RNA-Seq pagrįstas de Novo transkripto surinkimas ir Cistanche Deserticola mėsingo kamieno genų atradimas-Ⅰ
Sep 03, 2024
Fonai
Cistanche deserticola yra visiškai nefotosintetinis parazitinis augalas, turintis didelę gydomąją vertę ir daugiausia paplitęs Šiaurės Vakarų Kinijos dykumoje. Jo džiovintas mėsingas stiebas yra labai svarbus tonikastradicinė kinų medicinasu vaidmenimis daugiausia gerinant vyrų lytinę funkciją ir stiprinant imunitetą, tačiau atlikta nedaug mechaninių tyrimų iš dalies dėl genominių ir transkriptominių išteklių trūkumo.
NATŪRALUS CISTANCHE TUBULOSA KINŲ TRADICINĖ MEDICINA PHGS75% ECH 30% ACT 12%
Rezultatai
Šiame tyrime atlikome gilų transkripto sekos nustatymą mėsingame C. deserticola stiebe ir apie 80 milijonus nuskaitymų buvo sugeneruota naudojant Illumina poros galo seką HiSeq2000 platformoje. Naudodami trejybės surinkėją, gavome 95 787 nuorašo sekas, kurių nuorašo ilgis svyruoja nuo 200 bp iki 15 698 bp, kurių vidutinis ilgis yra 950 bazių, o N50 ilgis - 1 519 bazių. 63 957 transkriptai buvo nustatyti kaip aktyviai išreikšti FPKM, didesniu nei 0,5 arba lygiu jam, iš kurių 30 098 nuorašai buvo anotuoti genų aprašymais arba genų ontologijos terminais, atlikus sekų panašumo analizę pagal kelias viešas duomenų bazes (Uniprot, NR ir Nt NCBI ir KEGG). . Be to, mes nustatėme pagrindinius fermentų genus, dalyvaujančius lignino ir feniletanoidinių glikozidų (PhG) biosintezėje, kurie, kaip žinoma, yra pagrindinės veikliosios medžiagos. Remiantis sekų palyginimu ir filogenetine analize, buvo nustatyti keturi fenilalanino amoniako-liazės (PAL) genai, pirmasis pagrindinis fermentas lignino ir PhG biosintezėje. Taip pat pirmą kartą buvo pasiūlyti du PhG biosintezės keliai.
Išvados
Iš viso užbaigėme pasaulinę C. deserticola mėsingo stiebo transkripto analizę, naudodami RNA-seq technologiją. Iš surinktų ir anotuotų transkriptų buvo nustatyta fermentų genų, susijusių su lignino ir feniletanoidų glikozidų biosinteze, kolekcija, taip pat buvo numatyta PAL genų šeima. Šio tyrimo sekos duomenys bus vertingas šaltinis atliekant būsimus feniletanoidų glikozidų biosintezės tyrimus ir funkcinius genominius tyrimus šiame svarbiame vaistiniame augale.
Įvadas
C. deserticola yra pasaulinė daugiamečių dykumų augalų gentis iš Orobanchaceae šeimos ir yra visiškai nefotosintetinė rūšis ir dažniausiai auga požeminis holoparazitinis augalas. Jis parazituoja ant psammofito Haloxylon ammodendron (Chenopodiaceae), kuris daugiausia gyvena dykumose ir pusiau dykumose dėl didelio atsparumo sausrai ir druskingumui, šaknų. C. deserticola pasižymi stipriu atsparumu atšiaurioms aplinkos sąlygoms ir daugiausia paplitusi šiaurės vakarų Kinijoje, ypač Vidinėje Mongolijoje, Gansu ir Sindziange. Pastaraisiais metais ji laikoma nykstančia laukine rūšimi dėl padidėjusio žmonių suvartojimo. C. deserticola, kuri dažnai vadinama dykumos ženšeniu, yra plačiai žinoma kaip dykumos šluota, o džiovintas mėsingas stiebas jau daugelį metų buvo plačiai naudojamas kaip tradiciškai svarbus tonikas Kinijoje ir Japonijoje. Iš pradžių jis buvo įrašytas Shen Nong Ben Cao Jing (Kinų kalbos žodynas, 1977 m.) maždaug prieš 1800 metų ir buvo laikomas vienu iš pagrindinių šaltinių.Kinijos vaistinė žolė Cistanche.
NATŪRALUS CISTANCHE TUBULOSA LYTINEI FUNKCIJAI GERINTI PHGS75% ECH 30% ACT 12%
C. deserticola ekstraktai turi platų gydomųjų funkcijų spektrą, ypač skirti gerinti lytinę funkciją, tonizuoti inkstus, apsaugoti kepenis, gerinti atmintį, gerinti imunomoduliacinį, antioksidacinį, priešuždegiminį, antivirusinį aktyvumą ir kt. pagrindiniai biologiškai aktyvūs C. deserticola komponentai yra feniletanoidiniai glikozidai (PheGs, PhGs). Iki šiol iš sultingo C.deserticola stiebo buvo išskirta daugiau nei 20 feniletanoidinių glikozidų. Tarp jų,akteozidas ir echinakozidasyra du pagrindiniai komponentai, pasižymintys reikšminga farmakologine veikla ir yra dokumentuoti kaip C. deserticola kokybės standartai Kinijos farmakopėjoje (2005 ir 2010 m. leidimai). Trys cheminiai PhG komponentai yra organinė rūgštis, sacharidas ir feniletanoidas, tačiau detalės, susijusios su feniletanoido biosintezės keliais, lieka menkai suprantamos C. deserticola.
Nepaisant komercinės ir medicininės C.deserticola svarbos, šios rūšies genominiai ir transkriptominiai duomenys yra labai riboti. NCBI duomenų bazėje nėra EST, o visa informacija apie šios rūšies genomą lieka neprieinama, išskyrus chloroplasto genomo seką. Riboti transkriptominiai duomenys trukdo tirti PhG biosintezės mechanizmus. RNA-seq technologija gali generuoti išreikštų tikslinio genomo dalių sekas ir identifikuoti genus [18], naudojant NGS technologijos platformas (pvz., Applied Biosystems SOLiD, Illumina HiSeq ir Roche 454). Jis tampa vis populiaresnis atliekant transkripto de novo surinkimą, nes tai ekonomiškas ir galingas metodas, pasižymintis didele skiriamąja geba ir plačiu dinaminiu diapazonu, ypač dėl to, kad jis turi pranašumą tiriant mažos gausos nuorašus. Dėl įvairių privalumų RNR-seq yra ypač patrauklus nemodiniams organizmams, turintiems ribotus genetinius išteklius. Tačiau nėra išsamių C. deserticola transkripto tyrimų pagal RNR-seq.
Šiame tyrime mes visame pasaulyje sekvenavome C. deserticola stiebo transkriptą naudodami Illumina Hiseq2000 platformą ir gavome 7,9 G neapdorotus duomenis. Surinkdami ir anotuodami, mes išgavome genus, dalyvaujančius PhG biosintezėje, ir genus, atsakingus už visą lignino biosintezę. Mūsų RNR-seq analizė sukūrė pirmąjį C. deserticola konsensuso transkriptą ir suteikė naujų įžvalgų apie visapusišką C. deserticola gydomosios vertės supratimą. Be to, čia aprašytas metodas gali būti plačiai taikomas profilio transkriptams, siekiant palengvinti genų, dalyvaujančių specifiniuose vaistinių komponentų biosintezės keliuose kitame vaistiniame augale, turinčiame labai ribotus genomo išteklius, atradimą.
Medžiagos ir metodai
Augalinės medžiagos rinkimas
Šviežias sultingas C. deserticola stiebas kasimo etape buvo paimtas iš augalų bazės BayanHot City of Alxa League Vidinėje Mongolijoje šiaurės vakarų Kinijoje. Leidimas surinkti gautas iš gamyklos bazės savininko (HongKui CongRong Group). Kupono pavyzdys buvo deponuotas Kinijos mokslų akademijos Pekino genomikos instituto pagrindiniame genominiame centre. Po valymo sultingi stiebo audiniai buvo supjaustyti mažais gabalėliais ir nedelsiant užšaldyti skystame azote, o po to laikomi -80 laipsnių temperatūroje iki tolesnio apdorojimo.
RNR ekstrahavimas, cDNR bibliotekos konstravimas ir Illumina sekos nustatymas
Visa RNR buvo išgauta iš sultingo stiebo naudojant TRIzol reagentą (Invitrogen Inc., Kalifornija, JAV) pagal gamintojo instrukcijas. Gauti mėginiai buvo apdoroti DNaze I, kad būtų pašalinta bet kokia genominė DNR. Išskirtos RNR buvo kiekybiškai įvertintos naudojant Agilent 2100 bioanalizatorių („Agilent Technologies“), o vientisumas patikrintas naudojant denatūruojančią agarozės gelio elektroforezę, dažant etidžio bromidu. Vėlesnėse analizėse buvo naudojami RNR mėginiai, kurių A260/A280 santykis buvo nuo 1,9 iki 2,1, RNR 28S:18S santykis didesnis nei 1,0, o RNR vientisumo skaičiai (RIN) -8.5.
RNA-seq bibliotekos buvo sukurtos naudojant Illumina Truseq RNA mėginių paruošimo rinkinius. Poli(A)+ RNR buvo išskirta iš visos RNR naudojant Dynal ligo(dT)25 granules pagal gamintojo instrukcijas. Po gryninimo buvo pridėtas fragmentacijos buferis, kad mRNR suskaidytų į trumpus fragmentus. Pirmosios krypties cDNR buvo susintetinta naudojant šiuos trumpus fragmentus kaip šablonus, kartu su SuperScript III atvirkštine transkriptaze ir N6 atsitiktiniu heksamero pradmeniu. Tada antrosios grandinės cDNR buvo susintetinta naudojant buferį, dNTP, RnazęH ir DNR polimerazę I. Gautos dvigrandės cDNR galas buvo taisomas naudojant T4 DNR polimerazę, DNR polimerazės I Klenow fragmentą ir T4 polinukleotido kinazę, ir surišta su adapteriai, naudojantys T4 DNR ligazę. Adapteriu sujungti fragmentai buvo išgryninti naudojant QiaQuick PCR ekstrahavimo rinkinį ir eliuuojami EB buferiu. Po analizės naudojant agarozės gelio elektroforezę, tinkami fragmentai buvo atrinkti kaip šablonai PGR amplifikacijai. Gautos cDNR bibliotekos seka buvo atlikta naudojant Illumina HiSeq 2000 sistemą.
Transkriptų de novo surinkimas ir genų ekspresijos kiekybinis įvertinimas
Neapdoroti skaitymai, sukurti iš sekos, buvo išvalyti pašalinus adapterio sekas (ATCTCGTATGCCGTC), naudojant vidinį metodą. Tada atlikome griežtą žemos kokybės filtravimo procesą. Pirma, bazės, kurių phred kokybės balas yra žemesnis nei 20, būtų apkarpytos nuo sekos 3' galo, kol pateks į vieną aukštesnės kokybės bazę (didesnė arba lygi 20). Jei skaitymo ilgis būtų trumpesnis nei 50 bp, jis būtų atmestas. Antra, skaitymai bus toliau filtruojami pagal kriterijų, kad 70 % bazių vieno skaitymo metu turi aukštos kokybės balus (didesnis arba lygus 20). Trečia, tolesniam surinkimui buvo naudojami tik suporuoti galiniai rodmenys. De novo nuorašo surinkimas buvo atliktas naudojant „Trinity“ leidimą{10}} [30], kurį sudarė trys vienas po kito einantys programinės įrangos moduliai: „Inchworm“, „Chrysalis“ ir „Butterfly“. Surinkimo parametrai buvo nustatyti taip:-seqType fq-JM 300G -min_contig_length 200-CPU 20-inchworm{20}}cpu {{21} }bflyCPU 20.
Norint kiekybiškai įvertinti nuorašo gausą, sekvenuoti porų galo skaitymai buvo iš naujo suderinti su surinktais nuorašais, naudojant scenarijų Trinity. Atvaizduoti rodmenys buvo naudojami kiekybiniam įvertinimui naudojant RSEM (RNA-Seq by Expectation Maximization) programinę įrangą. Genų arba izoformų gausa buvo pavaizduota pagal fragmentą, tenkantį nuorašo kilobazei vienam milijonui susietų fragmentų (FPKM), o tie transkriptai, kurių FPKM vertė yra lygi arba didesnė už 0.05, buvo apibrėžti kaip išreikšti.
Išreikštų nuorašų funkcinė anotacija
C. deserticola genų anotacijų rinkinių nėra, išskyrus chloroplasto genomą [1]. Išreikštus nuorašus anotavome lygindami juos su Genbank Nt, Genbank Nr ir TAIR10_ pep_20101214_atnaujintais duomenų rinkiniais atskirai naudodami BLAST programą (E< = 1e-20). Meanwhile, all expressed transcripts were translated into potential proteins according to ORF prediction by TransDecoder and predicated for the conserved domains based on the Pfam database.
Genų ontologijos ir KEGG kelio anotacija Pagal sekos panašumą su Uniprot duomenų baze (visų surinktų transkriptų genų ontologijos (GO) anotacija buvo gauta naudojant asociacijos failą, atsisiųstą iš (ftp://ftp.ebi.ac.uk/pub/). duomenų bazės/GO/goa/UNIPROT/gene{0}}asociacija goa_uniprot.gz). CC, BP ir MF kategorijos atskirai.
KEGG kelio informacija buvo priskirta visoms numatomoms baltymų sekoms naudojant internetinį įrankį KAAS (KEGG Automatic Annotation Server) [34]. Fasta formato sekos buvo pateiktos KAAS užklausai, o gautos informacijos apie kelią, susijusios su C. deserticola stiebo transkriptu, failai buvo atsisiųsti. 13 augalų organizmų genų duomenų rinkiniai KEGG buvo panaudoti anotacijai naudojant BBH (bi-directional best hit) metodą.
NATŪRALUS CISTANCHE TUBULOSA CISTANCHE EKSTRAKTAS PHGS75% ECH 30% ACT 12%
RT-qPCR analizė
Suskaidžius DNaze I, maždaug 5 ug visos RNR buvo paversta pirmosios krypties cDNR per atvirkštinės transkripcijos reakciją su oligo(dT)15 pradmenimis ir GoScript atvirkštinės transkripcijos sistema (Promega). Tada cDNR produktai buvo atskiesti 10- kartus dejonizuotu vandeniu be nukleazės, prieš naudojant kaip šabloną realaus laiko PGR. Specifinės cDNR buvo amplifikuotos GoTaq 2-Step RT-qPCR sistema (Promega) 20 ul tūriu. PGR amplifikacija buvo atlikta 60 laipsnių atkaitinimo temperatūroje naudojant 7500 realaus laiko PGR aptikimo sistemą (Applied Biosystems) pagal gamintojo instrukcijas. Santykinis nuorašų gausumas buvo apskaičiuotas taikant lyginamąjį ciklo slenksčio metodą, naudojant geną „comp10579_c0“ kaip vidinį standartą, naudojant „7500 Manager“ programinę įrangą.
RT-PGR pradmenų poros buvo sukurtos remiantis internetine programine įranga (http://primer3.ut.ee/) ir yra išvardytos S1 duomenų rinkinyje.
Rezultatai
C. deserticola mėsingo stiebo RNR sekos nustatymas ir de novo transkripto surinkimas
C. deserticola stiebas jau daugelį metų buvo plačiai naudojamas kaip tradiciškai svarbus tonikas Kinijoje ir Japonijoje. Norėdami gauti visuotinę genų ekspresijos C. deserticola mėsingame stiebe apžvalgą, atitinkamai 2013 ir 2014 m. surinkome tos pačios augalo bazės C. deserticola stiebo mėginius. Visos RNR buvo ekstrahuotos, o poliA + RNR buvo išgrynintos, kad būtų galima sukurti suporuotas RNR-seq bibliotekas. 79 433 734 ir 86 019 176 poros pabaigos rodmenys, atitinkantys beveik 8 milijardus ir 8,6 milijardo sekos bazių, buvo gauti naudojant Illumina HiSeq 2000 seką.
platforma 2013-metų ir 2014-metų pavyzdžiuose (1 lentelė). Pašalinus adapterių sekas ir išfiltravus žemos kokybės skaitymus (išsamiau žr. Metoduose), 64 831 040 aukštos kokybės porų pabaigos rodmenų 2013- metų pavyzdyje buvo panaudoti de novo transkripto surinkimui. Naudojant Trinity sekos surinkėją [30], buvo sugeneruoti 51 719 genų ir 95 787 transkripto sekos, kurių transkripto ilgis svyravo nuo 200 bp iki 15 698 bp. Vidutinis surinktų nuorašų ilgis yra 950 bazių, o N50 ilgis yra 1 519 bazių. Skirtingo ilgio nuorašų skaičius atskleidė, kad 57, 32% surinktų nuorašų buvo apie 500 bp ar ilgesni (1A pav.). Aukštos kokybės poros pabaigos skaitymai 2014-metų pavyzdyje buvo susieti su surinktu transkriptu. Be to, mes nustatėme, kad kiekvieno surinkto geno nuorašo skaičius skyrėsi ir 69% genų su viena išreikšta izoforma, o 31% genų išreiškė du ar daugiau transkriptų (1B pav.).
Surinktų nuorašų išraiškos kiekybinis įvertinimas ir funkcinė anotacija
Genų arba nuorašų gausa buvo kiekybiškai įvertinta naudojant RSEM paketą, kuriame sekvenuoti skaitymai buvo iš naujo suderinti su surinktais genais arba nuorašų sekomis naudojant Bowtie, o tie atvaizduoti skaitymai buvo naudojami kiekybiniam įvertinimui. Buvo apskaičiuota kiekvieno geno arba nuorašo FPKM vertė ir galiausiai nustatėme 63 957 ir 52 857 aktyviai išreikštus nuorašus (FPKM vertė Didesnė arba lygi 0.5) C. deserticola mėsinguose stiebo mėginiuose 2{{17} }13 ir atitinkamai 2014 m. 44 776 nuorašai (70,01 % 2013-metų imtyje, 84,71 % 2014-metų imtyje) paprastai buvo išreikšti dviejuose pakartojimuose, o jų išraiškos duomenų koreliacija (Pearson koreliacijos koeficientas: 0,91979) buvo parodyta S1 pav. Sekos neapdoroti duomenys buvo įkelti į NCBI SRA duomenų bazę (prieigos numeriai: SRX857402 ir SRX858938). Tolesnei analizei naudojome išreikštus genus, nustatytus 2013-metų mėginyje. Visų išreikštų nuorašų funkcinė anotacijų informacija buvo gauta naudojant du metodus. Pirma, visi išreikšti nuorašai buvo suderinti su žinomomis nukleotidų (GenBank nt) ir peptidų sekų duomenų bazėmis (GenBank nr ir Arabidopsis peptidas) atskirai pagal BLAST algoritmą. Iš 63 957 išreikštų nuorašų,
29 220 (45,7 %) buvo anotuoti ir parodė homologiją su sekomis bet kurioje iš trijų tiriamųjų duomenų bazių, kurių E vertės riba yra 1e-20. Tuo tarpu visų išreikštų nuorašo sekų kodavimo regionai buvo numatyti naudojant „TransDecoder“ programinę įrangą, o Pfam domeno paieškai buvo naudojami kiekvieno nuorašo ilgiausi ORF. Dėl to 21 358 (33,4 %) nuorašai buvo anotuoti remiantis Pfam duomenų baze. Iš viso 30 098 (47, 1%) nuorašai buvo reikšmingai suderinti su žinomais genais viešose duomenų bazėse, derinant du aukščiau nurodytus metodus. Visas išreikštų nuorašų sąrašas su funkcijų anotacija buvo parodytas papildomuose duomenyse (S2 duomenų rinkinys).
Mes ištyrėme 20 labiausiai išreikštų transkriptų (2 lentelė), atitinkančių 18, 99% visų sekos nuskaitymų, ir nustatėme, kad dauguma jų yra genai, reaguojantys į abiotinius.
streso stimulas. Dehidrinas (DHN), hidrofilinių ir termostabilių streso baltymų, turinčių daug įkrautų aminorūgščių, klasė, priklausanti II grupės vėlyvosios embriogenezės gausiai (LEA) šeimai, yra labiausiai išreikštas genas. Trys skirtingi Dehyrin transkriptai (komp28713_c0_seq1/2/4) buvo aptikti kaip labai išreikšti mėsinguose stiebuose, kurie gali būti susiję su ląstelių apsauga nuo žalos, kurią sukelia sausros stresas. Kiti su stresu susiję genai, tokie kaip šilumos šoko baltymas, su patogenais susijęs baltymas ir metalotioneinas, taip pat buvo labai išreikšti, o tai gali būti susiję su jo sunkia išgyvenimo aplinka. Be to, kai kurie konstituciniai genai, įskaitant 26S ribosomų RNR geną (komp22329_c2_seq1), su auksinu represuotą / su ramybės būseną susijusį baltymą (komp20999_c0_seq1), ADP-ribosilinimo faktorius (komp20499_ c0_seq1) taip pat buvo labai transkribuotas.
NATŪRALUS CISTANCHE TUBULOSA MUUNITETUI GERINTI PHGS75% ECH 30% ACT 12%
