, biologinis įvertinimas ir molekulinis modeliavimas - nmetilprop-2-yn-1-amino hibridai, kaip nauji daugiapotenčiai cholinesterazės/monoaminooksidazės inhibitoriai, skirti Alzheimerio ligai gydyti. J. Med. Chem. 2011, 54, 8251–8270. [CrossRef] [PubMed]

11. Brouns, R.; De Deyn, PP Ūminio išeminio insulto neurobiologinių procesų sudėtingumas. Clin. Neurol. Neurocurgas. 2009, 111, 483–495. [CrossRef]

12. Marco-Contelles, J. A Tau, fojė ar religija? ACS Med. Chem. Lett. 2019, 10, 1361–1362. [CrossRef] [PubMed]

13. Oset-Gasque, MJ; Marco-Contelles, J. Alzheimerio liga, „vienos molekulės, vieno taikinio“ paradigma ir kelių taikinių nukreipto ligando metodas. ACS Chem. Neurosci. 2018, 9, 401–403. [CrossRef] [PubMed]

14. Saulė, P.; Zhou, W.; Yue, H.; Zhang, C.; O, Y.; Yang, Z.; Hu, W. Junginys AD110 veikia kaip terapinis Alzheimerio ligos ir insulto valdymas pelių ir žiurkių modeliuose. ACS Chem. Neurosci. 2020, 11, 929–938. [CrossRef] [PubMed]

15. Liu, Z.; Cai, W.; Langas, M.; Janas, R.; Li, Z.; Zhang, G.; Taip.; Wang, Y.; Saulė, Y.; Zhang, Z. Daugiafunkcinių agentų, nukreiptų į laisvuosius radikalus, monoaminooksidazę B ir cholinesterazę, neuroprotekcinis poveikis ir veikimo mechanizmai Parkinsono ligos modelyje. J. Mol. Neurosci. 2017, 61, 498–510. [CrossRef] [PubMed]

16. Quevedo, C.; Salinas, M.; Alcázar, A. 2b inicijavimo faktoriaus aktyvumą reguliuoja baltymo fosfatazė 1, kurią aktyvuoja nuo mitogeno aktyvuotos proteinkinazės (žemėlapis) priklausomas kelias į insuliną panašaus augimo faktoriaus 1-stimuliuojamose neuronų ląstelėse. J. Biol. Chem. 2003, 278, 16579–16586. [CrossRef]

17. Cid, C.; Alkazaras, A.; Regodoras, I.; Masjuán, J.; Salinas, M.; Álvarez-Cermeño, J. Išsėtine skleroze sergančių pacientų smegenų skysčio sukelta neuronų apoptozė koreliuoja su hipointensiniais pažeidimais t1 magnetinio rezonanso tomografijoje. J. Neurol. Sci. 2002, 193, 103–109. [CrossRef]

18. Čioua, M.; Salgado-Ramos, M.; Diez-Iriepa, D.; Escobar-Peso, A.; Iriepa, I.; Hadžipavlou-Litina, D.; Martínez-Alonso, E.; Alkazaras, A.; Marco-Contelles, J. Nauji chinolilnitronai, jungiantys neuroprotekcines ir antioksidacines savybes. ACS Chem. Neurosci. 2019, 10, 2703–2706. [CrossRef] [PubMed]

19. Malekas, R.; Arribas, RL; Palomino-Antolín, A.; Totosonas, P.; Demougeot, C.; Kobrlova, T.; Soukup, O.; Iriepa, I.; Moraleda, I.; DiezIriepa, D.; ir kt. Naujos dvigubos mažos molekulės, skirtos Alzheimerio ligos gydymui, sujungiančios histamino h 3 receptorių (h3r) antagonizmą ir kalcio kanalų blokadą su papildomu cholinesterazės slopinimu. J. Med. Chem. 2019, 26, 11416–11422. [CrossRef]

20. Buendia, I.; Egėja, J.; Parada, E.; Navarro, E.; Leonas, R.; Rodríguezas-Franco, MI; López, MG Melatonino-N, N-dibenzil(Nmetil)amino hibridas ITH91/IQM157 suteikia neuroapsaugą in vitro Alzheimerio modelyje per hemooksigenazės -1 indukciją. ACS Chem. Neurosci. 2015, 18, 288–296. [CrossRef]

21. Lipinskis, Kalifornija; Lombardo, F.; Dominy, BW; Feeney, PJ Eksperimentiniai ir skaičiavimo metodai, skirti įvertinti tirpumą ir pralaidumą vaistų atradimo ir kūrimo aplinkoje. Adv. Narkotikų Deliv. Rev. 2001, 46, 3–26. [CrossRef]

22. Duffy, EM; Jorgensen, WL. Modeliavimo savybių numatymas: laisvoji tirpimo energija heksadekane, oktanolyje ir vandenyje. J. Am. Chem. Soc. 2000, 122, 2878–2888. [CrossRef]

23. Jorgensenas, WL; Duffy, EM Vaistų tirpumo numatymas iš Monte Karlo modeliavimo. Bioorg. Med. Chem. Lett. 2000, 10, 1155–1158. [CrossRef]