Susisiekite:jerry.he@wecistanche.com

Lin Bai|Gui‐ying Shi|Ya‐jun Yang|Wei Chen|Lian-feng Zhang|Chuan Qin

Cistanche turi senėjimą stabdantį poveikį

Abstraktus

Fonas: Su laiku susijęs regeneracinio pajėgumo ir organų homeostazės sumažėjimas yra pagrindinis bruožassenėjimo. Rehmannia glutinosa ir Astragalus membranaceus buvo naudojami kaip tradiciniai kinų žoliniai vaistai, skirti sustiprinti imunitetą ir pailginti gyvenimą. Tačiau mechanizmas, kuriuo šis augalinis vaistas lėtina senėjimą, nežinomas. Šiame tyrime mes ištyrėme vaistažolių mechanizmąanti-senėjimo efektas.

Metodai: Pelės buvo šeriamos ėdalu, papildytu R. glutinosa arba A. membranaceus 10 mėnesių; kontrolinė grupė buvo šeriama standartine dieta. Fenotipai buvo įvertinti naudojant balų sistemą ir išgyvenamumo analizę. Hematopoetinių kamieninių ląstelių (HSC) senėjimo fenotipų procentas buvo nustatytas atliekant fluorescencijos aktyvuotų ląstelių rūšiavimo analizę. HSC funkcija ir mechanizmas buvo analizuojami klonogeniniu tyrimu ir realaus laiko polimerazės grandinine reakcija.

Rezultatai: Theanti-senėjimo efektasR. glutinosa yra dėl sustiprintos HSC funkcijos. Pelėms, maitinančioms R. glutinosa, pasireiškė sulėtėjusios savybėssenėjimoprocesas, įskaitant sumažėjusį senėjimą ir padidėjusį išgyvenamumą. Srauto citometrijos analizė parodė sumažėjusį Lin-Sca1 ir c-kit- (LSK) ląstelių, ilgalaikių HSC (LT-HSC) ir trumpalaikių HSC (ST-HSC) skaičių R. glutinosa grupėje. In vitro klonogeniniai tyrimai parodė padidėjusį R. glutinosa grupės LT-HSC gebėjimą atsinaujinti, taip pat išlaikyti LSK ramybę dėl padidintos p18 ekspresijos. R. glutinosa grupė taip pat parodė sumažėjusį reaktyviųjų deguonies rūšių kiekį ir ‐gal plius ląstelių procentą, nes sumažėjo su ląstelių senėjimu susijusio baltymo p53 ir p16 reguliavimas.

Išvada: Rehmannia glutinosa veikiaanti-senėjimopoveikis išlaikant ramybę ir mažinant HSC senėjimą.

Raktažodžiai: anti-senėjimo, kraujodaros kamieninės ląstelės, ramybė, Rehmannia glutinosa

1|ĮVADAS

Senėjimas apibrėžiamas kaip nuo laiko priklausomas funkcinis nuosmukis, kuris paveikia daugumą gyvų organizmų.1 Organizmų ilgaamžiškumą daugiausia palaiko kamieninės ląstelės.2 Audiniams būdingos kamieninės ląstelės turi galimybę atsinaujinti ir diferencijuotis į įvairias efektorines ląsteles. 3 Tačiau senėjimo proceso metu šis savaiminio atsinaujinimo gebėjimas mažėja, o tai galiausiai lemia nepataisytų, pažeistų audinių susikaupimą pasenusiuose organizmuose.4 Prarandamas gebėjimas išlaikyti pusiausvyrą tarp ramybės ir diferenciacijos kamieninėje / pirmtakinėje ląstelėje. skyrius gali sukelti mirtį arba su amžiumi susijusias ligas.2 Be to, naujausi tyrimai rodo, kad kamieninių ląstelių atjauninimas gali pakeisti senėjimo fenotipą.5,6 Hematopoetinėje sistemoje kraujodaros kamieninės ląstelės (HSC) yra atsakingos už kraujo ląstelių gamybą. Senyvų pelių kraujodaros sistema rodo T ir B limfoidinių ląstelių pažeidimą ir padidėja mieloidinių ląstelių skaičius. Senyviems HSC pasireiškė sumažėjęs savęs atsinaujinimo aktyvumas ir sumažėjęs kraujodaros atkūrimo gebėjimas. Pažymėtina, kad su amžiumi susiję pokyčiai HSC skyriuje pasireiškia senėjančiam šeimininkui kaip anemija, padidėjęs polinkis į mieloproliferacinius navikus, susilpnėjusi imuninė funkcija ir padidėjęs sergamumas vėžiu.{11}} Tačiau HSC senėjimo mechanizmas ir augalinių vaistų poveikis HSC senėjimui nežinomas.10

Žmonėms nuo seniausių laikų rūpėjo senėjimo procesų atidėjimas ir išlikimas jaunaisanti-senėjimoyra dabartinis tyrimų objektas. Tradicinė kinų medicina sulaukia vis daugiau dėmesio įvairių su senėjimu susijusių ligų gydymui. Yra žinoma, kad daugelis tradicinėje kinų medicinoje naudojamų žolelių įvairiais mechanizmais turi teigiamą poveikį prieš senėjimą. Rehmannia glutinosa ir Astragalus membranaceus tokiu būdu buvo plačiai naudojami tūkstančius metų.

Rehmannia glutinosa vartojama įvairiems diabetiniams sutrikimams gydyti, kaulų metabolizmui gerinti sergant osteoporoze, kepenų uždegimui ir fibrozei slopinti. Be to, ši žolė turi kitokį poveikį, įskaitantnuo nuovargio, antidepresantų ir neuroprotekcinių savybių. Per pastaruosius kelerius metus R. glutinosa ir jos aktyvių komponentų farmakologiniai tyrimai daugiausia buvo skirti plačiam jo poveikiui kraujo, endokrininei, širdies ir kraujagyslių bei nervų sistemoms.{1}} Taigi buvo įrodyta, kad R. glutinosa turi stiprią imuninę sistemą. ‐ tobulinimo veikla, suteikusi teorinį pagrindą tolimesnėms studijoms.

Astragalus membranaceus turi tonizuojančių, hepatoprotekcinių, diuretikų ir atsikosėjimą skatinančių savybių15 ir buvo įrodyta, kad ji turi imunomoduliuojančių savybių16.priešuždegiminis,irantioksidantasMolekulinių mechanizmų, kuriais grindžiamas tradicinės kinų medicinos poveikis klinikinėje praktikoje, išaiškinimas yra pagrindinis žingsnis link jų pasaulinio pritaikymo, ir šiuo metu ši tema yra intensyvaus mokslinių tyrimų objektas.

Taigi šiame tyrime 10 mėnesių šėrėme peles racionu, papildytu R. glutinosa ir A. membranaceus, kad ištirtume mechanizmą, kuriuo grindžiamas R. glutinosa gebėjimas padidinti ilgaamžiškumą.

2|MEDŽIAGOS IR METODAI

2.1|Gyvūnų grupavimas ir gydymas

C57BL/6J pelių patelės buvo laikomos aplinkoje, kurioje nėra patogenų, ir šeriamos standartine dieta. Gyvūnų naudojimą šiame tyrime patvirtino Pekino sąjungos medicinos koledžo laboratorinių gyvūnų mokslo instituto gyvūnų priežiūros ir naudojimo komitetai. Pelės (10 mėnesių amžiaus) buvo atsitiktinai suskirstytos į tris grupes (n=20/grupė). Kontrolinė grupė buvo šeriama standartine dieta (Pekino HFK Biosicence, Pekinas, Kinija). Kitų dviejų grupių racionai buvo papildyti maltais R. glutinosa ir A. membranaceus (Beijing Tong Ren Tang Chinese Medicine, Pekinas, Kinija), atitinkamai, po 200 mg/d 10 mėnesių. Ši dozė buvo parinkta naudojant kūno paviršiaus normalizavimo metodą, siekiant patvirtinti vaistų dozes nuo tyrimų su žmonėmis iki tyrimų su pelėmis. Kūno svoris buvo nustatomas kas 2 mėnesius, o išgyvenamumas registruojamas kasdien.

2.2|Senėjimo laipsnio įvertinimas

Senėjimo laipsniui įvertinti pagal Takeda ir kt.18 apibrėžtus kriterijus buvo pritaikyta balų sistema. Kiekviena protokole nurodyta kategorija buvo atrinkta iš klinikinių požymių, susijusių su senėjimo procesu. Kiekviena pelė buvo įvertinta 18 mėnesių amžiaus, o kiekvienos kategorijos balai buvo susumuoti, kad būtų nustatytas bendras įvertinimo balas.

2.3|Srauto citometrija

Ląstelės buvo paimtos iš užkrūčio liaukos, blužnies, periferinio kraujo (PB) ir kaulų čiulpų (BM). Blužnis ir užkrūčio liauka buvo nedelsiant iškirpti, nuplauti fiziologiniu tirpalu ir pasverti. Blužniai ir užkrūčio liaukos buvo švelniai homogenizuojami stikliniame homogenizatoriuje, o ląstelės buvo suspenduotos steriliame fosfatiniu buferiniu tirpalu (PBS). PB ląstelės buvo panaudotos raudonųjų kraujo kūnelių lizei (BD Biosciences, San Chosė, CA, JAV). Ląstelės iš BM buvo išskirtos plaunant tiek blauzdikaulius, tiek šlaunikaulius steriliu PBS. Visos ląstelės buvo išskirtos filtruojant per sterilų nailoninį tinklelį ir 30 minučių dažytos 4 laipsnių temperatūroje šiais su fluoroforu konjuguotais antikūnais: fikoeritrinu (PE) konjuguotu anti-CD3 (G4.18), alofikocianinu (APC) konjuguotu antikūnu. - CD4 (OX35) ir PE-Cy7 konjuguotas anti-CD8a (OX8). BM ląstelių linijos žymenys buvo nudažyti naudojant biotinu konjuguotą antipelės CD4 (RM4-5), CD5 (53-7.3) CD8a (53-6.7), CD11b (M1/70), B220 (RA3-6B2), TER119 (TER‐ 119) ir Gr1 (RB6‐8C5), po to dažymas antikūnu APC-eFluor 780- konjuguotu streptavidinu taip pat buvo gautas iš eBioscience (San Diegas, CA, JAV). Paviršiaus dažymui buvo naudojami šie antikūnai: APC imunoglobulinas (Ig)M (II/41), fluoresceino izotiocianatas (FITC) IgD (11‐26), PE‐Cy7 Sca‐1 (D7), PE Flt3 ( A2F10), FITC B220 (RA3‐6B2), FITC CD34 (RAM34), PerCP‐Cy5.5 CD127 (A7R34), PE CD16/CD32 (93) ir PerCP‐Cy5.5 CD3e (145‐2C11). Visi antikūnai buvo gauti iš eBiosciences (San Diegas, CA, JAV). Duomenys buvo surinkti FACS

Aria II (Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ, JAV) ir analizuojama naudojant FlowJo programinę įrangą (Three Star, Ashland, OR, JAV).

2.4|Ląstelių ciklo analizė

Ląstelių ciklo analizei visos BM ląstelės buvo nudažytos pagal kamieninių ląstelių paviršiaus žymenis (Lin–Sca‐1 ir c‐KitHigh; LSTK), tada fiksuotos ir permeabilizuotos (00‐5123‐43; Becton Dickinson). ) prieš dažymą FITC Ki‐

67 antikūnų ir 7-aminoaktinomicino D (7-AAD). Duomenų surinkimas atliktas naudojant FACS Aria II (Becton Dickinson). Duomenys buvo analizuojami naudojant FlowJo programinę įrangą.

2,5|Su senėjimu susijęs ‐gal dažymas

Su senėjimu susijęs (SA)-gal aktyvumas taip pat buvo ištirtas srauto citometrija, naudojant C12FDG, kaip aprašyta gamintojo (Molecular Probes, Eugene, OR, JAV). Trumpai tariant, kamieninės ląstelės pirmiausia buvo nudažytos ląstelių paviršiaus žymenims, o po to inkubuojamos su 100 nmol L-1 bafilomicinu A1 1 valandą 37 laipsnių temperatūroje, kad sukeltų lizosomų šarminimą. Po plovimo PBS, ląstelės buvo inkubuojamos su 2 mmol L-1 C12FDG 1-2 valandas 37 laipsnių temperatūroje ir analizuojamos naudojant FACS Aria I (Becton Dickinson).

2.6|Reaktyviųjų deguonies rūšių (ROS) gamybos nustatymas

Ląstelės buvo inkubuojamos su dichlor-dihidro-fluoresceino diacetatu (DCFH-DA; Beyotime, Šanchajus, Kinija) 37 laipsnių temperatūroje 20 minučių. DCFH-DA pasyviai difunduoja į ląsteles, kur yra deacetilinamas esterazėse, sudarydamas nefluorescencinį 2′,7′-dichlorfluoresceiną (DCFH). Išspinduliuotos fluorescencijos kiekis koreliuoja su ROS kiekiu ląstelėje. Duomenys buvo gauti naudojant FACS Aria I (Becton Dickinson) ir analizuojami naudojant FlowJo programinę įrangą.

2.7|Realaus laiko polimerazės grandininės reakcijos (PGR) analizė

Bendra RNR buvo išgauta iš ląstelių naudojant TRIzol reagentą (Invitrogen, San Diego, CA, JAV) pagal gamintojo instrukcijas. Dominantys genai buvo amplifikuoti iš DNaze I apdorotų bendrųjų RNR naudojant M-MLV atvirkštinę transkriptazę (Promega, Madison, WI, JAV)

ir poli-dT pradmenys. PGR buvo naudojami šie pradmenys: p21 (5′′-TCCAGACATTCAGAGCCACA-3′ ir 5′-CGAAGAGACAACGG-CACACT′3′, Tm=60 laipsnis, 30 ciklų), p5′-TCCAGACATTCAGAGCCACA′ 3′ ir 5′′-TCCCGGAACATCTCGAGGC′3′, Tm=62 laipsnis, 35 ciklai), p16 (5′′CGAACTCTTTCGGTCGTACCC‐3′ ir 5′‐ {m}, 5′‐ CGAATCTGCA2} ciklai), p57 (5′‐ AGGAGCAGGACGAGAATCAA′3′ ir 5′‐ TTCTCCTGCGCAGTTCTC TT‐3′, Tm=61 laipsnis , 30 ciklų), p19 (5′′GTCG′GTTCG′GTTG′TTGTTGTTG′GTTGTCGTCG ′, Tm=61 laipsnis, 35 ciklai), p18 (5′′-GGGACCTAGAGCACTTACT-3′ ir 5′′-TGACAGCAAAAC-CAGTTCCA‐3′, Tm=61 laipsnis, fafate-3-gliukoseraldo 30 ciklų). dehidrogenazė (5′′-GAGCGAGACCCCACTAACAT-3′ ir 5′′-TTCACACCCATCACAAACAT-3′, Tm=60 laipsnis, 25 ciklai). Realaus laiko (RT) PGR buvo atlikta naudojant SYBR Premix Ex Taq II (TaKaRa Shuzo, Kiotas, Japonija) ABI StepOne™ aptikimo sistemoje (Applied Biosystems, Foster City, CA, JAV).

2,8|Klonogeniniai tyrimai

Ilgalaikiai (LT)-HSC buvo rūšiuojami pagal fluorescencijos aktyvuotą ląstelių rūšiavimą (FACS), o po to kultivuojami 96 šulinėlių ląstelių plokštelėse, naudojant metilceliuliozės bazės terpę (HSC007; R&D Systems, Mineapolis, MN, JAV). . Kiekvienam mėginiui buvo paruošta dešimt kartotinių šulinių. Mes naudojome 96 šulinėlių ląstelių kultūros plokštelę, po tris ląsteles viename šulinyje. Praėjus dviem savaitėms po apsodinimo, kolonijų skaičius ir dydžiai buvo suskaičiuoti mikroskopu.

2,9|Statistinė analizė

Duomenys buvo analizuojami naudojant vienpusį ANOVA, naudojant Microsoft Excel (Microsoft, Redmond, WA, JAV) ir GraphPad Prism (GraphPad Software, La Jolla, CA, JAV) programinę įrangą. Duomenys pateikti kaip vidurkis ± SD. Manoma, kad P < 0,05="" rodo="" statistinį="">

3|REZULTATAI

3.1|R. glutinosa ir A. membranaceus veikė senėjimą stabdantį poveikį

Norėdami patvirtintianti-senėjimo poveikisR. glutinosa ir A. membranaceus, mes ištyrėme vartojimo kaip maisto papildo (200 mg/d.) poveikį. Vėliau užregistravome pelių kūno svorį, senėjimo laipsnį ir išgyvenamumą. Pelių, maitinančių R. glutinosa arba A. membranaceus, kūno svoris buvo normalus, palyginti su kontroline grupe, nors po 20 mėnesių R. glutinosa ir A. membranaceus grupių kūno svoris sumažėjo (1A pav.). Senėjimo laipsnio analizė atskleidė stabilų ir negrįžtamą vertinimo balo padidėjimą didėjant amžiui R. glutinosa ir A. membranaceus grupėse, palyginti su kontroline grupe, nors padidėjimas buvo ryškesnis A. membranaceus. grupė (1B pav.). Aukštą įvertinimo balą lėmė anksčiau prasidėjęs pasyvumo ir reaktyvumo praradimas, odos blizgesio praradimas ir padidėjęs šiurkštumas, plaukų slinkimas, perioftalminiai pažeidimai, padidėjusi stuburo lordokifozė ir ryškesnis jų sunkumo padidėjimas.18 Pelės A. membranaceus pelių grupė pasižymėjo ryškesnėmis senėjimo fenotipo savybėmis, įskaitant odos blizgesio praradimą ir plaukų slinkimą. Išgyvenamumo kreivės parodė, kad pelių gyvenimo trukmė R. glutinosa ir A. membranaceus grupėse buvo šiek tiek ilgesnė nei kontrolinės grupės (1C pav.). Šie duomenys patvirtinoanti-senėjimo poveikistiek R. glutinosa, tiek A. membranaceus, nors buvo nustatyta, kad R. glutinosa efektyviau lėtina senėjimo procesą.

1 PAVEIKSLAS turėjo Rehmannia glutinosa ir Astragalus membranaceusanti-senėjimo poveikis. Pelės buvo šeriamos ėdalu, papildytu maltais R. glutinosa arba A. membranaceus (200 mg/d); kontrolinė grupė buvo šeriama standartine dieta. A, pelių kūno svorio pokyčiai, matuojami kas 2 mėnesius. B, pelių senėjimo vertinimo balo pokyčiai su amžiumi. C, Išgyvenimo kreivės. Duomenys reiškia vidurkį ± SD; n=20 pelių / grupė. Duomenys reiškia vidurkį ± SD; n=5 pelių grupėje.*P < 0,05,="" ***p=""><>

3.2|R. glutinosa sumažino kraujodaros kamieninių ląstelių skaičių

Manoma, kad kamieninių ląstelių išsekimas yra daugelio rūšių su senėjimu susijusių pažeidimų integracinė pasekmė ir viena iš pagrindinių audinių ir organizmo senėjimo priežasčių.1 Naujausi tyrimai rodo, kad kamieninių ląstelių atjauninimas gali pakeisti senėjimo fenotipą organizmo lygmeniu. iškėlė hipotezę, kadanti-senėjimo poveikisR. glutinosa yra tarpininkauja stiprinant kamieninių ląstelių funkciją. Todėl atlikome tėkmės citometrinę kraujodaros kamieninių/progenitorinių ląstelių, išskirtų iš pelių (20 mėnesių), šertų ėdalu, papildytu R. glutinosa arba A. membranaceus (200 mg/d) 10 mėnesių, skaičiaus (2A pav.) . LSK procentas sumažėjo R. glutinosa ir A. membranaceus grupėse (2B pav.). LT‐ ir trumpalaikių (ST)‐ HSC skaičius R. glutinosa grupėje sumažėjo maždaug du kartus, palyginti su skaičiumi kontrolinėje grupėje (2C‐D pav.). R. glutinosa grupėje buvo aptiktas didesnis bendrųjų limfoidinių pirmtakų (CLP) skaičius, palyginti su skaičiumi kontrolinėje grupėje (2I pav.). Daugiapotencinių pirmtakų (MPP), bendrųjų mieloidinių pirmtakų (CMP), granulocitų-makrofagų pirmtakų (GMP) ir megakariocitų-eritroidinių pirmtakų (MEP) skaičius R. glutinosa grupėje nesiskyrė, palyginti su skaičiumi kontrolinė grupė. A. membranaceus grupėje LT‐ ir ST‐ HSC skaičius reikšmingai nesiskyrė lyginant su skaičiais kontrolinėje grupėje (2C‐ D pav.). Be to, MPP, CMP, MEP ir CLP ląstelių skaičius nesiskyrė lyginant su skaičiumi kontrolinėje grupėje (2E, 2F, 2H ir 2I pav.); tačiau A. membranaceus grupėje GMP sumažėjo. Taigi pelėms, maitinamoms dieta, papildyta R. glutinosa, sumažėjo hematopoetinių kamieninių ir progenitorinių ląstelių skaičius.

3.3|R. glutinosa sustiprino HSC funkciją ir išlaikė ramybę

Norint įvertinti HSC funkciją, buvo tiriamas LT‐ HSC klonogeninis potencialas in vitro. Mes surūšiavome LT-HSC ląsteles į metilceliuliozės bazės terpę naudodami FACS ir suskaičiavome kolonijų skaičių ir dydį po 14 dienų. Palyginti su kontrolinės grupės pelių ląstelių sukurtų kolonijų skaičiumi ir dydžiu, R. glutinosa grupės pelių ląstelėse padidėjo kolonijų skaičius, ypač mažo dydžio (P=0.0241). ) ir didelio dydžio klonas (P=0.0418), o A. membranaceus grupės pelių skaičius nesiskyrė (3 pav.). Padidėjęs kolonijų dydis ir skaičius R. glutinosa grupėje rodo, kad ši žolė sustiprina LT‐HSC savaiminio atsinaujinimo potencialą.

Dauguma suaugusių pelių HSC lieka ramybės būsenoje;19 todėl ląstelių ramybės palaikymas yra esminis kamieninių ląstelių savaiminio atsinaujinimo mechanizmas.20,21 Stebėtas HSC sumažėjimas rodo sumažėjusį R. glutinosa ląstelių proliferaciją ir A. membranaceus grupės; todėl mes ištyrėme HSC ląstelių ciklo būseną, analizuodami proliferacinį ląstelių žymeklį Ki-67 kartu su DNR kiekio 7-AAD nustatymu LSK populiacijoje. Mes pastebėjome padidėjusį LSK ląstelių skaičių G0 fazėje R. glutinosa ir A. membranaceus grupėse, palyginti su kontroline grupe (4A pav.). Šie rezultatai parodė, kad R. glutinosa ir A. membranaceus išlaikė HSC ramybę.

LSK ląstelių ląstelių ciklo reguliatorių realiojo laiko PGR analizė atskleidė, kad p18, p19 ir p57 vaidino svarbų vaidmenį palaikant HSC ramybę.{4}} P57 ir p19 akivaizdžių pokyčių nepastebėta (4C pav.) D), o p18 buvo padidintas R. glutinosa grupėje, palyginti su kontroline grupe, ir šiek tiek padidintas A. membranaceus grupėje (4B pav.).

2 PAVEIKSLAS Rehmannia glutinosa ir Astragalus membranaceus paveikė hematopoetinių kamieninių / progenitorinių ląstelių skaičių. Pelės (senusios

20 mėn.) buvo šeriami maistu, papildytu R. glutinosa arba A. membranaceus (200 mg/d) 10 mėnesių (n=5/grupei); kontrolinė grupė buvo šeriama standartine dieta. Šviežiai išskirtos kaulų čiulpų (BM) ląstelės buvo nudažytos nurodytais antikūnais ir analizuojamos srauto citometrija. A, reprezentatyvūs BM hematopoetinių kamieninių ląstelių ir progenitorinių ląstelių populiacijų dažymo profiliai. B, Lin-Sca1 ir c-kit- ląstelių (LSK) procentinė dalis BM ląstelėse. C‐ I, (C) ilgalaikių ląstelių numeriai (LT; Lin–, Sca‐ 1 plus , c‐ Kit , CD34 plus – , Flt3–); D, trumpalaikis (ST; Lin–, Sca‐ 1 plus , c‐ Kit , CD34 plus plus , Flt3–); E, daugiapotentinis pirmtakas (MPP; Lin– ​​, Sca‐ 1 plus , c‐ Kit plus , Flt3 plus ); F, bendras mieloidinis pirmtakas (CMP; Lin– ​​, Sca‐ 1– , c‐ Kit–, CD34 plus , CD16/ CD32–); G, granulocitų-makrofagų pirmtakas (GMP; Lin– ​​, Sca‐ 1– , c‐ Kit–, CD34 plus , CD16/CD32 plus ); H, megakariocitų-eritroidų pirmtakas (MEP; Lin–, Sca‐ 1–, c‐ Kit–, CD34–, CD16/CD32–); ir I, bendras limfoidinis pirmtakas (CLP; Lin– ​​, Sca‐ 1low, c‐ Kitlow, CD127 plus ). Duomenys reiškia vidurkį ± SD; n=5 pelių / grupė. *P < 0,05,="" **p=""><>

3.4|R. glutinosa atitolino HSC senėjimą

Ilgalaikis maisto papildymas R. glutinosa gali pailginti pelių gyvenimo trukmę. Ląstelių senėjimas didėja su amžiumi; todėl ištyrėme HSC senėjimą senstančiose pelėse, taikydami SA‐gal nudažytų HSC srauto citometrinę analizę, naudojant fluorescencinį galinį substratą (C12FDG).25 SA‐gal teigiamų ląstelių procentas sumažėjo R. glutinosa grupė, o tai rodo, kad R. glutinosa atitolina LSK ląstelių senėjimą (5A pav.).

Reaktyviosios deguonies rūšys vaidina svarbų vaidmenį HSC senėjimui, o HSC ramybės praradimas dažnai koreliuoja su padidėjusiu ląstelių ROS.26 LSK tarpląstelinio ROS analizė parodė, kad lygis R. glutinosa grupėje sumažėjo, palyginti su kontrolinėje grupėje. grupė (5B pav.). Šie duomenys parodė, kad R. glutinosa gali palaikyti HSC ramybę ir sustiprinti HSC funkciją mažindama ROS lygį.

Tada ištyrėme kelių genų, dalyvaujančių ląstelių senėjime, ekspresiją, atlikdami LSK ląstelių RT-PCR analizę. Palyginti

3 PAVEIKSLAS Hematopoetinių kamieninių ląstelių funkcija, sustiprinta dietiniu Rehmannia glutinosa papildymu. Ilgalaikių pelių kepenų žvaigždžių ląstelių klonogeninis potencialas in vitro (n=3)

su kontroline grupe su ląstelių senėjimu susijusių baltymų p53 ir p16 ekspresija buvo sumažinta R. glutinosa grupėje (5D-E pav.). Tačiau p53 ir p16 ekspresija nebuvo reikšmingai sumažinta tarp A. membranaceus grupės ir kontrolinės grupės (5D-E pav.). Apibendrinant, šie duomenys rodo, kad keli pagrindiniai su ląstelių ciklu ir ląstelių senėjimu susiję genai reguliuoja HSC funkciją pelėms, maitinamoms dieta, papildyta R. glutinosa.

3,5|R. glutinosa sustiprino B ląstelių imunitetą

B ir T limfocitai yra svarbūs imunologiniam atsakui. T limfocitai atlieka svarbų vaidmenį ląsteliniame imunitete ir jo reguliavime, o B limfocitai daugiausia dalyvauja humoraliniame imunitete. Limfocitų proliferacija yra artimiausias rodiklis, atspindintis organinį imunitetą. Siekiant ištirti imunologinio stiprinimo vaidmenį, buvo tiriamas R. glutinosa ir A. membranaceus poveikis limfocitų proliferacijai.

R. glutinosa grupės pelėms sumažėjo HSC ir padidėjo CLP skaičius. Srauto citometrinė analizė parodė padidėjusį subrendusių B ląstelių (B220 plius ) skaičių R. glutinosa grupės pelių PB, BM ir blužnyje, palyginti su skaičiais, nustatytais kontrolinėje grupėje (6A pav.); tačiau reikšmingų skirtumų tarp T ląstelių (CD4 plius ir CD8 plus), monocitų ir granulocitų (CD11b plius ) tarp dviejų grupių nebuvo (6B-D pav.). Taigi šie rezultatai rodo, kad su maistu gaunamas R. glutinosa stiprina B ląstelių imunitetą.

4 PAVEIKSLAS Rehmannia glutinosa ir Astragalus membranaceus maisto papildai palaikė kraujodaros kamieninių ląstelių ramybę. A, ląstelių procentas kiekvienoje ląstelių ciklo fazėje. 7-aminoaktinomicino D (7-AAD) srauto citometrinė analizė ir Lin-Sca1 ir c-kit- ląstelių (LSK) dažymas Ki-67. B, surūšiuotų LSK ląstelių genų ekspresijos realiojo laiko polimerazės grandininės reakcijos analizė; GAPDH buvo naudojamas normalizavimui. Duomenys rodo trijų eksperimentų vidurkį ± SD. *P < 0.05,="" **p="">< 0,01,="" ***p=""><>

5 PAVEIKSLAS Dietinis Rehmannia glutinosa papildas sumažino kepenų žvaigždžių ląstelių (HSC) senėjimą. Pelės (20 mėnesių amžiaus) buvo šeriamos dieta, papildyta Rehmannia glutinosa arba Astragalus membranaceus (200 mg/d) 10 mėnesius (n {{4). }}/grupė); kontrolinė grupė buvo šeriama standartine dieta. A, SA-gal-teigiamų ląstelių Lin-Sca1 ir c-kit- (LSK) srauto citometrinė analizė naudojant fluorescencinį-galaktozidazės substratą (C12FDG). B, reaktyviųjų deguonies rūšių (ROS) teigiamų ląstelių procentas LSK. ROS teigiamų LSK srauto citometrinė analizė. Duomenys rodo vidurkį ± standartinis nuokrypis (SD). *P < 0,05,="" ***p="">< 0,001.="" c,="" su="" ląstelių="" senėjimu="" susijusių="" genų="" ekspresijos="" modelis="" lsk;="" gapdh="" buvo="" naudojamas="" normalizavimui.="" duomenys="" rodo="" trijų="" eksperimentų="" vidurkį="" ±="" sd.="" *p="">< 0,05,="" **p="">< 0,01,="" ***p=""><>

4|DISKUSIJA

Šiame tyrime mes ištyrėme mechanizmąanti-senėjimo poveikisR. glutinosa arba A. membranaceus, papildant pelių racioną žolelėmis po 200 mg/d 10 mėnesių. Nustatyta, kad R. glutinosa turi senėjimą stabdantį poveikį, įskaitant sumažėjusį senėjimą ir padidėjusį HSC išgyvenamumą, taip pat

sustiprintas B ląstelių imunitetas. Kalbant apie mechanizmąanti-senėjimo poveikis, mes nustatėme, kad R. glutinosa sumažino HSC skaičių, o proliferacijos pajėgumas padidėjo. Be to, R. glutinosa palaikė HSC ramybę ir sumažino SA‐gal‐teigiamų ląstelių skaičių bei ROS lygį, reguliuodamas p18, p53 ir p16. Kartu mūsų rezultatai patvirtino, kadanti-senėjimo poveikisR. glutinosa pelių yra gydomi išlaikant ramybę ir sustiprinant HSC funkciją.

Rehmannia glutinosa, kuri tūkstančius metų buvo naudojama kaip tradicinis kinų žolinis vaistas, gali būti naudojama hipoglikemijai gydyti esant įvairiems diabeto sutrikimams.27,28 Taip pat buvo pranešta, kad R. glutinosa ekstraktas pagerina kaulų metabolizmą.29 Be to, R. glutinosa slopina uždegiminius atsakus ir sindromus30, 31 ir apsaugo nuo ląstelių pažeidimo, pašalindama laisvuosius radikalus.14,32 Šiame tyrime mes nustatėme, kad pelėms R. glutinosa buvo papildytas maistas.anti-senėjimo poveikisir sustiprintas B-ląstelių imunitetas, didinant LT-HSC proliferacinį pajėgumą ir mažinant SA-gal-teigiamų ląstelių skaičių bei ROS lygį.

Nustatyta, kad su amžiumi įvairių ląstelių ir audinių oksidacinio pažeidimo laipsnis didėja. Oksidacinis stresas yra esminis HSC atsinaujinimo veiksnys. LT‐ HSC ramybės praradimas dažnai koreliuoja su padidėjusiu ląsteliniu ROS kiekiu, kuris neigiamai susijęs su HSC savaiminiu atsinaujinimu.26 Catalpol yra iridoidinis gliukozidas, rastas R. glutinosa šaknyje. Ankstesniame tyrime Catalpol slopina oksidacinį stresą, DNR pažeidimus ir telomerų trumpėjimą per PGC‐1/TERT kelią.33 Mūsų tyrime ROS lygis buvo sumažėjęs R. glutinosa grupės LSK ląstelėse, palyginti su kontroline grupe. Taigi R. glutinosa pailgina pelių išgyvenimą, slopindama oksidacinį stresą HSC.

6 pav. Srauto citometrinė brandžių imuninių ląstelių procentinė dalis periferiniame kraujyje (PB), kaulų čiulpuose (BM), blužnyje ir užkrūčio liaukoje. Pelės (20 mėn. amžiaus) buvo šeriamos ėdalu, papildytu Rehmannia glutinosa arba Astragalus membranaceus (200 mg/d) 10 mėnesių (n=5/grupė); kontrolinė grupė buvo šeriama standartine dieta. A, B ląstelių procento (B220 plius) srauto citometrinė analizė PB, BM ir blužnyje. B, srauto citometrinė monocitų ir granulocitų ląstelių (CD11b plius) procentinė analizė PB ir BM. C ir D, srauto citometrinė CD4 plius ir CD8 plius ląstelių procentinė analizė PB, blužnyje ir užkrūčio liaukoje. Duomenys rodo vidurkį ± SD. *P <>

Astragalus membranaceus taip pat naudojamas tradicinėje kinų medicinoje, siekiant skatinti imunitetą, sumažinti cukraus kiekį kraujyje ir skatinti naviko ląstelių apoptozę, taip pat turiantioksidacijairanti-senėjimosavybių. Šiame tyrime mes nustatėme, kad maisto papildymas A. memranaceus 10 mėnesių neturėjo akivaizdaus poveikio, palyginti su tuo, kuris buvo stebimas kontrolinėse pelėse, o pelių svoris sumažėjo po 20 mėnesių. Todėl A. membranaceus gali būti netinkamas gydyti LT šeriamų pelių.

Apibendrinant, mūsų rezultatai rodo, kad R. glutinosa gali pailginti pelių gyvenimo trukmę, palaikydama ramybę ir sustiprindama HSC funkciją. Be to, R. glutinosa gali sumažinti tarpląstelinį ROS lygį ir SA‐gal‐teigiamų ląstelių skaičių bei sustiprinti B ląstelių imunitetą.

PADĖKA

Šį tyrimą iš dalies parėmė Nacionalinis Kinijos mokslo fondas (31672374), CAMS medicinos mokslų inovacijų fondas (CIFMS) (2016-12M-1-012) ir PUMC jaunimo fondas (2017310018).

INTERESŲ KONFLIKTAI

Nė vienas.

AUTORIŲ INSTRUKCIJA

Visi išvardyti autoriai atitinka autorystės reikalavimus. CQ ir LFZ sugalvojo ir sukūrė eksperimentus. LB atliko eksperimentus ir parašė pagrindinį rankraščio testą. GYS atliko ir išanalizavo FACS duomenis. YJY sukūrė eksperimentą apie tradicinę kinų mediciną. WC valdė peles. Visi autoriai perskaitė ir patvirtino rankraštį.