Procianidinų apsauginis poveikis ir mechanizmai sergant Parkinsono liga in vivo ir in vitro 2 dalis

Prašau susisiektioscar.xiao@wecistanche.comDaugiau informacijos

2.7. Kompiuterių poveikis Zebrafish Larae, apdoroto MPTP, oksidaciniam stresui

Zebrafish lervų gydymas kompiuteriais sumažino MPTP sukeltą padidėjusį tarpląstelinį ROS susidarymą (7a, b pav.). Be to, lipidų peroksidacijos tyrimo rezultatai parodė, kad PC ekspozicija (16 ug/mL) blokavo MPTP sukeltą MDA lygį zebrafish lervose (7c pav.). Be to, MPTP sukeltas GSH-Px aktyvumo sumažėjimas buvo pakeistas gydant PC (16 ug/mL) (7d pav.) ir PC (4, 8 ir 16 ug/mL) padidino MPTP sukeltą CAT ir SOD sumažėjimą. veikla (7e, f pav.).

Figure 7. Effects of PCs on oxidative stress of zebrafish larvae treated with MPTP. (a)ROS levels were measured by fluorescent microscopy and imaging analysis;(b)ROS levels were measured via imageJ software;(c) MDA levels;(d) GSH-Pxactivity;(e)CATactivity;(f) SOD activity. F and p values of the one-way analysis of variance are presented above each chart.The results of Tukey's post hoc test are presented for selected comparisons: ns, p>0.05;*,p<><0.01;***, p=""><0.001; the="" error="" bars="" are="">

Norėdami sužinoti daugiau, spustelėkite čia

2.8. Kompiuterių poveikis Nr2/ARE Patlhroay MPTP sukeltai zebrafish Laroa

Zebrafish lervų gydymas kompiuteriais pabrėžė prielaidą, kad Nr2 / ARE kelių aktyvinimas buvo susijęs su PC tarpininkaujamomis apsauginėmis savybėmis. Nrf2, HO-1, NQO1, GCLC ir GCLM žymenų ekspresija buvo padidinta gydant kompiuteriu, palyginti su vien MPTP ekspozicija (8a-e pav.).

Figure 8. Effects of PCs on Nrf2/ARE pathway in MPTP-induced zebrafish larvae. (a) Nrf2 levels;(b)HO-1 levels;(c)NQO1 levels;(d) GCLClevels;(e) GCLM levels. F and p values of the one-way analysis of variance are presented above each chart. The results of Tukey's post hoc test are presented for selected comparisons: ns,p>0.05;*,p<><><0.001:the error="" bars="" are="">

3. Diskusija

Kompiuteriai pasižymi stipriu radikalų šalinimo gebėjimu ir antioksidaciniu aktyvumu, o oksidacinis stresas, kurį sukelia per didelis ROS susidarymas ir (arba) sutrikusi antioksidacinė gynybos sistema, atlieka svarbų vaidmenį PD[37-39]. Tačiau ar kompiuteriai gali atlikti neuroprotekcinį vaidmenį dėl antioksidacinio poveikio, lieka neaišku. Šiuo tyrimu buvo siekiama ištirti kompiuterių molekulinį mechanizmą prieš MPP plius / MPTP sukeltus PD modelius.

Cistanche gali pagerinti imunitetą

Šiame tyrime, palyginti su MPP plius / MPTP vien grupe, kompiuteriai žymiai padidino antioksidantų fermentų (įskaitant GSH-Px, CAT ir SOD) aktyvumo lygį ir sumažino ROS ir MDA lygį. Dabartinės išvados atitinka ankstesnį tyrimą, kuriame teigiama, kad mažas PC priedas per dietą pagerina GSH-Px, CAT ir SOD veiklą nujunkytų paršelių organizme [40]. Kitas tyrimas taip pat rodo, kad kompiuteriai žymiai padidina CAT ir SOD aktyvumą ir sumažina MDA kiekį, taip pagerindami ožkų spermos kokybę[41]. Šie atradimai rodo, kad kompiuteriai turi apsauginį poveikį oksidaciniam nervų ląstelių pažeidimui. Be to, kompiuteriai pagerino ląstelių gyvybingumą, palyginti su vien MPP plius sukeltų PC12 ląstelių grupe, žymiai padidino bendrą perkeltą atstumą ir sumažino TH plius ląstelių tankį, palyginti su MPTP grupe MPTP sukeltose zebrafish lervose. Šie duomenys rodo, kad kompiuteriai turi apsauginį poveikį nervų ląstelėms.

Be to, pastebėjome, kad kompiuteriai žymiai padidino branduolio Nrf2 kaupimąsi, palyginti su vien MPP plius PC12 ląstelėse. Iš tiesų, kompiuteriai žymiai padidino NQO1, HO-1, GCLM ir GCLC[42] ekspresijos lygius. Be to, Nfr2geno nutildymas per Nrf2 siRNR buvo naudojamas tiriant Nrf2/ARE aktyvacijos vaidmenį kompiuterių tarpininkaujamoje neuroapsaugoje nuo MPP plius sukeltos oksidacinės pažaidos: Nrf2-siRNR transfekuotos ląstelės parodė ryškų Nrf2 ekspresijos sumažėjimą. Šiame dabartiniame tyrime taip pat nustatyta, kad Nrf2 išmušimas panaikino tiek kompiuterių sukeltą apsaugą nuo MPP plius gydomų ląstelių gyvybingumo sutrikimų, tiek kompiuterių antioksidacinį poveikį. Šie rezultatai atitinka ankstesnį tyrimą, kuriame teigiama, kad pagerinus Nrf2/ARE kelio aktyvavimą prisidedama prie neuroprotekcijos [43].

Nrf2/ARE kelias yra svarbus antioksidacinis kelias [44-46]. Paprastai Nrf2 yra citoplazmoje, kur yra prijungtas prie slopinančio baltymo Keapl [47, 48]. Kai ląstelės patiria oksidacinį stresą, Nrf2 atsiskiria nuo Keap1, inicijuoja endogeninę antioksidacinę gynybos sistemą ir vėliau persikelia į branduolį [46, 49, 50]. Tada jis sąveikauja su ARE, kad suaktyvintų daugybę ląsteles apsaugančių ir antioksidacinių genų, įskaitant GCLC, GCLM, NQO1 ir HO-1 [51-54]. Reaguodamas į oksidacinį stresą, Nrf2 atsiskiria nuo Keap1 citozolyje ir po to perkeliamas į branduolį, prisijungdamas prie ARE sekos, kad suaktyvintų krioprotekcinių genų transkripciją [53-58]. Dabartiniai rezultatai rodo, kad kompiuteriai gali aktyvuoti Nrf2/ARE kelią, perkelti Nrf2 iš citoplazmos į branduolį, kauptis branduolyje, sureguliuoti GCLC, GCLM, NOO1 ir HO-1 ekspresiją ir pagerinti gebėjimą ląstelės atsispiria oksidaciniam stresui. Iš tiesų, Nrf2 / ARE kelias gali būti farmakologinis kompiuterių taikinys PD prevencijai.

4. Medžiagos ir metodai

4.1. Cheminiai junginiai ir reagentai

MPP plus ir MPTP agentai buvo įsigyti iš „Sigma“ (St. Louis, MO, JAV), o ląstelių skaičiavimo rinkinys{0}} buvo gautas iš „Beyotime“ (Šanchajus, Kinija). PC, 2', 7/-dichlorfluorescino diacetatas, MDA, GSH-Px, SOD ir CAT diagnostikos rinkiniai buvo gauti iš Solarbio (Pekinas, Kinija). RNAiso Plus, PrimeScriptTMRT reagentų rinkinys su gDNA Eraser ir SYBRPremix Ex TaqTMⅡI buvo įsigyti iš Takara (Shiga, Japonija); Nrf2-siRNR, kontrolinė siRNR ir Lipofectamine 2000 buvo gauti iš GenePharma (Šanchajus, Kinija). Galiausiai pirminiai antikūnai Nrf2, HO-1, GCLC, GCLM, NAD(P)H: NQO1, laminatas B, GAPDH, antitirozino hidroksilazė (TH) ir atitinkami antriniai antikūnai buvo gauti iš Proteintech (Uhanas, Kinija). ).

4.2.Ląstelių kultūra

PC12 ląstelės buvo gautos iš Nacionalinės autentifikuotų ląstelių kultūrų kolekcijos. Ląstelės buvo laikomos DMEM, papildytu 10 procentų galvijų vaisiaus serumo ir penicilino-streptomicino (100 U/mL; 100 ug/mL), drėgnoje atmosferoje inkubatoriuje 37 laipsnių temperatūroje su 5 procentais CO2 [59].

4.3. Ląstelių gyvybingumo tyrimas

PC12 ląstelės (1 × 104 ląstelės / duobutėje) buvo inkubuojamos su 1, 2 arba 4 ug / ml PCsor deprenvl (30 μM) 24 valandas, o po to inkubuojamos su 1, 5 mM MPP plius 24 valandas. Tada į kiekvieną šulinėlį įpilta 10 μL ląstelių skaičiavimo rinkinio{12}} tirpalo ir inkubuojama 1 val. Absorbcija buvo matuojama esant 450 nm [60].

4.4. Žuvies priežiūra

Etinį patvirtinimą naudoti gyvūnams suteikė Džedziango universiteto eksperimentinio gyvūnų centro gyvūnų apsaugos ir naudojimo komitetas (ZJU20200125). Suaugę zebrafish (AB padermė) buvo gauti iš Zhejiang universiteto (Hang Zhou, Kinija) laboratorinių gyvūnų centro ir laikomi 28 ± 1 laipsniu 14 valandų šviesos / 10 valandų tamsos ciklais. Žuvys buvo šeriamos Artemia nauplii du kartus per dieną [61]. Embrionams gaminti suaugusios zebražuvės per naktį buvo patalpintos į veisimosi rezervuarus, santykiu 1:1 patinų ir patelių. Nerštas buvo suaktyvintas kitą rytą įjungus šviesas ir baigtas per 2 valandas. Embrionai buvo užauginti embrionų vandenyje (13,7 mM NaCl, 540 μM KCl, 25 uM Na2HPOA44 uM KHPOA, 300 uM CaCl2, 100 μM MgSO ㉉, 420 μM NaHCO3, pH 3, 6 laipsnis 6).

4.5. ROS matavimas

Norint išmatuoti ROS gamybą, PC12 ląstelės (2 × 104 ląstelės / duobutėje) buvo veikiamos 1, 2 arba 4 ug/mL PC arba deprenilo (30 μM) 24 valandas, tada inkubuojamos su 1,5 mM MPPt. 24 valandas 【64】. Ląstelės buvo veikiamos 10 μM 2',7'-dichlorfluorescino diacetato tirpalu tamsiomis sąlygomis 30 min.; tada dažų tirpalas buvo pašalintas, o ląstelės tris kartus plaunamos fosfatiniu buferiniu tirpalu (PBS). Ląstelių vaizdai buvo stebimi naudojant Olympus lazerinį skenuojantį konfokalinį mikroskopą (Olympus, Tokijo sostinė, Japonija). Ląstelių fluorescencijos intensyvumas buvo kiekybiškai įvertintas naudojant Image J programinę įrangą v1.8.0 (Olympus, Tokijo sostinė, Japonija). Rezultatai išreiškiami procentais nuo ROS regionų ploto kontrolinėje grupėje.

Norint išmatuoti ROS gamybą, zebrafish lervos praėjus 3 dienoms po apvaisinimo (dpf) buvo veikiamos deprenilo (40 μM) arba 4,8 arba 16 ug/mL PC su 400 μM MPTP arba be jo 4 dienas. Zebrafish lervos, esant 7 dpf, buvo perkeltos į 24-šulinėlių plokštelę (10 lervų vienoje grupėje), apdorotos 20 μM 2',7'-dichlorfluorescino diacetato tirpalu ir inkubuojamos 60 minučių tamsoje 28,5 laipsnių temperatūroje [65] ]. Tada lervos tris kartus plaunamos embriono terpe, kad būtų pašalintas 2',7'-dichlorfluorescino diacetato perteklius. Dažytų lervų vaizdai buvo stebimi naudojant Olympus lazerinį skenuojantį konfokalinį mikroskopą. Atskiros lervos fluorescencijos intensyvumas buvo kiekybiškai įvertintas naudojant Image J programinę įrangą. Rezultatai išreiškiami procentais nuo ROS regionų ploto kontrolinėje grupėje. 4.6.MDA, GSH-Px, SOD ir CAT įvertinimas

PC12 ląstelės (2 × 104 ląstelės / duobutėje) buvo veikiamos 1, 2 arba 4 ug / ml PC arba deprenilo (30 μM) 24 valandas, o po to inkubuojamos su 1, 5 mM MPP plius 24 valandas. Tada į 4 × 10 laipsnių ląsteles buvo pridėta 1 ml ekstrakto, o ląstelės buvo sulaužytos ultragarsu centrifuguojant 8000 aps./min 4 laipsnių kampu 10 min. Tada supernatantas buvo uždėtas ant ledo, kad būtų atliktas tyrimas, ir buvo pridėta reagentų atitinkamai MDA, GSH-Px, SOD ir CAT nustatyti. Kiekvienas indeksas buvo pakartotas trimis egzemplioriais.

Zebrafish lervos, esant 3dpf, buvo inkubuojamos su deprenilu (40 μM) arba 4,8 arba 16 ug/mL kompiuterių su 400 μM MPTP arba be jo 4 dienas. Tada 0, 05 g zebrafish lervų audinio ir 0, 5 ml ekstrakto buvo homogenizuoti ledo vonioje ir centrifuguoti 4 laipsnių temperatūroje 10 minučių. Supernatantas buvo padėtas ant ledo tyrimui. Vėliau buvo pridėti reagentai atitinkamai MDA, GSH-Px, SOD ir CAT nustatyti. Kiekvienas indeksas buvo pakartotas trimis egzemplioriais.

4.7. Visų ląstelių, citoplazminių ir branduolinių baltymų paruošimas

Visų ląstelių baltymų ekstrahavimui ląstelės buvo surinktos ir 30 minučių ant ledo inkubuojamos su RIPA lizės buferiu, kuriame yra 1 procentas PMSF ir 1 procentas proteazės inhibitorių kokteilio. Ląstelių lizatai buvo centrifuguojami, o supernatantas buvo surinktas ir laikomas. Subląsteliniam frakcionavimui paruošti ląstelių mėginiai buvo apdoroti naudojant branduolinio ir citoplazminio baltymų ekstrahavimo rinkinį. Baltymų kiekis buvo tiriamas naudojant BCA (Beyotime, Šanchajus, Kinija) tyrimą.

4.8. Nrf2 siRNA transfekcija

Nrf{0}}siRNR buvo panaudota numušant Nrf2. Pagal vadovą, PC12 ląstelės buvo transfekuotos Nrf2-siRNR (80 nM) arba kontroline siRNR, naudojant Lipofectamine 2000. 4.9. Vakarų blotingas

Baltymų mėginiai buvo išskirti SDS-PAGE ir perkelti į polivinilideno difluorido (PVDF) membranas. Blotai buvo veikiami atitinkamais pirminiais antikūnais: Nrf2, Keap1, HO-1, NQO1, GCLC, GCLM, Lamin B, GAPDH ir peroksidaze konjuguotais antriniais antikūnais. Baltymų juostos buvo vizualizuotos naudojant ECL (Beyotime, Šanchajus, Kinija) ir Western blot aptikimo reagentus [36, 43].

4.10.Lokomotorinio elgesio testas

Zebrafish lervos, esant 3dpf, buvo inkubuojamos su deprenilu (40 μM) arba 4, 8 arba 16 ug / ml kompiuteriais su 400 uM MPTP arba be jo 4 dienas. Tada 7 dpf zebrafish buvo dedamas į 24-šulinėlių lėkštes (1 žuvis vienoje duobutėje ir 12 lervų vienoje grupėje), ir užregistruotas bendras atstumas, kurį kiekviena žuvis nuplaukė per 10 minučių. Zebrafish elgesys buvo stebimas ir analizuojamas naudojant automatinę vaizdo stebėjimo sistemą (Any-maze 4.73, Stoelting, Wood Dale, IL, JAV)[66].

4.11. Bendra RNR ekstrakcija, atvirkštinė transkripcija ir kiekybinė polimerazės grandininė reakcija realiuoju laiku

RNR buvo išgauta naudojant RNAiso Plus pagal gamintojo instrukcijas. RNR buvo atvirkštinė transkribuota naudojant PrimeScriptTMRT reagentų rinkinį su gDNA Eraser, vadovaujantis gamintojo instrukcijomis. Kiekybinė realaus laiko PGR analizė atlikta naudojant Applied Biosystems ViATM 7 Real-Time PGR sistemą, naudojant SYBRPremix Ex TaqTM II (Takara, Shiga, Japonija). -aktinas buvo naudojamas kaip etaloninis genas, o santykinė geno ekspresija buvo apskaičiuota naudojant 2-△Ct metodą. Tyrime panaudotos pradmenų sekos išvardytos 1 lentelėje.

4.12. Zebrafish antitirozino hidroksilazės(TH) viso kalno imuninis dažymas

Zebrafish lervos, esant 1 dpf, buvo inkubuojamos su deprenilu (40 μM) arba 4,8 arba 16 ug/mL kompiuterių su 400 uM MPTP arba be jo 2 dienas (10 žuvų / grupės partijų). Lervos buvo fiksuotos 4 procentų paraformaldehidu PBS 30 minučių. Po fiksavimo jie buvo apdoroti, kad būtų atliktas visas TH imuninis dažymas [67]. Kambario temperatūroje 2 procentai (t/o) ėrienos serumo ir 0,1 procento (w/ø) galvijų serumo albumino (BSA) buvo blokuojami fosfatiniu buferiniu tirpalu Tween-20 (PBST) 1 val. Tada jie buvo veikiami blokuojančiame buferyje antitirozinohidroksilazės antikūnas (1:200 praskiestas, Proteintech) 2 valandas, o po to 6 kartus skalaujamas PBST. Paskutinis viso imuninio dažymo etapas buvo atliktas dažymo buferyje su 488 ožkų antitriušiu (1:500) 1 valandą ir vėl plaunamas PBST. Pakankamai išvysčius spalvą, zebražuvės buvo plokščiai pritvirtintos 3,5 procmetilceliuliozėir vaizduojamas naudojant Olympus lazerinį skenavimo konfokalinį mikroskopą.

4.13. Statistinė analizė

Skirtingų grupių vidurkiams palyginti buvo naudojama vienpusė dispersijos analizė (ANOVA), po kurios buvo atliktas Tukey daugkartinio palyginimo testas. Graphpad Prism v6.01 (GraphPad Software, San Diego, CA, JAV) buvo naudojama statistinei analizei ir grafikų braižymui.

5. Išvados

Apibendrinant, mūsų išvados rodo, kad kompiuteriai daro neuroprotekcinį poveikį aktyvuodami Nrf2 / ARE kelią ir jo pasroviui.detoksikacijairantioksidantas fermentai. Kartu šios įžvalgos rodo, kad kompiuteriai gali būti naudingi gydant PD.

Šis straipsnis ištrauktas iš Molecules 2021, 26, 5558. https://doi.org/10.3390/molecules26185558 https://www.mdpi.com/journal/molecules