Išskirtas su neutrofilų želatinaze susijęs lipokalinas rodo stipresnį gebėjimą slopinti ADPKD ląstelių cistų padidėjimą, palyginti su neišskiriama forma

Raktiniai žodžiai: ADPKD;su neutrofilų želatinaze susijęs lipokalinas; 3D kultūra

NAUJOS ŽOLĖLĖS

1. Įvadas

Inkstų policistinė liga (PKD), viena iš labiausiai paplitusių paveldimų ligų, pasižymi skysčių užpildytų cistų atsiradimu keliuose nefrono segmentuose [1]. ADPKD yra labiausiai paplitusi PKD forma, ty suaugusiųjų PKD, kurios simptomai daugumai pacientų nepasireiškia iki keturiasdešimties metų [2]. ADPKD yra mutacijų PKD1 (85 %) arba PKD2 (15 %) genuose, kurie koduoja atitinkamai policistiną-1 (PC1) ir policistiną-2 (PC2), [3, 4]. PC1 arba PC2 defektai yra susiję su nenormaliu inkstų epitelio ląstelių proliferacijos padidėjimu ir toliau sukelia cistų susidarymą [5–7]. Kai ADPKD progresuoja, cistos didėja ir sutrikdo normalią inkstų struktūrą, galiausiai sukelia inkstų nepakankamumą. Tačiau su ADPKD susijęs mechanizmas yra sudėtingas ir dar turi būti ištirtas. Funkcinis PC1 ir (arba) PC2 praradimas ADPKD sumažina kalcio koncentraciją ląstelėje, sumažina kalciui jautrią adenililciklazę (AC) ir dar labiau padidina intracelulinio ciklinio adenozino monofosfato (cAMP) kiekį [8, 9]. cAMP stimuliuoja epitelio ląstelių proliferaciją ir skysčių sekreciją, skatindamas cistų padidėjimą, aktyvuodamas proteinkinazę A (PKA) ir pasroviui esantį Ras/B-Raf/MEK/ERK kelią [10,11]. Buvo įrodyta, kad autofagijos disfunkcija pasireiškia ADPKD zebrafijoje ir pelėse in vitro [12] ir žiurkių in vivo modeliuose [13]. Autofagija yra esminis mechanizmas, palaikantis ląstelių ir organų homeostazę, skaidydamas ir perdirbdamas organelius, ilgai gyvenančius baltymus ir maistines medžiagas [14,15]. Kryžminis pokalbis vyksta tarp autofagijos mTOR kelio ir apoptozės kelių, kurie yra nereguliuojami sergant PKD [16]. Gydymas autofagijos aktyvatoriais, tokiais kaip rapamicinas ir karbamazepinas, gali žymiai susilpninti cistų susidarymą [12]. Anksčiau sukūrėme ADPKD pelės modelį, pavadintą Pkd1L3/L3 (C57BL/6 genetiniame fone) [17], įterpdami loxP vietą ir loxP šoninę mc1-neo kasetę į Pkd1 geno 30 ir 34 intronus. , atitinkamai (L3 reiškia tris loxP vietas alelyje), kad būtų sukurta sąlyginė geno mutacija. Pkd1L3/L3 pelėms buvo mažas PC1 kiekis (20 % kontrolinės grupės), o tai su amžiumi sukėlė agresyvų cistų augimą ir inkstų tūrio padidėjimą [17]. Be to, ADPKD ląstelių modelis (2L3 ląstelių linija) buvo sukurtas SV40 virusu transdukuojant pirmines inkstų epitelio ląsteles iš Pkd1L3/L3 pelių, siekiant sukelti nemirtingas ląstelių linijas [18].

Su neutrofilų želatinaze susijęs lipokalinas (NGAL), 22- kD išskiriamas baltymas, laikomas biologiniu žymens inkstų pažeidimams, įskaitant PKD suaugusiesiems [19] (bet ne vaikams [20]), lėtinei inkstų ligai [21]. ] ir ūminė inkstų išemija [22]. NGAL baltymo padidėjimo paciento šlapime mechanizmas nėra aiškus, buvo pasiūlyta, kad susikaupęs NGAL šlapime yra susijęs su inkstų epitelio ląstelių skilimu dėl traumos [23]. Kai kurie tyrimai parodė, kad NGAL atlieka apsauginį vaidmenį nuo inkstų pažeidimų, išemijos vietos [24] ir cistos progresavimo slopinimo [25], o kai kurie tyrimai rodo, kad NGAL gali būti susijęs su cistos progresavimu [26] ir naviko vystymusi [27]. ]. NGAL receptorius (NGAL-R, Slc22a17) ekspresuojamas daugelyje epitelio audinių, įskaitant inkstų nefronus [28]. NGAL ir NGAL-R jungtis gali išskirti tarpląstelinę geležį ir toliau sukelti apoptozę [29], kuri yra susijusi su įgimtos imuninės sistemos geležies išeikvojimo strategija nuo bakterinės infekcijos [30].

Įrodyta, kad eksogeninio NGAL vartojimas padidina Pkd1−/− ląstelių apoptozę ir dar labiau sumažina cistų augimą in vitro [25]. Ankstesniame darbe mes sukūrėme Pkd1L3 / L3 × NGAL−/− peles ir Pkd1L3 / L3 × NGALTg / Tg peles, sukryžmindami Pkd1L3 / L3 peles su NGAL išmuštomis ir transgeninėmis pelėmis, atitinkamai [31]. Mes nustatėme, kad per didelė NGAL ekspresija ADPKD pelės modelyje (Pkd1L3 / L3 × NGALTg / Tg pelės) sumažino cistos progresavimą ir pailgino Pkd1L3 / L3 pelių gyvenimo trukmę, kartu pasikeitusius molekulinius kelius, susijusius su proliferacija, apoptoze ir fibrozė [31]. Tačiau pagrindinis NGAL poveikio mechanizmas, palengvinantis ADPKD progresavimą, išlieka mįslingas.

Šiame tyrime buvo sukurta 3D ląstelių kultūros platforma, skirta ištirti Pkd1L3/L3 inkstų epitelio ląstelių (2L3 ląstelių) cistos progresavimą, pridedant rekombinantinio pelės NGAL (mNGAL) baltymo arba per didelę transgeninio NGAL ekspresiją in vitro. Be to, buvo ištirtas psichikos poveikis proliferacijai, apoptozei ir su autofagija susijusiems keliams. Be to, NGAL mechanizmas 2L3 ląstelėse buvo išaiškintas ištyrus išskiriamo NGAL (pN + LS) ir neišskiriamo NGAL (pN - LS) perteklinės ekspresijos poveikį 2L3 ląstelėse. Šiame tyrime buvo iš dalies ištirtas NGAL baltymo poveikis ir galimas mechanizmas ADPKD ląstelėse.

2. Medžiagos ir metodai

2.1. Ląstelių linijos

Pkd1L3/L3 (2L3) ląstelių linija buvo sukurta SV40 virusu transdukuojant pirmines inkstų epitelio ląsteles iš 2L3 pelių, ADPKD pelių modelio, siekiant sukelti įamžintą ląstelių liniją [17, 18]. Pirminės inkstų ląstelės buvo užkrėstos antrą kartą, naudojant Lenti SV40 viruso įamžinimo rinkinį (Capital Biosciences Inc., Gaithersburg, MD, JAV). Ląstelės buvo inkubuojamos 5% CO2 37 °C temperatūroje ir apdorojamos polibrenu (8 µg/mL) per naktį šešių šulinėlių plokštelėje. Kitą dieną viruso supernatantas buvo išmestas, o ląstelės buvo inkubuojamos šviežioje terpėje. Pasiekusios susiliejimą, ląstelės buvo subkultūrintos į 10-cm lėkštelę su auginimo terpe ir laikomos pirmojo pasažo (P1) ląstelėmis. SV40-transformuoti klonai buvo atrinkti ir išskirti naudojant klonavimo žiedus [17,18]. M-1 ląstelių linija (Pkd1+/+), įsigyta iš BCRC (Hsinchu, Taivanas), buvo naudojama kaip laukinio tipo ląstelių linija.

2.2. Ląstelių kultūra

Ląstelės buvo perduodamos kas tris dienas. Norint patikrinti mNGAL IC50 ADPKD ląstelėse, 2L3 ląstelės buvo pasėtos į 24-šulinėlių plokšteles (6000 ląstelių/šulinėlyje) su 500 µL aukščiau aprašytos terpės ir inkubuojamos. 16 val. Tada ląstelės buvo apdorotos rekombinantiniu mNGAL (0, 20, 40, 80, 160, 320 µg/ml) arba rapamicinu (1 µM, iš Sigma, Sent Luisas, MO, JAV) dar 0, 8, 24 arba 48 h (n=4).

2.3. Dažymas lektinu

Norint patikrinti, ar M{{0}} ir 2L3 ląstelės yra iš panašios kilmės inkstų kanalėlių, lektinas dažomas Lotus tetragonolobus lektinu (LTL, kuris yra diferencijuotas proksimalinis kanalėlių žymeklis, pažymėtas fluoresceinu) ir Dolichos biflorus agliutininu (DBA). , kuris yra diferencijuotas surinkimo kanalo žymeklis, pažymėtas rodaminu). Lt ir DBA pirko iš Vector Laboratories (Burlingame, CA, JAV). Ląstelių stebėjimui ląstelės, kultivuotos ant dangtelio, tris kartus 10 minučių plaunamos fosfatiniu buferiniu tirpalu (PBS), o po to 30 minučių fiksuojamos 4% paraformaldehidu (PFA) PBS. Po 20 min. pralaidinimo 0,4 % Triton X-100 PBS (PBST), ląstelės buvo blokuojamos 10 % arklio serumu PBST 1,5 val. Ląstelės buvo dažytos LTL (20 µg/mL) ir DBA (20 µg/mL) 1 val. 37 ◦C temperatūroje. Branduoliai buvo nudažyti DAPI (1 µg/ml) 5 min. Mėginiai buvo plaunami PBST tris kartus 10 minučių tarp etapų.

2.4. DNR lizatas ir genotipų nustatymas

Pkd1 geno genotipui nustatyti, genominėms DNR sekoms amplifikuoti buvo naudojami PGR pirminiai (50 -TGTGTTGTTCTTTGTGGCAGTCAG-30 ) ir atvirkštiniai (50 -ATTCTCAATGACTGACTTGGGCTC-30 ) pradmenys. Mėginiai kaitinami 94 ◦C temperatūroje 5 min., po to buvo atlikta 30 ciklų (94 ◦C 1 min., 56 ◦C 1 min., 72 ◦C 1 min.), po to 72 ◦C 10 min. ir 25 ◦ C 5 min. Po amplifikacijos PGR, DNR produktai buvo sumaišyti su 6x pakrovimo dažais ir analizuojami naudojant 1% agarozės Tris-borate-EDTA (TBE) gelį.

2.5. Kiekybinė atvirkštinės transkripcijos realaus laiko polimerazės grandininė reakcija (RT-qPCR)

Bendra RNR iš ląstelių linijos buvo išskirta naudojant MagQu gDNR ekstrahavimo rinkinį (MagQu, Naujasis Taipėjus, Taivanas), po to apdorotas DNaze I (Worthington, Lakewood, NJ, JAV) ir laikoma ddH2O temperatūroje –80 ◦C. RNR kokybė ir koncentracija buvo nustatyti naudojant 1% TBE agarozės gelį ir NanoDrop spektrofotometrą (Thermo Fisher Scientific). Šablono RNR buvo atvirkštinė transkribuota į kDNR, naudojant RevertAid First Strand cDNR sintezės rinkinį (Thermo Fisher Scientific), dalyvaujant RNaseOUTTM RNazės inhibitoriui (G-Biosciences, St. Louis, MO, JAV). Kiekvienos reakcijos bendras tūris buvo 20 µL, įskaitant bendrą RNR (100 ng), Oligo (dT)18 pradmenį (1 µL), 5X reakcijos buferį (4 µL), RiboLock RNazės inhibitorių (20 V), dNTP mišinį ( 1 mM), RevertAid atvirkštinė transkriptazė (200 V) ir vanduo be nukleazės. Pirmosios krypties cDNR sintezei mėginiai buvo kaitinami 42 ◦ C temperatūroje 1 valandą, o tada reakcija buvo nutraukta kaitinant 70 ◦ C temperatūroje 1 minutę.

Genų ekspresijos kiekybinis įvertinimas buvo atliktas naudojant StepOne™ Real-Time PGR sistemą (Applied Biosystems, Norwalk, CT, JAV). Kiekvienas mėginys buvo paruoštas iš viso 20 µL, įskaitant genų specifinius priekinius (100 nM), atvirkštinius (100 nM) pradmenis (1 lentelė), cDNR šabloną (100 ng), ORATM SEE qPCR Green ROX H Mix (1 × , high GmbH, Kraichtal, Vokietija) ir PGR vandeniu. Mėginiai kaitinami 95 ◦C temperatūroje 2 min., po to sekė 40 ciklų (95 ◦C 5 s, 65 ◦C 25 s) ir lydymosi kreivės analizė (95 ◦C 15 s, 60 ◦C 1 min. , 95 ◦C 15 s), naudojant StepOne™ realiojo laiko PGR sistemą. Duomenys buvo analizuojami naudojant StepOne™ programinę įrangą (v2.3). Normalizavimui buvo naudojama Gapdh genų ekspresija.

2.6. Ląstelių gyvybingumo tyrimas

Ląstelių gyvybingumas buvo nustatytas naudojant tiazolilmėlynąjį tetrazolio bromidą (MTT tyrimas) (Sigma). MTT tirpalas (0,5 mg/mL) buvo įpiltas į kiekvieną šulinėlį ir inkubuojamas 37 ◦C temperatūroje 2 valandas. Kad ištirptų purpuriniai formazano kristalai, į kiekvieną šulinėlį įpilama dimetilsulfoksido (DMSO, Sigma). terpė ir MTT tirpalas. Kiekvieno mėginio optinis tankis (OD) esant 570 nm buvo išmatuotas naudojant ELISA skaitytuvą (Thermo Fisher Scientific).

2.7. Ląstelių proliferacijos tyrimas

M-1 ir 2L3 ląstelių proliferacijai išanalizuoti buvo atliktas bromodeoksiuridino (BrdU) ląstelių proliferacijos tyrimas (Millipore, Burlington, MA, JAV). Norint palyginti M-1 ir 2L3 ląstelių proliferacijos gebėjimą, ląstelės buvo kultivuojamos 96-šulinėlių plokštelėse (5 × 103 ląstelės / duobutėje) 24 valandas. BrdU buvo pridėtas prie terpės likus 2 valandoms iki inkubacinio laikotarpio pabaigos. Norint ištirti mNGAL poveikį 2L3 ląstelių proliferacijai, 2L3 ląstelės pirmiausia buvo kultivuojamos 96-šulinėlių plokštelėse (2 × 103 ląstelės / duobutėje) 16 valandų, po to dar 8, 24 ir 48 valandas buvo apdorotos mNGAL. BrdU buvo pridėtas prie terpės likus 2 valandoms iki valgio inkubacinio laikotarpio pabaigos. Tada ląstelės buvo fiksuojamos fiksuojančiu tirpalu (200 µl/šulinėle) 37 ◦C temperatūroje 30 min., po to 1 val. inkubuojamos su BrdU aptikimo antikūnu (100 µL/šulinėlė) 37 °C temperatūroje ir su peroksidaze konjuguotu ožkų anti-pelės antikūnu. (100 µL/šulinėlė) 37 ◦C temperatūroje 30 min. Ląstelės tris kartus plaunamos plovimo buferiu ir nusausinamos ant popierinių rankšluosčių tarp aukščiau aprašytų žingsnių.

Po inkubacijos su TMB peroksidazės substratu (100 µl/šulinėlė) 37 ◦C temperatūroje 30 min. tamsoje, reakcija buvo sustabdyta stabdymo tirpalu (100 µl/šulinėle). Galiausiai kiekvieno mėginio OD450 buvo išmatuotas naudojant ELISA skaitytuvą (Thermo Fisher Scientific).

2.8. Apoptozės tyrimas

Apoptozės analizei naudojant srauto citometriją, 2L3 ląstelės buvo pasėtos į 6-šulinėlių plokšteles (1,8 × 105 ląstelės / duobutėje) su 2 ml terpės ir inkubuojamos 16 valandų. Tada ląstelės buvo apdorotos mNGAL (0, 600, 1200 µg/mL) dar 0, 4 arba 12 valandų, surenkamos ir nudažytos anneksinu V-FITC ir PI (BD Biosciences, San Chosė, CA, JAV ) analizei srauto citometrija atitinkamai po 4 ir 12 val. (n=3, kontrolinei ir mNGAL). Norint nustatyti kompensaciją ir kvadrantus prieš analizę, buvo naudojamos nedažytos ląstelės, ląstelės, nudažytos tik aneksinu V-FITC, ir ląstelės, nudažytos tik PI.

2.9. Western blot analizė

Ląstelės buvo surenkamos ir lizuojamos naudojant RIPA, papildytą proteazės inhibitorių kokteiliu (1:100) ir fosfataze (1:100). Po 30 minučių inkubacijos 4 °C temperatūroje ląstelių lizatai buvo centrifuguojami 15 min 13 400 x g (Eppendorf 5415R, Hamburgas, Vokietija) 4 °C temperatūroje. Baltymų koncentracija buvo matuojama naudojant BCA testą. Vienodas kiekis baltymų (25 µg baltymo su 1:2 pakrovimo dažais / duobutėje) buvo elektroforetiškai atskirti SDS-PAGE (10%) ir 1 valandai perkelti į PVDF membranas. Tada membranos buvo užblokuotos 5 % nugriebto pieno tirpalu Tris buferiniame tirpale su 0,1 % Tween -20 (TBST) 2 valandas kambario temperatūroje. Po plovimo TBST tris kartus 10 minučių, membranos buvo inkubuojamos su pirminiais antikūnais (2 lentelė) per naktį 4 ◦ C temperatūroje, po to 1- val. inkubuojamos su HRP konjuguotais antriniais antikūnais (3 lentelė).

2.10. Trimatė ląstelių kultūra (3D kultūra)

3D kultūra buvo atlikta naudojant Matrigel matricą (Corning, NY, JAV), siekiant įvertinti cistų susidarymą. 2L3 ląstelės buvo pasėtos į 96-šulinėlių plokšteles (1000 ląstelių/šulinėlyje) ant iš anksto suformuoto Matrigel (40 % terpėje). Po to, kai ląstelės buvo prijungtos prie gelio, į ląsteles buvo pridėta daugiau Matrigel, kad susidarytų į sumuštinį panašus raštas (6 pav.). Ląstelės buvo laikomos 3D kultūroje 37 ◦C temperatūroje ir 5 % CO2. Ląstelės buvo apdorotos forskolinu (20 mM, Sigma) nuo 1 iki 3 dienos, kad būtų paskatintas cistų susidarymas. Po cistos susidarymo indukcijos forskolinu ląstelės buvo gydomos mNGAL arba be jo (2 mg / ml) nuo 4 iki 8 dienų, o terpė buvo keičiama kiekvieną dieną. Cistos susidarymas buvo stebimas mikroskopu kiekvieną dieną, o cistos skersmuo, plotas ir skaičius buvo matuojamas naudojant ImageJ. Imunocitochemija (ICC) buvo atlikta 8 dieną ant plokštelės arba dengiamųjų stiklelių. Cistų stebėjimas atliktas konfokaline mikroskopija (ZEISS, Oberkochen, Vokietija).

2.11. Imunocitochemija (ICC)

Norint stebėti cistas, cistos, kultivuotos su Matrigel duobutėse arba ant dengiamųjų stiklelių, tris kartus plaunamos PBS 1 0 min., o po to 30 minučių fiksuojamos 4% paraformaldehidu (PFA) PBS. Po 20 minučių pralaidumo 0, 4% PBST, cistos buvo blokuojamos 10% arklio serumu PBST 2 valandas. Cistos buvo nudažytos pirminiais antikūnais prieš E-kadheriną (1:500; Cell Signaling Technology, Danvers, MA, JAV) ir aktinu (1:1000; Millipore) per naktį 4 ◦C temperatūroje, o po to dažytos fluorescenciniu antriniu antikūnu (3 lentelė). tamsoje 1 val. kambario temperatūroje. Branduoliai buvo nudažyti DAPI (1 µg/ml) 5 min. Mėginiai buvo plaunami PBST tris kartus 10 minučių tarp etapų.

2.12. Konfokalinė mikroskopija

Siekiant patvirtinti, kad 3D kultūroje pastebėtos sferinės konstrukcijos buvo cistos, 3D kultūros dengiamieji stikleliai buvo pritvirtinti ant stiklelių su Fluoromount-G tvirtinimo terpe (SouthernBiotech, Birmingemas, AL, JAV) ir vaizduojami naudojant konfokalinį mikroskopą. Konfokalinis vaizdas buvo atliktas naudojant 63 × aliejaus panardinimo objektyvą. Skirtingos 2L3 cistos optinės z sekcijos 3D kultūroje buvo gautos naudojant Z-stack modulį ZEISS ZEN mikroskopo programinėje įrangoje (Oberkochen, Vokietija). Optinės cistų sekcijos buvo rekonstruotos į Z-stack arba 3D vaizdo įrašą naudojant ZEISS ZEN mikroskopo programinę įrangą.

2.13. Plazmidžių konstrukcija ir virusinė infekcija

Pelės NGAL seka (534 bp) buvo įterpta į pSecTag2B vektorių (Invitrogen, Carlsbad, CA, JAV) pelės Igκ grandinės lyderės sekos rėmelyje ir pasroviui, kad būtų per daug ekspresuojamas išskiriamas NGAL baltymas. Priešingai, pelių Igκ grandinės lyderio seka aukščiau aprašytoje plazmidėje buvo pašalinta, kad būtų per daug ekspresuojamas neišskiriamas NGAL baltymas. pSecTag2B-NGAL su lyderio seka arba be jos (atitinkamai pN + LS arba pN - LS) buvo sukurtas siekiant ištirti ryšį tarp NGAL ir NGAL receptoriaus. Siekiant užtikrinti teisingą konstrukcijų įterpimą, NheI ir NotI buvo naudojami pN + LS arba pN - LS virškinimui su NEBuffer 2 (New England Biolabs, Ipswich, MA, JAV) 37 ◦C temperatūroje 2 valandas, po to buvo atlikta analizė naudojant 1 proc. TBE gelis.

Norint sukurti stabilius klonus, 2L3 ląstelės buvo inkubuojamos DMEM/F12 terpėje (300 µL/šulinėlyje), papildytos 10 % karščiui neaktyvaus FBS, 1 % P/S, polibreno (8 µg/mL) ir lentiviruso (200 µL). 6-šulinėlių plokštelė 37 ◦C temperatūroje 24 val. Tada viruso supernatantas buvo išmestas, ląstelės plaunamos PBS ir inkubuojamos su šviežia terpe, kurioje yra blasticidino (4 µg/ml), kad būtų atrinktos užkrėstos ląstelės. Atrankos terpė buvo keičiama kas 3 dienas. Užkrėstos ląstelės buvo surinktos praėjus savaitei po blasticidino atrankos Western blot ir RT-QPCR, kad būtų išanalizuotas mNGAL ekspresijos lygis.

2.14. Su fermentais susijęs imunosorbentinis tyrimas (ELISA)

Ląstelių išskiriamo NGAL kiekybinis nustatymas buvo atliktas naudojant pelės lipokalino {{0}} (Lcn2) kietosios fazės sumuštinį ELISA rinkinį (Thermo Fisher Scientific). Ląstelių supernatantinė terpė buvo surinkta, centrifuguojama, kad būtų pašalintos ląstelių liekanos, ir laikoma –80 ◦C temperatūroje. Standartinei kreivei buvo paruošti 8 × standartinio pelės NGAL baltymo skiedimai (0, 0,024, 0,195, 1,563, 12,5, 100 ng/ml). Standartai (100 µL/šulinėlė) ir mėginiai (100 µl/šulinėlyje 10 µg bendro baltymo iš ląstelių lizato arba nepraskiesto supernatanto) buvo dedami į 96-šulinėlių plokštelę ir inkubuojami 37 ◦C temperatūroje 2,5 val. Kiekvienas šulinukas buvo inkubuojamas su biotino (100 µl/šulinėle) konjugatu 37 °C temperatūroje 1 val., o po to su streptavidino-HPR tirpalu (100 µL/šulinėlė) 37 °C temperatūroje 45 min. švelniai purtant. Tirpalas buvo išmestas, o šulinys išplautas

Po inkubacijos su TMB substratu (100 µL/šulinėle) 37 °C temperatūroje 30 min. tamsoje, reakcija buvo sustabdyta pridedant stabdymo tirpalo (50 µl/šulinėle). Galiausiai kiekvieno mėginio OD450 buvo išmatuotas naudojant ELISA skaitytuvą (Thermo Fisher Scientific).

2.15. Statistinė analizė

Visi duomenys rodomi kaip vidurkis ± standartinis nuokrypis (SD). Atliekant kelis vidutinius palyginimus, duomenys buvo analizuojami naudojant Stjudento t testą ir vienpusę dispersijos analizę (ANOVA) su Tukey post hoc testais R studijoje. Skirtumai buvo laikomi statistiškai reikšmingais, kai p reikšmė < 0,05.