Selektyvus citotoksiškumas Augalinės medžiagos acteoside prieš naviko ląsteles ir jo mechanistinės įžvalgos
Mar 14, 2022
Kontaktai: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 El. paštas:audrey.hu@wecistanche.com
Christina Cheimonidi ir kt.
ABSTRAKTUS
Natūralūs produktai pasižymi ypatinga struktūrine įvairove, todėl jie yra unikalus šaltinis naujų priešnavikinių medžiagų identifikavimui. Čia mes pranešame, kad augalinė medžiagaacteosidebuvimas izoliuotas pažangiais fitocheminiais metodais iš Lippia citriodora lapų parodė padidėjusį citotoksiškumą metastazavusioms naviko ląstelėms; veikė sinergijoje su įvairiais citotoksiniais vaistais ir įjautrintomis chemoresistantinėmis vėžinėmis ląstelėmis.Acteosidenebuvo toksiškas fiziologiniame ląstelių kontekste, tuo tarpu jis padidino oksidacinę apkrovą, paveikė proteostatinių modulių aktyvumą ir slopino matricos metalloproteinazes naviko ląstelių linijose. Intraperitoninis arba geriamasis (per geriamąjį vandenį) acteozido vartojimas melanomos pelės modelyje reguliuojamą antioksidantų atsaką navikuose; tačiau tik intraperitoninis gimdymas slopino naviko augimą ir sukėlė priešnavikinį reaktyvų imuninį atsaką. Masių spektrometrijos identifikavimo/kiekybinio įvertinimo analizė parodė, kad intraperitoninisacteosidedėl to žymiai padidėjo, palyginti su geriamuoju vartojimu, junginio koncentracija plazmoje ir gydytų pelių navikuose, o tai rodo, kad jo priešnavikinis poveikis in vivo priklauso nuo vartojimo būdo ir pasiektos koncentracijos navike. Galiausiai molekulinio modeliavimo tyrimai ir fermentinio aktyvumo tyrimai parodė, kadacteosideslopina baltymų kinazę C. Galutinai acteozidas žada kaip cheminius pastolius naujų priešnavikinių medžiagų kūrimui.
Raktažodžiai:Acteoside, Vėžys, Natūralus junginys, oksidacinis stresas, proteostazė, imunomoduliacija
1. Įvadas
Kancerogenezei būdingas kelių ląstelių signalizacijos panaikinimas ir ji yra susijusi su padidėjusiu ląstelių oksidaciniu, replikuojančiu, metaboliniu, genotoksiniu ir proteotoksiniu stresu [1]. Norėdami prisitaikyti ir įveikti šiuos streso fenotipus, piktybinės ląstelės sureguliuoja (išskyrus onkogenus) keletą ne onkogeninių kelių, kuriais siekiama arba slopinti arba (bent jau) sumažinti besitęsiantį stresą. Tarp įvairių ne onkogeninių kelių, kurie, kaip nustatyta, dažnai reguliuojami navikogenezės metu, yra proteostazės tinklo (PN) moduliai kartu su ląstelių antioksidantų atsaku [2,3].
Pagrindiniai PN komponentai yra dvi pagrindinės skilimo mašinos, būtent autofagija- lizosomų kelias (ALP) ir Ubiquitin-Proteasome kelias (UPP), kartu su ląstelių molekulinių chaperonų tinklu. ALP daugiausia dalyvauja baltymų agregatų ir pažeistų organelių skaidyme [4], o UPP skaido normalius trumpaamžius baltymus ir neattaisomus netinkamai sulankstytus ar atsiskleidusius baltymus [5–8]. 26Seukaryotinis proteosomas yra sudarytas iš 19S reguliavimo dalelių (RP) ir 20 balų dalelės (CP); pastarąjį sudaro keturi sukrauti heptamerikiniai žiedai (du α tipo aplink du β tipo), kurie sudaro į statinę panašią struktūrą. Chimotripsino tipo (CT-L), tripsino tipo (T-L) ir kaspazę primenančios (C-L) proteasomos peptidazės veikla yra atitinkamai β5, β2 ir β1 proteasominiuose subvienetuose [6]. Įrodytas klinikinis proteosomų inhibitorių bortezomibo (Velcade®; taip pat pavadintas PS-341) ir karfifilzomibo veiksmingumas prieš įvairius hematologinius piktybinius navikus [9] suteikė "koncepcijos įrodymą", kad UPP buvo nukreiptas kaip perspektyvi vėžio gydymo strategija. Sudėtingas ląstelių antioksidantų gynybos kelių tinklas, kuris dažnai reguliuojamas kancerogenezės metu [3,10], apima antioksidantų fermentus, taip pat keletą transkripcijos veiksnių, kurie mobilizuoja citoprotekcinius genominius atsakus; tai apima šakutę O (Foxo) ir branduolinio faktoriaus eritroido 2-ąjį faktorių (Nrf-2). Nrf-2 yra pagrindinis ląstelių apsaugos nuo oksidacinio ir (arba) ksenobiotinio pažeidimo veiksnys, nes jis stimuliuoja antioksidantų ir II fazės genų ekspresiją [11-13].
Mes ir kiti neseniai pasiūlėme, kad nukreipimas į šias naviko priklausomybes (t. Y. Proteostatinius modulius ir (arba) antioksidantų atsako kelius) arba didėjantis ROS ląstelių kiekis transformuoto genotipo kontekste suteikia galimą terapinį langą selektyviam naviko ląstelių žudymui [3,14]; palaikant, buvo pranešta apie selektyvų vėžinių ląstelių žudymą maža molekule, kuri padidino reguliuojamą ląstelių ROS lygį [2]. Tikimasi, kad kombinatoriniai metodai, įskaitant ir priešnavikinio reaktyviojo imuninio atsako aktyvavimą [15], greičiausiai maksimaliai padidins terapinį langą, kurį siūlo slopindami PN ir antioksidantų atsaką ir (arba) padidindami ląstelių ROS lygį.
Natūralūs produktai (ekstraktai arba gryni junginiai) (NP) iš įvairių šaltinių (augalų, jūrų organizmų, mikroorganizmų ir kt.) tikrinami dėl jų gebėjimo veikti kaip priešnavikiniai agentai dėl jų ypatingos struktūrinės įvairovės ir cheminio sudėtingumo, taip pat dėl to, kad jie veikia pleiotropiškai moduliuodami kelis ląstelių signalizacijos kelius [16]. Pranešama, kad NP suaktyvina anti-žiedyno, priešnavikinį ir (arba) antistatinį atsaką [16,17] ir taip pat išvengia atsparumo daugeliui vaistų [18,19]. Iš jų fenoliniai junginiai (įskaitant feniletanoidinius glikozidus) sulaukė didelio susidomėjimo dėl jų vaidmens įvairių žmonių ligų prevencijoje ir (arba) gydyme.
Acteozidas, dar vadinamas vartosena arba verbaskozidu [20], yra feniletanoidinis glikozidas, išskirtas iš daugelio dvigubų durtledonų. Pranešama, kad acteozidas turi keletą įdomių biologinių veiklų, įskaitant antioksidacines, priešuždegimines ir ląstelių apoptozės reguliavimo savybes [21,22]. Nepaisant to, jo galimas priešnavikinis aktyvumas nebuvo aptartas. Čia mes pranešame, kad acteozidas parodė padidėjusį citotoksiškumą prieš žinduolių vėžio ląsteles ir neturėjo akivaizdaus toksinio poveikio fiziologiniame ląstelių kontekste. Be to, acteozidas slopino melanomos naviko augimą "Vivo" pelės modelyje, (be kita ko) suaktyvindamas priešnavikinį reaktyvų imuninį atsaką.
2. Medžiagos ir metodai
2.1. Augalinė medžiaga ir ekstrahavimas
džiovinti Lippia citriodora (Lamiaceae) lapai (4,5 kg) buvo įsigyti iš vietinės rinkos Atėnuose, Graikijoje. Lapai buvo susmulkinti ir ekstrahuojami mechaniškai maišant 12 h metanoliu (2 × 20 L). Metanolio ekstraktas išgarinamas iki sauso likučio ir plaunamas CH2Cl2/MeOH 98/2 (15 L) mišiniu. Netirpios liekanos buvo atskirtos ir išdžiovintos, gaminant žaliai geltonus miltelius (450 g).
2.2. Aktuozido ir UPLC-HRMS analizės gryninimas
Dalis (10 g) pirmiau minėtų likučių buvo apdorota priešsrovinės srovės chromatografija, naudojant greitą išcentrinės skaidinių chromatografijos (FCPC) aparatą (Kromaton, Prancūzija); EtOAc/EtOH/H2O mišinys santykiu 5/0,5/4,5 buvo naudojamas kaip dvifazių tirpiklių sistema. Surinktoms frakcijoms buvo taikoma plonasluoksnė chromatografija; tada chromatogramos buvo stebimos UV lempoje (254 ir 365 nm) ir vizualizuojamos purškiant metanolio vanilino sulfatu, po to kaitinama dvi minutes. Iš viso minėtame procese buvo išskirta 2,1 g akteozido (grynumo ≥ 90%) Akteozido identifikavimas buvo atliekamas branduolinio magnetinio rezonanso (NMR) ir masių spektrometrijos (MS) spektrais, o jo grynumas buvo nustatytas UPLC-MS ir NMR analize; daugiau informacijos rasite Suppl. Medžiagos ir metodai.
2.3. Langelių linijos
Žmogaus plaučių embrioniniai fibroblastai (IMR90 ląstelės) kartu su B16. F1, B16. F10, YAC-1 ir WEHI-164 pelės ląstelių linijos buvo gautos iš Amerikos audinių kultūros kolekcijos (ATCC). U2 OS ir Sa OS žmogaus osteosarkomos ląstelių linijas maloniai paaukojo prof. V. Gorgoulis (Medicinos mokykla, Atėnų nacionalinis ir Kapodistriano universitetas, Graikija), o KH OS osteosarkomos ląstelės ir chemoresistant osteosarkomos ląstelių linijos [23] buvo dr. E. Gonoso (Nacionalinis Graikijos tyrimų fondas, Graikija) donorystė. Pelės vėžio ląstelių linijos C5N ir A5 priklauso daugiapakopiam pelės odos kancerogenezės modeliui [24,25] ir buvo paaukotos prof. A. Balmain (Išsamus vėžio centras, Kalifornijos universitetas, JAV). Naudojamų ląstelių linijų kultivavimo sąlygos pateikiamos suppl. Medžiagos ir metodai.
naudacistanche acteoside
2.4. Melanomos pelės modelio patinas
C57BL/6 pelės (25–30 g svorio, 6–8 savaičių amžiaus) buvo gautos iš Graikijos pasteur instituto ir apgyvendintos kontroliuojamoje temperatūroje (22 °C) ir fotoperiode (12 val. šviesoje: 12 val. tamsoje) su laisva prieiga prie vandens ir maisto. Pelės buvo po oda inokuliuojamos 105 B16. F1 melanomos ląstelės (100 μL PBS) ir atsitiktinai buvo priskirtos 3 grupėms (n = 5/grupei). Kai navikai tapo apčiuopiami (11 diena), pelės gavo acteozidą dviem būdais; arba intraperitoniniu būdu (IP) (1 mg už pelę, praskiestą 200 μL PBS; iš viso 6 dozės skiriamos kas antrą dieną) arba per burną geriamuoju vandeniu (OR) (2,5 mg/pelė; iš viso 13 dozių 13 dienų iš eilės). Kontrolinėms pelėms buvo skiriamas PBS. Auglio augimas buvo registruojamas kas 2 dienas, matuojant pagrindines ir nedideles susidariusių navikų ašis skaitmeniniu apkaba. Matavimai buvo transformuoti į naviko tūrį naudojant formulę: naviko tūris (cm3) = pagrindinė ašis × minorinė ašis2 × 0,5. 28 dieną gyvūnai buvo eutanazuoti gimdos kaklelio dislokacijos būdu, o blužnis buvo aseptiškai pašalintas. Eksperimentas buvo pakartotas tris kartus su panašiomis išvadomis.
Splenocitai buvo išskirti iš individualiai homogenizuotų blužnies ir nedelsiant ištirti dėl jų citotoksiškumo, palyginti su B16. F1, YAC-1 ir WEHI-164 ląstelių taikiniai. Citotoksiškumas buvo įvertintas remiantis CD107 ekspozicijos ląstelės paviršiuje nustatymu dėl efektoriaus ląstelių degranuliacijos. Splenocitai (105 ląstelės/šulinys) buvo kultivuojami kartu su taikiniais 96 duobučių U dugno mikroplatuose, esant efektoriaus ir taikinio (E: T) santykiui 100:1, esant 37 °C 5% CO2. Į kiekvieną duobutę buvo pridėta FITC konjuguotų anti-CD107a ir anti-CD107b monokloninių antikūnų (25 μL/ml) ir monenzino (6 μL/ml; visi iš BD Biosciences). Ląstelės buvo surinktos po 6 val. ir analizuojamos naudojant FACSCanto II srauto citometrą. Tuo pačiu metu navikai buvo išpjauti ir apdoroti tolesniems tyrimams, kaip aprašyta Suppl. Medžiagos ir metodai.
cistanche acteoside
