Greitas šešių efektyvių Cistanche Tubulosa komponentų nustatymas artimųjų infraraudonųjų spindulių spektroskopija vienu metu

Kontaktai: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 El. paštas:audrey.hu@wecistanche.com

Xinhong Wang, Xiaoguang Wang ir Yuhai Guo

Santrauka:

Norint kiekybiškai nustatyti kelis veiksmingus komponentus tam tikrame augale, paprastai reikia labai daug autentiškų natūralių produktų. Šiame tyrime pasiūlėme greitą ir neardomąjį metodą, skirtą vienu metu nustatyti echinakozidą, verbaskozidą, manitolį, sacharozę, gliukozę ir fruktozę.Cistanche tubulosaartimųjų infraraudonųjų spindulių spektroskopija (NIRS). Infraraudonųjų spindulių difuzinio atspindžio spektroskopija (DRS) ir didelio efektyvumo skysčių chromatografija (HPLC) buvo atlikta su 116 Cistanche tubulosa mėginių partijų. DRS duomenys buvo apdoroti naudojant standartinius normalios įvairovės (SNV) ir dauginamosios sklaidos korekcijos (MSC) metodus. Dalinė mažiausių kvadratų regresija (PLSR) buvo panaudota kuriant Cistanche tubulosa dominančių komponentų kalibravimo modelius. Tada visi modeliai buvo įvertinti apskaičiuojant vidutinę kvadratinę kalibravimo paklaidą (RMSEC), kalibravimo koreliacijos koeficientą (r). Nustatyta, kad visų šešių kalibravimo modelių r reikšmės yra didesnės nei 0,94, o tai rodo, kad kiekvienas modelis yra patikimas. Todėl šiame tyrime pateikti kiekybiniai NIR modeliai gali būti tinkami tiksliai įvertinti šešių vaistinių komponentų turinįCistanche tubulosa.

Raktiniai žodžiai: Cistanche tubulosa; didelio efektyvumo skysčių chromatografija; artimųjų infraraudonųjų spindulių spektroskopija; daliniai mažiausi kvadratai

Įvadas

Cistanche(Hoffmg. Et Link) – daugiametė fanerogaminė Orobanchaceae šeimos augalų gentis. Dauguma rūšių, priklausančių Cistanche genčiai, tūkstantmečius buvo naudojamos kaip vaistinis augalas Kinijoje; turėti aukščiausios kokybės toniko reputaciją; ir yra žinomi kaip „Dykumos ženšenis“ [1,2].Cistanche tubulosayra privalomas daugiamečio augalo Tamarix Chinensis šaknų parazitas. Jis buvo užfiksuotas Kinijos farmakopėjoje kaip autentiškas Cistanches Herba (kiniškas pavadinimas: Roucongrong) šaltinis iš 2005 m. leidimo [3]. Šiuolaikiniai Cistanche rūšių farmakologiniai tyrimai buvo pradėti devintajame dešimtmetyje [4]. Farmakologiniai tyrimai parodė, kad Cistanche augalų ekstraktai pasižymi plačiu veikimo spektru, pavyzdžiui, gydo inkstų trūkumą ir senatvinį vidurių užkietėjimą, gerina gebėjimą mokytis ir įsiminti, kovoja su Alzheimerio liga, stiprina imunitetą, stabdo senėjimą, mažina nuovargį ir kt. [1,5–7]. Per pastaruosius tris dešimtmečius išsamūs ir sistemingi farmakologiniai tyrimai buvo derinami su fitocheminiais tyrimais, siekiant išsiaiškinti Cistanche augalų šaknų teigiamo poveikio materialinį pagrindą. Šios apklausos rodo, kad feniletanoidiniai glikozidai (PhG) buvo pagrindiniai veiksmingi Cistanche augalų komponentai, vaidinantys pagrindinį vaidmenį gydant inkstų trūkumą, impotenciją [8], stabdant senėjimą [9] ir gydant Alzheimerio ligą [10]. Kinijos farmakopėjoje buvo reikalaujama dviejų PhG (echinakozido ir verbaskozido) turinio. Tuo tarpu angliavandeniai, tokie kaip manitolis, sacharozė, gliukozė ir fruktozė Cistanche augaluose, atlieka vidurius laisvinančią funkciją, o Cistanche augalų angliavandenių grupės buvo naudojamos vidurių užkietėjimui gydyti [11].

Laukiniai ištekliaiCistanche tubulosadaugiausia paplitę Taklamakano dykumos apylinkėse pietiniame Sindziango autonominiame regione Kinijoje. Panašiai kaip ir daugelis kitų rūšių, naudojamų kaip tradiciniai kinų vaistai (TCM), C. tubulosa turi didelę ekonominę vertę ir beveik išnyko savo laukinėje buveinėje dėl per didelio surinkimo. C. tubulosa pradėta auginti 1990-aisiais Kinijoje, siekiant užtikrinti Cistanches Herba žaliavų tiekimą ir apsaugoti laukinius augalų išteklius. 2017 m. Sindziango Hotano prefektūroje yra beveik 13 tūkst. ha auginamų C. tubulosa [12,13]. Reikalinga sodinimo technologijų pažanga plečiant auginimą ir gerinant kokybęCistanche tubulosa.

Pagrindinis auginimo tikslasCistanche tubulosayra gaminti Cistanches Herba, kuriame gausu šių veiksmingų komponentų. Tačiau veiksmingų Cistanches Herba komponentų, tokių kaip PhG ir oligosacharidai, kiekį gamybos metu gali labai paveikti daugelis veiksnių [12,13]. Reikėtų ištirti C. tubulosa kokybės aptikimo realiuoju laiku sistemą. Todėl būtina sukurti didelio našumo metodą, kad būtų visiškai patenkintas reikalavimas išanalizuoti didelį mėginių skaičių per trumpą laiką. Tradiciškai tie pirminiai veiksmingi C. tubulosa komponentai, tokie kaip PhG ir angliavandeniai, buvo nustatyti naudojant aukštos kokybės skysčių chromatografiją (HPLC) [14,15]. Nors tai yra tiksli ir patikima, duomenų rinkimas ir apdorojimas užima daug laiko ir pastangų. Be to, daug laiko ir pastangų reikalauja ir mėginio paruošimas, kuris paprastai apima HPLC tyrimus susmulkinant, ekstrahuojant ir filtruojant. Todėl norint gauti gana didelį duomenų kiekį, reikalingas aiškus principas ir lengvai valdomas įrankis. Laimei, artimųjų infraraudonųjų spindulių spektroskopija (NIRS) buvo plačiai naudojama vertinant žemės ūkio produktus [16], maistą [17], medicininius mėginius [18] ir farmacijos produktus [19], nes ji yra greita ir neardoma. Todėl NIRS galėtų tiksliai atitikti efektyvių TCM matavimų reikalavimus, ir nenuostabu, kad NIRS buvo taikomas kokybiniam identifikavimui [20, 21] ir junginių [22] kiekybiniam įvertinimui TCM.

Šiame tyrime šešių veiksmingų komponentų, įskaitant echinakozidą, verbaskozidą, manitolį, sacharozę, gliukozę ir fruktozę, kiekis 116 C. tubulosa mėginių partijose, kurios buvo paimtos iš Hotano prefektūros Sindziange 2013–2015 m., pirmiausia buvo nustatytas HPLC. Vėliau šių šešių komponentų kalibravimo modeliai buvo sukurti dalinės mažiausių kvadratų regresijos (PLSR) metodu. Tada šie modeliai buvo patvirtinti naudojant koreliacijos koeficientą ir prognozavimo klaidas kalibravimo rinkiniuose. Rezultatai parodė, kad sukurtas metodas gali būti naudojamas kaip patikimas C. tubulosa kiekybinės analizės metodas.

Rezultatas

HPLC analizė

Echinakozido ir verbaskozido kiekis buvo nustatytas literatūroje tiksliai apibrėžtu HPLC-UV metodu [3,23], o keturi angliavandeniai (manitolis, sacharozė, gliukozė ir fruktozė) buvo nustatyti tiksliai apibrėžtu HPLC-ELSD metodu. literatūra [24], skirta visiems 116 pavyzdžių. Mėginių paruošimo ir nustatymo metodai aprašyti 3.1 ir 3.3 skyriuose. 1 paveiksle parodytos mišrių etalonų būdingos chromatogramos. Galima pastebėti, kad visi šeši veiksmingi komponentai buvo atskirti nuo pradinio lygio, todėl juos galima kiekybiškai įvertinti. HPLC metodas buvo patvirtintas prieš mėginio tyrimą. Pagrindiniai HPLC metodo rezultatai pateikti 1 lentelėje. Rezultatuose parodytas palankus tiesinis ryšys (r=0.9998) ir atgaivinimas (98,5 proc. ) echinakozido nustatymo metodu, toks pat rezultatas kaip ir visų penki komponentai. Todėl šešių veiksmingų komponentų turinį galima tiksliai nustatyti. Visi nustatyti turinio diapazonai yra apibendrinti 1 lentelėje.

NIRS analizė

2 paveiksle pavaizduoti C. tubulosa mėginių NIR spektrai (4000–10,000 cm-1 ). Reikšmingi absorbcijos smailės buvo nuo 4000 cm-1 iki 7500 cm-1 visuose mėginiuose, o švelnūs svyravimai buvo nuo 7500 cm-1 iki 10 000 cm-1. Pradinis NIR spektrų poslinkis įvyko, nes mėginį lengvai paveikė tokie veiksniai kaip dalelių dydis ir spalva (2A pav.). Matematinis išankstinis spektrų apdorojimas buvo naudojamas tam tikru mastu sumažinti nereikalingos informacijos įtaką. Matematinis išankstinis apdorojimas apėmė pirmąjį išvedimą (1-ą išvedimą), antrąjį išvedimą (2-ąjį išvedimą), standartinę normaliąją įvairovę (SNV) ir dauginamą sklaidos korekciją (MSC). 2B paveiksle parodytas 2-asis C. tubulosa NIR spektrų išvedimas ir akivaizdžiai pastebimi reikšmingi kitimai, atsiradę trijose srityse, 4000–4500 cm–1, 5000–5500 cm–1 ir 7000–7500 cm–1. .

Kiekybinio kalibravimo modelių sukūrimas

Dalinė mažiausių kvadratų regresija (PLSR) yra klasikinis modeliavimo metodas ir dėl aukštos rezultatų kokybės jis plačiai taikomas kiekybiniuose modeliuose. PLSR pranašumai apima geras prognozavimo galimybes ir santykinį paprastumą. PLSR taip pat buvo plačiai taikomas kuriant kiekybinius TCM kalibravimo modelius [25]. Remiantis iš anksto apdorotais NIR spektrais ir šešių veiksmingų C. tubulosa komponentų NIR kiekybinės analizės modelis buvo sukurtas naudojant PLSR metodą, kai tikrosios vertės yra HPLC analizės duomenys. 116 mėginių buvo atsitiktinai suskirstyti į kalibravimo ir patvirtinimo rinkinius santykiu 3:1. Tinkamiausios sąlygos kalibravimui parinktos pagal žemą RMSEC ir aukštą koreliacijos koeficientą.

Bangų juostos pasirinkimas kalibravimo modeliams

Tinkamos bangų juostos parinkimas buvo svarbus žingsnis kuriant kalibravimo modelius. Šiame tyrime buvo lyginami 4000–7500 cm-1 (rekomenduojama TQ analitiko programinės įrangos) ir 4000–10 000 cm-1 NIR intervalų spektrai. Pastebėta, kad šis diapazonas buvo netinkamas kalibruoti intervalu tarp 4000 cm-1 ir 7500 cm-1 iš 2 lentelės. Taigi dabartiniame tyrime šešių cheminių sudedamųjų dalių spektriniai intervalai buvo visi atrinkti iš intervalo nuo 4000 iki 10 000 cm-1, lyginant RMSEC ir koreliacijos koeficiento našumą.

Optimalaus kalibravimo modelių faktorių skaičiaus parinkimas

PLSR paaiškina maksimalų duomenų kintamumą sumažindamas spektro duomenų matmenį skaičiuojant veiksnius. „Nepakankamo aprūpinimo“ problema atsirado dėl nepakankamos informacijos, kuri atsirado dėl riboto skaičiaus veiksnių; tačiau pasirinkus veiksnius, didesnius už modelyje įvestas optimalias vertes, atsiras „perkrovimo“ problema. Arba „nepakankamas pritaikymas“ arba „per didelis pritaikymas“ sumažins nustatytų modelių nuspėjamąją galią [22]. 3 paveiksle parodytas ryšys tarp RMSECV ir faktorių visiems šešiems junginiams. Todėl pasirinkome tuos veiksnius, atitinkančius mažiausias RMSECV reikšmes. Optimalus kalibravimo modelių faktorių pasirinkimas pateiktas 3 lentelėje.

Spektrinio išankstinio apdorojimo pasirinkimas kalibravimo modeliams

Kitas svarbiausias kalibravimo modelių veiksnys yra išankstinis spektrinis apdorojimas, kuriuo siekiama sumažinti sklaidos ir bazinės linijos dreifo įtaką, padidinti signalo ir triukšmo santykį ir pašalinti netaisyklingus pokyčius. Įprastai radiacijos sklaidos įtakai pašalinti buvo naudojami multiplikacinės sklaidos korekcijos (MSC) ir standartinės normaliosios variacijos (SNV) metodai. Norint išspręsti bazinės linijos dreifo efektus, buvo lyginami 1-asis ir 2-asis darinių spektrai ir parinktas 2-asis darinys [26]. Norint pasiekti norimą efektą, prieš išvedimą išlyginome spektrus naudodami Savitzky-Golay (SG) filtro algoritmą, kad išvengtume triukšmo padidėjimo. 3 lentelėje pateikta informacija apie išankstinį spektrinį apdorojimą ir kalibravimo modelių rezultatus.

Sukurtų modelių įvertinimas

Geras NIRS kalibravimo modelis turi turėti mažas RMSEC ir RMSEP vertes, taip pat aukštą koreliacijos koeficientą (r) ir nedidelius skirtumus tarp RMSEC ir RMSEP [27–29]. Šešių pasirinktų junginių kalibravimo modeliai buvo sukurti pagal aukščiau paminėtas procedūras (3 lentelė). Echinakozido kalibravimo rinkinio RMSEC ir r vertės buvo atitinkamai 27,6 ir 0,9808. Kitų cheminių junginių modelių veikimo parametrai pateikti 3 lentelėje, iš kurios galime daryti išvadą, kad sukurti modeliai duoda patenkinamus prognozavimo rezultatus ir gali būti naudojami greitai kiekybinei C. tubulosa analizei. Šešių cheminių junginių sklaidos diagramos parodytos 4 paveiksle, kad kalibravimo modeliai būtų labiau aprašomi ir būtų stebimi vizualiai. Kaip parodyta 4 paveiksle, tarp nuspėjamųjų ir išmatuotų verčių buvo nedideli skirtumai, nes dauguma taškų buvo paskirstyti aplink regresinę kreivę su lygtimi kaip y=x. Todėl 4 paveiksle buvo pastebėti puikūs nuspėjamieji rezultatai.

Medžiagos ir metodai

Mėginio paruošimas

Šimtas šešiolika C. tubulosa mėginių buvo paimta iš Hotano prefektūros Sindziango autonominiame regione nuo 2013 iki 2015 m. Visi mėginiai buvo auginami, tačiau jie buvo paimti skirtingais augimo tarpsniais. Šviežias mėginių svoris svyravo nuo 20 g iki 1000 g. Po džiovinimo saulėje džiovinti mėginiai buvo susmulkinti ir persijoti per 60-tinklelio sietelį [3,23].

NIR spektroskopinių duomenų rinkimas

Mėginių NIR spektrai buvo renkami 8 cm{1}} intervalu per 4000–10 000 cm-1 spektro sritį, naudojant Antaris MXFT-NIR sistemą (Thermo Scientific, Madison, WI, JAV) su rankiniu optinio pluošto atspindžio adapteriu. Kiekvienas spektras buvo gautas vidutiniškai 64 skenavimus. Prieš NIR spektrų nuskaitymą visiems mėginiams buvo leista susibalansuoti iki kambario temperatūros (25 °C), kad būtų užtikrinta, jog mėginiai buvo analizuojami toje pačioje temperatūroje. Drėgmė laboratorijoje buvo palaikoma aplinkos lygyje.

HPLC duomenų rinkimas

Ekstrahavimo paruošimas

Vienas gramas C. tubulosa miltelių buvo ekstrahuotas 50 ml 50 procentų metanolio kūginėje kolboje ultragarsu (500 W, 40 kHz) 30 min. Ekstraktas buvo laikomas 4 ◦C temperatūroje. Ekstrakto supernatantas buvo filtruojamas, kad būtų gautas mėginys HPLC analizei [3,23].

Echinakozido ir verbaskozido nustatymas vienu metu naudojant HPLC-UV

Skysčių chromatografinė analizė buvo atlikta naudojant Shimadzu UHPLC sistemą (Shimadzu, Kioto, Japonija), kurią sudaro du LC-20ADXR tirpiklio tiekimo įrenginiai, LC-20AD siurblys, SIL-20ACXRauto mėginių ėmiklis. , CTO-20kintamosios srovės kolonėlės krosnis, SPD-M20A DAD detektorius, DGU-20A3R degazatorius ir ICBM-20valdiklis.

Grace Prevail Carbohydrate ES kolonėlė (15{6}} × 2,1 mm, 2,7 mm), naudojama chromatografiniam atskyrimui, buvo palaikoma 35 ◦C temperatūroje. Mobilioji fazė susideda iš acetonitrilo (A) ir 0,1 procento vandeninės skruzdžių rūgšties (B) ir buvo pristatyta pagal gradiento programą taip: 0–7 min., tiesinis gradientas 10–20 procentas A; 7–15 min., 20 procentų A; ir 15–20 min., tiesinis gradientas 20–10 procentų A. Bendras judriosios fazės greitis buvo 0,4 ml/min. UV stebėjimas buvo atliktas esant 330 nm.

Vienu metu manitolio, sacharozės, gliukozės ir fruktozės nustatymas naudojant HPLC-ELSD

HPLC buvo atlikta naudojant Agilent 1100 serijos LC sistemą (Palo Alto, CA, JAV), kurią sudaro aG1322A degazatorius, G1311A ketvirtinis siurblys, G1311A automatinis mėginių ėmiklis, G1316A kolonėlės temperatūros reguliatorius ir G1315B DAD detektorius.

Chromatografiniam atskyrimui buvo naudojama Sigma Prevail Carbohydrate ES kolonėlė (4,6 × 25{7}} mm, 5 µm) ir palaikoma 25 ◦C kolonėlės temperatūroje. Mobilioji fazė buvo sudaryta iš acetonitrilo ir vandens (77:23, v/v) ir izokratinio sąjungininko, tiekiamo 0,7 ml/min greičiu. Nuotekos buvo stebimos naudojant garavimo šviesos sklaidos detektorių (ELSD) su numatytaisiais parametrais [23, 24].

Duomenų apdorojimas

TQ Analyst (8 versija.0, Thermo Scientific, Madison, WI, JAV) buvo naudojamas kalibravimo ir patvirtinimo rinkiniams dalyti, matematiniam išankstiniam spektrų apdorojimui, kalibravimo modelių nustatymui ir kitiems skaičiavimams atlikti. Figūroms gaminti buvo naudojama kilmė (9.1 versija).

Išvados

Padėka: šį darbą rėmė Kinijos nacionalinis mokslo ir technologijų planavimo projektas (2015BAD29B00-04).

Autoriaus indėlis: Xinhong Wang sumanė ir sukūrė eksperimentus. Xinhong Wang ir Xiaoguang Wang atliko eksperimentus. Xinhong Wang ir Yuhai Guo parašė darbą.

Interesų konfliktai: autoriai pareiškia, kad interesų konfliktų nėra.

Nuorodos

1. Jiang, Y.; Tu, PF Cistanche rūšių cheminių sudedamųjų dalių analizė. J. Chromatogr. 2009, 1216, 1970–1979. [CrossRef] [PubMed]

2. Xu, R.; Chen, J.; Chen, S.-L.; Liu, T.-N.; Zhu, W.-C.; Xu, J. Cistanche deserticola Ma auginama kaip nauja kultūra Kinijoje. Genet. Išteklius. Crop Evol. 2008, 56, 137–142. [CrossRef]

3. Kinijos farmakopėjos komiteto redagavimas. Kinijos farmakopėja, 2005 m. leidimas; Chemijos pramonės spauda: Pekinas, Kinija, 2005 m.; 1 tomas, p. 90.

4. Kobayashi, H.; Komatsu, J. CistanchE herba sudedamosios dalys (1). Yakugaku Zasshi 1983, 103, 508–511. [CrossRef] [PubMed]

5. Daina, ZH; Lei, L.; Tu, PF Pažanga tiriant farmakologinio aktyvumo augalus cistanche. Et link. Smakras. Tradit. Žolė. Narkotikai 2003, 34, 473–476.

6. Xiong, Q.; Kadota, S.; Tani, T.; Namba, T. Cistanche deserticola feniletanoidų antioksidacinis poveikis. Biol. Pharm. Bull. 1996, 19, 1580–1585. [CrossRef] [PubMed]

7. Xuan, GD; Liu, CQ Tyrimas apie Cistanche deserticola feniletanoidinių glikozidų (PEG) poveikį senų pelių senėjimui, kurį sukelia D-galaktozė. J. Chinas. Med. Mater. 2008, 31, 1385–1388.

8. Sato, T.; Kozima, S.; Kobayashi, K.; Kobayashi, H. Cistanchis Herba farmakologiniai tyrimai. I. Cistanchis Herba sudedamųjų dalių poveikis chronišką stresą patiriančių pelių seksui ir mokymosi elgesiui. Yakugaku Zasshi 1986, 105, 1131–1144. [CrossRef]

9. Shen, CY; Jiang, JG; Yang, L.; Wang, DW; Zhu, W. Senėjimą stabdančios veikliosios medžiagos iš žolelių ir maistinių medžiagų, naudojamų tradicinėje kinų medicinoje: farmakologiniai mechanizmai ir reikšmė vaistų atradimui. Br. J. Pharmacol. 2016, 11, 1395–1425. [CrossRef] [PubMed]

10. Li, N.; Wang, J.; Ma, J.; Gu, Z.; Jiang, C.; Yu, L.; Fu, X. Cistanches herba terapijos neuroprotekcinis poveikis pacientams, sergantiems vidutinio sunkumo Alzheimerio liga. Evid. Remiantis papildymu. Altern. Med. 2015, 2015. [CrossRef] [PubMed]

11. Gao, JY; Jiang, Y.; Dai, F.; Han, ZL; Liu, HY; Bao, Z.; Zhang, TM; Tu, PF Cistanche deserticola YC Ma vidurius laisvinančių sudedamųjų dalių tyrimas. Mod. Smakras. Med. 2015, 17, 307–310.

12. Tu, PF; Chen, QL; Jiang, Y.; Guo, YH; Yang, Teksasas; Wang, XY; Aierkanas, M.; Li, XB; Du, Y.; Nan, ZD; ir kt. Cistanche tubulosa ir jo šeimininko Tamarix spp. Mod. Smakras. Med. 2015, 17, 349–358.

13. Tu, PF; Jiang, Y.; Guo, YH; Tianas, YZ; Li, XB; Wang, XY; Wei, J.; Chen, QL; Aierkan, M. Ekologinės cistanchų herba pramonės plėtra, skirta Vakarų dykumų regiono ekologinei civilizacijai skatinti. Mod. Smakras. Med. 2015, 17, 297–301.

14. Lu, DY; Zhang, JY; Yang, ZY; Liu, HM; Li, S.; Wu, BJ; Ma, ZG Kiekybinė cistanches herba analizė naudojant aukštos kokybės skysčių chromatografiją kartu su diodų matricos aptikimu ir didelės skiriamosios gebos masės spektrometrija kartu su chemometriniais metodais. J. Sep. Sci. 2013, 36, 1945–1952. [CrossRef] [PubMed]Molecules 2017, 22, 843 9 iš 9

15. Jiang, Y.; Li, SP; Wang, YT; Chen, XJ; Tu, PF Žolinių cistankų diferencijavimas pagal pirštų atspaudus naudojant aukštos kokybės skysčių chromatografijos-diodų matricos aptikimo-masių spektrometriją. J. Chromatogr. 2009, 1216, 2156–2162. [CrossRef] [PubMed]

    ---