Apsauginis Cistanche poveikis nuo H2O2/UVB sukelto odos fibroblastų kolageno skaidymo per Hsa-mikroRNR{4}}tarpininkaujamą TGF/Smad signalizaciją
May 06, 2023
SANTRAUKA
Šiuo tyrimu buvo siekiama ištirti mechanizmą, kuriuo grindžiamasapsauginis cistanche poveikisnuo H2O2/UVB sukeltos žalos, naudojant fotopažeidimų in vitro ir in vivo modelius. Be to, mes nustatėme miRNR reguliavimo dalyvavimą šiame procese. H2O2/UVB apdoroti HS68 žmogaus odos fibroblastai ir UVB sukeltos nuogos C57BL/6J pelės buvo naudojamos kaip fotopažeidimo in vitro ir in vivo modeliai. Rezultatai tai parodėgydymas cistanchesumažino H2O2/UVB sukeltą ląstelių gyvybingumo sumažėjimą, TGF / Smad signalizacijos sutrikimasir odos senėjimą. Remiantis mikroRNR masyvo analizės ir duomenų bazės paieškų rezultatais, has-miR-4535 buvo nustatytas kaippotencialus kandidatas miRNR, nukreiptas į Smad4. In vitro gydymas cistanche aktyvavo Smad2/3/4 kompleksą ir slopino hsa-miR-4535 ekspresiją H2O2/UVB paveiktose ląstelėse. In vivo, vietinis mažų (12 mg/kg) ir didelių (24 mg/kg) cistanche dozių tepimas ant C57BL/6J nuogų pelių nugaros odos žymiai sumažino UVB sukeltą odos fotopažeidimą, skatindamas TGF / Smad kolageno sintezės signalus. mažina epidermio hiperplaziją, raukšlių susidarymą ir odos senėjimą, taip pat slopina hsa-miR-4535 ekspresiją. Apibendrinant, mūsų išvados rodo ryšį tarp hsa-miR-4535 ir TGF / Smad kolageno sintezės signalizacijos ir rodo, kad šie veiksniai gali būti įtraukti į odos fibroblastų cistanchos fotoapsauginį mechanizmą nuo H2O2/UVB sukelto senėjimo. Įrodymai parodė, kadcistanche su senėjimą stabdančiomis savybėmisgali būtilaikomas papildymuodos priežiūros produktai.
Parduodamas Cistanche odos priežiūros produktas
ĮVADAS
Klinikiniai žmogaus odos senėjimo požymiai yra padidėjęs raukšlėjimas, laisvumas ir netaisyklinga pigmentacija [1]. Odos senėjimo procesas yra sudėtingas ir gali būti suskirstytas į du tipus: vidinį senėjimą ir išorinį senėjimą. Vidinis senėjimas atsiranda dėl praeinančio laiko ir genetinių veiksnių, o išorinis senėjimas, dar vadinamas fotosenėjimu, daugiausia atsiranda dėl ultravioletinės spinduliuotės poveikio [2, 3]. Ankstesni tyrimai parodė, kad tiek vidinio, tiek išorinio senėjimo metu susidaro gausios reaktyviosios deguonies rūšys (ROS). ROS kaupimasis gali sukelti mitogeno aktyvuotos proteinkinazės (MAPK) signalizaciją ir suaktyvinti jo pasroviui esantį transkripcijos faktorių, aktyvatoriaus baltymą -1 (AP-1). Suaktyvintas AP-1 gali persikelti į branduolį ir prisijungti prie matricos metaloproteinazių (MMP) promotorių sričių [4]. MMP yra didelė nuo cinko priklausoma endopeptidazės grupė, prisidedanti prie odos dermos ekstraląstelinės matricos (ECM) irimo. Visų pirma, MMP-1, kolagenazė, dalyvauja skaidant I ir III tipo kolageną [5]. I ir III tipo kolagenas, pagrindiniai ECM komponentai, gali palaikyti ir stiprinti odos dermą, o jų išsidėstymas lemia būdingą senstančiai odos raukšlėjimąsi ir laisvumą [6]. Transformuojantis augimo faktorius-beta (TGF ) yra visur esantis ir stiprus citokinas, turintis tris skirtingas izoformas – TGF 1, TGF 2 ir TGF 3, galintis teigiamai reguliuoti kolageno sintezę žmogaus odos dermoje [2]. TGF inicijuoja savo signalą sąveikaudami su specifiniais ląstelės paviršiaus serino/treonino kinazės receptorių kompleksais, įskaitant I (TRI) ir II tipo (TRII) TGF receptorius. T RI fosforilinimas sukelia R-Smad (Smad2 ir Smad3) fosforilinimą. Suaktyvinti R-Smad sąveikauja su Smad4, kad reguliuotų jo branduolio translokaciją ir transkripcijos būdu aktyvuotų I ir III tipo kolageną, prisijungdami prie Smad surišančių elementų (SBE) promotorių [7, 8]. Vis daugiau įrodymų rodo, kad padidėjęs ROS susidarymas, kurį sukelia vidinis arba fotosenėjimas, prisideda prie TGF / Smad signalizacijos kelio pažeidimo, o tai savo ruožtu sumažina kolageno sintezę žmogaus odos odos fibroblastuose [9, 10]. cistanche (3,5,7-trihidroksiflavonas), natūralus flavonoidų šeimos narys, gausu Alpinia officinarum ir propolyje. cistanche yra potencialus kandidatas gydyti išeminį insultą, diabetą ir įvairius vėžio tipus [11–13]. Be to, cistanche turi radikalų šalinimo ir priešuždegiminį poveikį [14, 15]. Anksčiau parodėme, kad cistanche sumažino H2O2-sukeliamą uždegimą ir skatino kolageno susidarymą per insulino tipo augimo faktoriaus 1 receptorių (IGFI-R)/ERK1/2 signalizacijos kelius HS68 ląstelėse [16, 17]. Be to, tyrimas parodė, kad cistancha buvo nustatyta kaip Alpinia officinarum junginys ir turi kolagenazę slopinantį poveikį odos fibroblastų ląstelėse [18]. Tačiau išsamesnis molekulinis mechanizmas, susijęs su tuo, kaip cistanche reguliuoja odos senėjimą, nežinomas. MikroRNR (miRNR) yra mažų, vienagrandžių, nekoduojančių RNR molekulių, kurių vidutinis ilgis yra 22 nukleotidai, grupė. Subrendusios miRNR yra transkribuojamos iš DNR sekų. Daugeliu atvejų subrendusios miRNR prisijungia prie tikslinių mRNR 3′-netransliuojamų regionų (UTR), kad nutildytų mRNR transliaciją [19]. Žmogaus odoje miRNR vaidina lemiamą vaidmenį reguliuojant ląstelių metabolizmą, vėžį, senėjimą ir kolageno susidarymą [20–23]. Pavyzdžiui, miR-377 gali sukelti odos fibroblastų senėjimą, slopindamas DNR metiltransferazės 1 (DNMT1) ekspresiją, o tai vėliau sumažina p53 promotoriaus metilinimą ir odos fibroblastų senėjimą [22]. Anksčiau buvo ištirtas miRNR profilis UVB sukeltame žmogaus odos papilių ląstelių (nHDP) pažeidime [24]. Tačiau kaip UVB sukeltas odos fibroblastų senėjimas reguliuojant miRNR, ypač dalyvaujant natūraliam junginiui, iš esmės nežinoma. Šiuo tyrimu buvo siekiama ištirti apsauginį cistanche poveikį nuo H2O2/UVB sukeltų odos pažeidimų, taip pat mikroRNR sukeliamo kolageno skaidymo vaidmenį šiame procese. Mes taip pat siekėme nustatyti mikroRNR, dalyvaujančias reguliuojant kolageno sintezę.
REZULTATAI
cistanche slopina UVB/H2O2-sukeltą citotoksiškumą HS68 žmogaus odos fibroblastuose
Norint ištirti cistancho citotoksiškumą (1A pav.) in vitro, HS68 ląstelės buvo apdorotos skirtingomis cistanche dozėmis (0, 10, 20, 30, 40, 50 μM) 24 val. MTT tyrimo rezultatai parodė, kad cistanche nebuvo citotoksiškas HS68 ląstelėms (1B pav.). Tada HS68 ląsteles paveikėme skirtingomis H2O2 (0, 100, 150, 200, 250, 300 μM) ir UVB (0, 25, 30, 40, 50, 60 mJ/cm²) dozėmis 24 valandas. Gydymas H2O2 ir UVB sumažino ląstelių gyvybingumą priklausomai nuo dozės (1C, 1D pav.). Įvertinti cistanche citoprotekcines savybesH2O2 ir UVB poveikio, apdorojome HS68 ląstelęskirtingos cistancho koncentracijos (10, 20, 30 μM)sekdamas H2O2- (200 μM) ir UVB sukeltas (40mJ/cm²) žalą. H2O2 arba tik UVB gydymasžymiai sumažino (40 proc.) HS68 gyvybingumąląstelės. Tačiau gydymas cistanche užkirto kelią ląstelių mirčiaipriklausomai nuo koncentracijos (1E, 1F pav.).Didesnė cistanche koncentracija (30 μM) aiškiaiallevidavė H2O2- ir UVB sukeltas citotoksiškumas.Todėl buvo naudojama 30 μM cistanche dozėvėliauin vitrotyrimai, siekiant įvertinti jo apsaugąpoveikis HS68 ląstelėse.
1 pav. cistanche slopina UVB/H2O2-sukeltą citotoksiškumą HS68 žmogaus odos fibroblastuose. (A) Cistanche cheminė struktūra. (B) HS68 ląstelių gyvybingumas, apdorotas skirtingomis cistanche koncentracijomis (10, 20, 30, 40, 50 µM ) 24 val. (C ir D) HS68 ląstelių, 24 valandas veikiamų skirtingomis H2O2 dozėmis (100, 150, 200, 250, 300 µM) arba apšvitintų UVB (25, 30, 40, 50, 60 J/cm2), ląstelių gyvybingumas. (E ir F) HS68 ląstelių gyvybingumas, veikiamas H2O2 (200 µM) arba apšvitintas UVB (40 J/cm2) 1 valandą, o po to 23 valandas apdorotas cistanche (10, 20, 30 µM). Citoprotekcinis cistanche poveikis buvo nustatytas MTT tyrimu. Kontrolinėms ląstelėms buvo priskirtas 100 procentų gyvybingumas. Reikšmės rodomos kaip vidurkis ± SE. Rodomas rezultatų kiekybinis įvertinimas (n=3) *P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001, palyginti su neapdorotomis kontrolinėmis ląstelėmis; ##P < 0,01, ###P < 0,001, palyginti su H2O2 arba UVB apdorotomis ląstelėmis.
Cistanche susilpnina H2O2-sukeltas HS68 ląstelessenėjimas, o ne apoptozė
Cistanche susilpnina UVB/H2O2-sukeliamą tarpląstelinę/mitochondrijų ROS gamybą ir MMP disbalansą HS68 ląstelėse
cistanche susilpnina H2O2-sukeltą TGF /Smadkolageno sintezės kelio pažeidimas HS68 ląstelėse
Gydymas Cistanche sumažina H2O2-sukeliamą padidintą hsa-miR-4535 ekspresiją, kuri, kaip manoma, bus skirta Smad4
4 pav. cistanche susilpnėja H2O2-sukeltas TGF /Smad kolageno sintezės kelio pažeidimas HS68 ląstelėse. (A) HS68 ląstelės buvo veikiamos H2O2 (200 µM) 1 val., o po to 23 valandas apdorojamos cistanche (30 µM). Su kolageno sinteze susijusių kelio komponentų (TGF , p-smad2/3, Smad4, COL1A1, COL3A1) ir su kolageno skaidymu susijusio baltymo (MMP-1) baltymų ekspresija buvo aptikta Western blot metodu. (B) p-smad2/3 ir Smad4 baltymų ekspresija branduolinėse ir citozolinėse frakcijose buvo aptikta Western blot metodu. GAPDH buvo naudojamas kaip pakrovimo kontrolė. Reikšmės rodomos kaip vidurkis ± SE. Rodomas rezultatų kiekybinis įvertinimas (n=3) *P < 0.05, **P < 0,01, ***P < 0,001 vs. neapdorotos kontrolinės ląstelės; #P < 0,05, ##P < 0,01, ###P < 0,001, palyginti su H2O2-apdorotomis ląstelėmis. (C) Anti-p-Smad2/3, Smad4 antikūnas ir FITC/PE konjuguotas antrinis antikūnas buvo naudojami aptikti p-Smad2/3 (žalia) ir Smad4 (raudona) ekspresiją. DAPI nurodė branduolio vietą (mėlyna). Vaizdai buvo užfiksuoti naudojant fluorescencinį mikroskopą (200 ×).
Smad4 moduliavimas has-miR-4535 dalyvauja kolageno sintezėje H2O2-paveiktuose žmogaus odos dermos fibroblastuose
ir COL3A1 lygius (7F pav.). Per didelis hsa-miR-4535 (8A–8C pav.) arba Smad4 slopinimas siRNR (8D pav., 8E) sumažino kolageno sintezę apdorojant cistanku po H2O2 poveikio. Keista, kad ir tiesioginis Smad4 nutildymas, ir gydymas hsa-miR-4535 imituoja atvirkštinę cistanche sukeltą kolageno sintezę H2O2- apdorotose HS68 ląstelėse. Apibendrinant padarėme išvadą, kad cistanche reguliuoja kolageno sintezę, galbūt mažindamas hsa-miR{20}} lygį, kad sustiprintų Smad4 signalizaciją HS68 ląstelėse, veikiamose H2O2.
cistanche pagerina TGF / Smad kolageno sintezės kelią ir susilpnina odos senėjimą, taip pat slopina has-miR-4535 ekspresiją UVB veikiamose HS68 ląstelėse
Vietinis cistanche naudojimas susilpnina UVB sukeltą odos hiperplaziją ir kolageno skaidymą, taip pat sustiprina TGF / Smad signalizaciją C57BL6/J nuogų pelių nugaros odoje.
6 pav. cistanche padidina Smad4 ekspresijos reguliavimą, sumažindamas hsa-miR-4535 lygį. (A, B) HS68 ląstelės buvo apdorotos skirtingomis H2O2 koncentracijomis (0, 100, 20{{30}} µM ) 24 val. (C, D) HS68 ląstelės buvo veikiamos H2O2 (200 µM) 1 valandą, o po to 23 valandas buvo apdorotos cistanche (30 µM). hsa-miR-4535 ir Smad4 ekspresija buvo aptikta naudojant qRT-PGR. Reikšmės rodomos kaip vidurkis ± SE. Rodomas rezultatų kiekybinis įvertinimas (n=3) *P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001, palyginti su neapdorotomis kontrolinėmis ląstelėmis; ##P < 0,01, ###P < 0,001, palyginti su H2O2-apdorotomis ląstelėmis.
7 pav. Per didelis hsa-miR-4535 ekspresija arba slopinimas reguliuoja kolageno sintezę HS68 ląstelėse. (A–C) HS68 ląstelės buvo transfekuotos hsa-miR-4535 inhibitoriumi (40 nM) arba inhibitoriumi NC (40 nM) 1 val., o po to apdorojamos H2O2 (2 00 μM) 23 val. (D–F) HS68 ląstelės buvo transfekuotos hsa-miR-4535 imitacija (10 nM) arba imituojančia NC (10 nM) 1 val., o po to kartu apdorotos cistanche. (30 μM) 23 val. hsa-miR-4535 lygiai buvo aptikti naudojant qPCR, kad būtų užtikrinta sėkminga transfekcija. Smad4, COL1A1 ir COL3A1 baltymų lygis buvo analizuojamas Western blot metodu. GAPDH buvo naudojamas kaip pakrovimo kontrolė. Reikšmės rodomos kaip vidurkis ± SE. Rodomas rezultatų kiekybinis įvertinimas (n=3) *P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001, palyginti su neapdorotomis kontrolinėmis ląstelėmis; #P < 0,05, ##P < 0,01, ###P < 0,001, palyginti su H2O2 arba cistanche apdorotomis ląstelėmis.
8 paveikslas. Smad4 slopinimas siRNR arba hsa-miR-4535 imitacija pakeičia cistanche sukeltą kolageno sintezės padidėjimą odos fibroblastuose. (A–C) HS68 ląstelės buvo transfekuotos hsa-miR-4535 mimikos (10 nM) arba mimikos NC (10 nM) 1 valandą, po to apdorojamos cistanche (3). {{40}} μM) ir H2O2 (200 μM) 23 val. Hsa-miR-4535 (A) ir Smad4 (B) lygiai buvo aptikti naudojant qPCR, siekiant užtikrinti sėkmingą transfekciją. (D–E) HS68 ląstelės buvo transfekuotos siRNA Smad4 (2{50}} nM) arba siRNA NC (20 nM) 1 val., po to 23 valandas apdorojamos cistanche (30 μM) ir H2O2 (200 μM). Smad4 lygiai buvo aptikti naudojant qPCR, kad būtų užtikrinta sėkminga transfekcija (D). Smad4, COL1A1 ir COL3A1 baltymų lygis buvo analizuojamas Western blot metodu (C, E). GAPDH buvo naudojamas kaip pakrovimo kontrolė. Rodomos reikšmės yra vidurkiai ± SE. Rodomas rezultatų kiekybinis įvertinimas (n=3) *P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001, palyginti su neapdorotomis kontrolinėmis ląstelėmis; #P < 0,05, ##P < 0,01, palyginti su H2O2-apdorotomis ląstelėmis; $$P < 0,01, $$$P < 0,001, palyginti su H2O2 plius cistanche apdorotomis ląstelėmis
Be to, cistanche taikymas išgelbėjo TGF, p smad2/3 ir Smad4 baltymų ekspresiją UVB pažeistame odos audinyje (12C pav.). Mūsų išvados parodė, kad cistanche gali apsaugoti odą nuo UVB sukeltų pažeidimų, nes slopina hsa miR-4535 ir sustiprina Smad4 ekspresiją, kad suaktyvintų P-smad2/3 ir galiausiai paskatintų kolageno sintezę (13 pav.).
9 pav. cistanche sustiprina TGF/Smad kolageno sintezės kelią ir susilpnina odos senėjimą bei hsa-miR-4535 ekspresijos slopinimą UVB paveiktose HS68 ląstelėse. HS68 ląstelės buvo veikiamos UVB (40 mJ/cm2) ir 23 valandas apdorojamos cistanche (30 µM). (A) Su kolageno sinteze susijusių kelio komponentų (TGF, p-smad2/3, Smad4, COL1A1, COL3A1), su kolageno skaidymu susijusio baltymo (MMP{{20}}) baltymų ekspresija ir senėjimas. susiję žymenys (p16 ir p21) buvo aptikti Western blot metodu. GAPDH buvo naudojamas kaip pakrovimo kontrolė. (B ir C) hsa-miR-4535 ir Smad4 RNR ekspresija buvo aptikta qRT-PGR. Reikšmės rodomos kaip vidurkis ± SE. Rodomas rezultatų kiekybinis įvertinimas (n=3) *P < 0,05, **P < 0,01, palyginti su neapdorotomis kontrolinėmis ląstelėmis; #P < 0,05, ##P < 0,01, palyginti su UVB veikiamomis ląstelėmis.
Paprašyk daugiau:
El. paštas:wallence.suen@wecistanche.com whatsapp: plius 86 15292862950
