SARS-CoV{1}} pažeidžiamumo vieta sukelia plačią apsaugą nuo antigeninių omikronų subvariantų
Nov 30, 2023
Sparti sunkaus ūminio kvėpavimo sindromo koronaviruso 2 (SARS-CoV-2) Omicron variantų raida pabrėžė būtinybę nustatyti antikūnus, turinčius plačių neutralizuojančių savybių, kad būtų galima informuoti apie būsimą monokloninį gydymą ir skiepijimo strategijas. Čia mes nustatėme S728-1157, plačiai neutralizuojantį antikūną (bnAb), nukreiptą į receptorių surišimo vietą (RBS), kuris buvo gautas iš asmens, anksčiau užsikrėtusio WT SARS-CoV-2 prieš išplitimą. susirūpinimą keliančių variantų (LOJ). S728-1157 parodė platų visų dominuojančių variantų, įskaitant D614G, Beta, Delta, Kappa, Mu ir Omicron (BA.1/BA.2/BA.2.75/BA.4/BA.5/), kryžminį neutralizavimą BL.1/XBB). Be to, S728-1157 apsaugojo žiurkėnus nuo WT, Delta ir BA.1 virusų in vivo iššūkių. Struktūrinė analizė parodė, kad šis antikūnas yra nukreiptas į 1 klasės/RBS-A epitopą receptorių surišimo domene per daug hidrofobinių ir polinių sąveikų su sunkiosios grandinės komplementarumą lemiančiu 3 regionu (CDR-H3), be įprastų CDR-H1/ motyvų. 1 klasės antikūnų CDR-H2/RBS-A. Svarbu tai, kad šis epitopas buvo lengviau prieinamas atviroje ir prefuzinėje būsenoje arba heksaprolino (6P) stabilizuotose smailės konstrukcijose, palyginti su diprolino (2P) konstrukcijomis. Apskritai S728-1157 demonstruoja platų terapinį potencialą ir gali informuoti apie tikslinę vakciną nuo būsimų SARS-CoV-2 variantų.
cistanche tubulosa - stiprina imuninę sistemą
Įvadas
Nuo pandemijos pradžios 2019 m. gruodžio mėn. dėl sunkaus ūminio kvėpavimo sindromo koronaviruso 2 (SARS-CoV-2) viruso 2019 m. užsikrėtė daugiau nei 660 mln. koronavirusinės ligos (COVID-19) ir daugiau nei 6,5 milijonai mirčių visame pasaulyje. Nors spartus vakcinų ir gydymo priemonių kūrimas ir platinimas didžiąja dalimi sumažino COVID{9}} poveikį, cirkuliuojančių susirūpinimą keliančių variantų (LOJ) atsiradimas ir toliau kelia didelę grėsmę dėl galimo tolesnio imuniteto vengimo. ir padidintas patogeniškumas. D614G variantas buvo anksčiausiai atsiradęs variantas, kuris vėliau tapo visuotinai paplitęs. Palyginti su WT, D614G variantas padidino pernešamumą, o ne padidino patogeniškumą, todėl klinikinių tyrimų metu mažai tikėtina, kad jis sumažins vakcinų veiksmingumą (1). Nuo D614G pasirodymo iki 2021 m. spalio mėn. visame pasaulyje atsirado dar 4 reikšmingi LOJ, įskaitant alfa, beta, gama ir delta. Tarp šių variantų Delta tapo rimta pasauline grėsme dėl pernešamumo, padidėjusio ligos sunkumo ir dalinio imuniteto vengimo, kaip rodo sumažėjęs polikloninio serumo ir mAb gebėjimas neutralizuoti šią padermę (2–6). Netrukus po to, 2021 m. lapkričio mėn., Omicron variantas buvo identifikuotas ir paskelbtas kaip naujas LOJ. Šis variantas iki šiol turėjo daugiausiai mutacijų ir, atrodo, išplito greičiau nei ankstesnės padermės (7, 8). Šiuo metu yra daugybė „Omicron“ porūšių, dėl kurių atsiranda naujų COVID{21}} atvejų, o BQ.1, BQ.1.1 ir XBB.1.5 tampa dominuojančiais prieš BA.5 ir tuo metu sudarė daugumą naujų atvejų visame pasaulyje. rašymo. Omicron variantai gali išvengti įvairaus masto su COVID-19 vakcina susieto imuniteto atpažinimo, todėl labai sumažėja sveikstančių, visiškai mRNR vakcinuotų asmenų ir asmenų, sustiprintų nauju dvivalenčiu WT/BA.5 vakcina, serumo antikūnų neutralizuojantis potencialas. mRNR vakcina (9, 10). Panašiai Omicron variantai sugebėjo išvengti kelių skubaus naudojimo leidimo (EUA) terapinių mAb surišimo, nors anksčiau buvo įrodyta, kad jie yra veiksmingi prieš ankstesnius LOJ (10–12). Dėl sumažėjusios neutralizacijos prieš Omicron ir nuolatinės būsimų LOJ grėsmės būtina skubiai nustatyti plačius ir stiprius neutralizuojančius antikūnus, galinčius apsaugoti nuo įvairių besivystančių SARS-CoV{38}} linijų. Šiame tyrime mes nustatėme stiprų receptorius surišantį domeną reaktyvų (RBD reaktyvų) mAb iš SARS-CoV-2 sveikstančio asmens periferinio kraujo, kuris veiksmingai neutralizavo alfa, beta, kappa, delta, mu, ir Omicron variantai (BA.1, BA.2, BA.2.75, BA.4, BA.5, BL.1 ir XBB). Šis mAb, S728-1157, reikšmingai sumažino BA.1 Omicron, Delta ir WT virusų kiekį plaučiuose ir nosies gleivinėje po in vivo užkrėtimo žiurkėnais. S728-1157 suriša receptorių surišimo vietą (RBS), kuri yra visiškai atvira, kai UBR ant smaigalio yra viršutinės konformacijos. mAb naudojami motyvai, esantys CDR-H1 ir CDR-H2, kurie yra bendri IGHV3-53/3-66 1 klasės/RBS-A antikūnams (13, 14), bet taip pat ir dėl plataus unikalaus kontakto su CDR. -H3, kad būtų išvengta LOJ šuolių mutacijų. Tai rodo, kad racionalus būsimų vakcinų, apimančių Omicron variantus, dizainas turėtų būti pakeistas, kad būtų stabilizuotas šuolis daugiausia aukštesnėje konfigūracijoje, kad būtų optimaliai sužadinti 1/RBS-A klasės mAb, turintys panašias CDR-H3 savybes.
cistanche nauda - stiprina imuninę sistemą
Rezultatai
Su UBD reaguojančių mAb, kurie pasižymi įvairiais neutralizacijos ir stiprumo modeliais, išskyrimas. Prieš plintant Omicron linijai, mes anksčiau apibūdinome 43 mAb, nukreiptus į skirtingus smaigalio baltymo epitopus, įskaitant N-galo domeną (NTD), RBD ir 2 subvienetą (S2). Nė vienas iš šių antikūnų negalėjo neutralizuoti tuo metu cirkuliuojančių SARS-CoV-2 variantų (15). Šiame tyrime papildoma į UBR reaguojančių mAb grupė buvo išreikšta iš 3 asmenų, kuriems buvo didelis atsakas, kurie sukūrė tvirtą anti-spike IgG atsaką, kaip apibrėžta anksčiau (16) (1 ir 3 papildomos lentelės; papildomos medžiagos galima rasti internete kartu su šiuo straipsniu; https://doi.org/10.1172/JCI166844DS1). Nors smailių UBR surišančių B ląstelių dalis buvo panaši tarp turinčių didelį atsaką, palyginti su vidutinio ir mažo atsako (1 pav., A–C), sunkiosios grandinės somatinės hipermutacijos dažnis buvo žymiai didesnis grupėje, kuriai jautriai reaguoja (1 pav. , D ir E), o tai rodo, kad šie asmenys gali turėti didžiausią potencialą sukurti stiprius kryžmiškai reaguojančius mAb (16). Šie antikūnai buvo toliau tiriami prieš UBR mutantus, siekiant nustatyti jų epitopų klasifikaciją (17). Tarp 14 su UBD reaguojančių mAb nustatėme 4 2 klasės mAb, 2 3 klasės mAb ir 8 neklasifikuotus mAb, kurių prisijungimas prie visų pagrindinių tirtų UBR mutantų sumažėjo arba visai nesumažėjo (1F pav.). Pažymėtina, kad 2 klasės, 3 ir 4 klasės antikūnai maždaug atitinka RBS BD, S309 ir CR3022 epitopus, apibrėžtus ankstesniuose tyrimuose (13, 18). 2 ir 3 klasės UBR mAb neatpažino kelių variantų UBR mutanto, turinčio K417N/E484K/L452R/N501Y pakaitų, dirbtinai sukurto UBR, apimančio pagrindines viruso pabėgimo mutacijas (17, 18), taip pat neįrodė jokio kryžminio reaktyvumo SARS-CoV{54}} ir Artimųjų Rytų kvėpavimo sindromo (MERS)-CoV UBR (1F pav.). Funkciškai 2 ir 3 klasės RBD mAb stipriai neutralizavo D614G ir Delta variantus, tačiau neutralizuojantis aktyvumas buvo labiau ribotas prieš Beta, Kappa ir Mu (1G pav.). Nė vienas iš ištirtų 2 ar 3 klasės antikūnų neneutralizavo nė vieno ištirto Omicron varianto.
Priešingai, dauguma neklasifikuotų mAb prisijungė prie UBR daugiavarianto ir kryžmiškai reagavo į SARS-CoV-1 UBR (1F pav.). Tarp jų mes nustatėme 3 mAb, S451-1140, S626-161 ir S728-1157, kurie parodė didelį neutralizavimo potencialą prieš D614G ir kryžminį neutralizuotą Beta, Delta, Kapa, Mu ir Omicron BA.1, kurio 99 % slopinimo koncentracija (IC99) yra 20–2500 ng/mL (1G pav.). Atsižvelgdami į didelį šių 3 mAb neutralizavimo potencialą, be apnašų tyrimo platformos, mes taip pat atlikome neutralizavimo veiksmus prieš autentiškus BA.2.75, BL.1 (BA.2.75+R346T), BA.4, BA.5 ir XBB virusai, naudojant židinio mažinimo neutralizacijos testą (FRNT) (1G pav.). Iš jų S728-1157 pasižymėjo dideliu neutralizuojančiu aktyvumu prieš Omicron variantų skydelį, įskaitant BA.1, BA.2, BA.4 ir BA.5, o IC99 buvo iki 100 ng/mL, matuojant pagal apnašų tyrimas. Panašus scenarijus buvo stebimas naudojant FRNT, kai S728-1157 išlaikė aukštą neutralizacijos aktyvumą prieš BA.2.75, BL.1, BA.4, BA.5 ir XBB, kai IC50 buvo 8–300 ng diapazone. /mL (1G pav.). S451-1140 stipriai neutralizavo BA.1, BA.2, BA.2.75 ir BL.1, bet ne BA.4 ir BA.5, kaip pastebėta abiejose neutralizacijos tyrimo platformose. Kita vertus, S626-161 neįrodė neutralizuojančio aktyvumo prieš Omicron variantus, išskyrus BA.1 variantą (1G pav.). Nors S626-161 neutralizuoja tirtus LOJ mažiau nei kiti 2 antikūnai, tai buvo vienintelis mAb, kuris parodė kryžminį reaktyvumą ne tik SARS CoV{58}} UBR, bet ir sugebėjo neutralizuoti šikšnosparnį. koronavirusai WIV{59}} ir RsSHC014 (1 pav., F ir G). Šie duomenys rodo, kad S626-161 atpažįsta konservuotą epitopą, kuris dalijasi tarp šių arbovirusų linijų, bet jo nėra BA.2 ir vėlesnėse padermėse. Be to, palyginti su S728-1157 ir S451-1140, S626-161 turi ilgesnį CDR-H3, kuris gali suteikti geresnę galimybę atpažinti labai konservuotą arbovirusų dalijimąsi liekanų pleistrą, kaip aprašyta. ankstesniame tyrime (19) (1 papildomas paveikslas). Lygindami šių 3 mAb imunoglobulino sunkiosios (IGHV) ir lengvosios grandinės (IGLV arba IGKV) kintamuosius genus su turima SARS-CoV-2 neutralizuojančių mAb duomenų baze (13, 15, 20–27), nustatėme, kad sunkioji grandinė kintamieji genai, kuriuos naudoja S728-1157 (IGHV3-66), S451-1140 (IGHV3-23) ir S626-161 (IGHV4-39), turi Anksčiau buvo pranešta, kad jie koduoja kelis stipriai neutralizuojančius SARS-CoV{85}} antikūnus, nukreiptus į UBR (21, 22, 28, 29). Tačiau tik S728-1157 turėjo unikalias sunkiųjų ir lengvųjų grandinių kintamų genų poras, apie kurias duomenų bazėje nebuvo pranešta (3 papildoma lentelė), o tai rodo, kad tai nėra viešas klonotipas.
1 pav. Su UBR reaguojančių mAb, išskirtų iš COVID-19 sveikstančių asmenų, apibūdinimas
Šie 3 mAb (S451-1140, S626-161 ir S728-1157) buvo toliau apibūdinti, siekiant nustatyti jų prisijungimo prie SARSCoV-2 LOJ pločio (2 pav., A ir B) . Įrodyta, kad prefuzijos stabilizuotas smaigalys, turintis 2-prolino pakaitų S2 subvienete (2P; diprolinas), yra geresnis imunogenas, palyginti su WT smaigaliu, ir yra kelių dabartinių SARS-CoV-2 pagrindas. vakcinų, įskaitant mRNR pagrindu pagamintas vakcinas (30, 31). Visai neseniai buvo pranešta, kad smaigalio baltymas, stabilizuotas 6 prolinais (6P; heksaprolinas), padidina ekspresiją ir yra dar stabilesnis nei pradinis diprolino konstruktas; todėl buvo pasiūlyta jį naudoti naujos kartos COVID{17}} vakcinose (32, 33). Norint nustatyti, ar yra antigeniškumo skirtumų tarp diprolino ir heksaprolino smaigalių konstrukcijų, abu imunogenai buvo įtraukti į mūsų bandymų grupę. Išmatuodami ELISA metodu, nustatėme, kad 3 mAb surišo 6P-WT smaigalio antigeną labiau, palyginti su WT-2P smaigaliu (2 pav., A ir B). Visų 3 mAb buvo panašus prisijungimas prie alfa, beta, gama ir delta virusų smailių, palyginti su WT-2P (2 pav., A ir B). Tačiau šių 3 mAb surišimo reaktyvumas buvo žymiai sumažintas prieš Omicron šeimos antigenų grupę (2 pav., B ir C). S451-1140 surišimas buvo jautrus BA.1 ir BA.2 mutacijoms, todėl surišimas labai sumažėjo ir neutralizacija prieš šiuos variantus sumažėjo 31-kartą, palyginti su WT-2 P antigeno ir D614G viruso atitinkamai (2B pav.). Sarbekoviruso kryžminį neutralizavimo mAb S626-161 taip pat parodė nuo 1.2- iki 35-sumažėjusį prisijungimą prie smaigalio BA.1 antigeno, o tai gali lemti {{45} }karto sumažėjęs neutralizacijos aktyvumas prieš BA.1 (1G pav. ir 2 pav., B ir C). Stipriausio plačiai neutralizuojančio antikūno (bnAb), S728-1157, prisijungimas prie Omicron antigenų buvo mažesnis (nuo 1{51}} iki 4{53}} kartų), palyginti su WT-2P smaigalys ir nebuvo paveiktas neutralizuojantis aktyvumas (1G pav. ir 2 pav., B ir C). Didelis Omikroną neutralizuojančių mAb prisijungimo prie BA.1 smaigalio sumažėjimas gali būti susijęs su jo mobilumo pakitimais ir su sandariu Omicron 3-RBD žemyn struktūrų sandarumu ir pirmenybe 1- iki UBR, kurie padeda išvengti antikūnų, kaip nurodyta ankstesniame tyrime (34). 2P ir 6P stabilizuojančios mutacijos taip pat turi skirtingą poveikį Omicron variantuose, kur visi 3 mAb parodė daugiau nei 2{67}}kartą didesnį prisijungimą prie smaigalio BA.1-6P lyginant su BA.1-2P versija, bet tik šiek tiek padidino prisijungimą prie BA.2 ir BA.4/5 6P versijų, palyginti su jų 2P versijomis, 1,2 × 1,4 ×, o tai rodo, kad Omicron neutralizuojantys mAb yra šiek tiek geriau prieinami heksapolio versijoms, ypač smaigalio BA.1 konstrukcijai. Be ELISA, buvo naudojama biologinio sluoksnio interferometrija (BLI), siekiant kiekybiškai įvertinti šių 3 mAb surišimo greitį ir pusiausvyros konstantas (kon, koff ir KD) su smaigalių antigenų skydeliu (papildomas 2 paveikslas). Fragmento antigeno prisijungimo (Fab) prie heksaprolino spyglių atpažinimo kon dažnis buvo nuo 1 5- iki 33- kartų greitesnis, palyginti su diprolino spygliais (papildomas 2 paveikslas, B ir C), parodydamas, kad antikūnai prie 6P konstrukcijos prisijungia greičiau nei prie 2P konstrukcijos. To būtų galima tikėtis, jei epitopai būtų lengviau prieinami UBR atviroje būsenoje ant heksaprolino smaigalio. Išskyrus S626- 161, Fabs atsiskyrė nuo heksaprolino smaigalio lėčiau (turėjo mažesnį koffą) nei diprolino smaigalys, todėl bendras KD parodė, kad S728-1157 ir S451-1140 prisijungė prie heksaprolino smaigalys su didesniu afinitetu (papildomas 2 paveikslas, B ir C). Prisijungimo prie heksaprolino smaigalio padidėjimas buvo dar labiau pastebimas nepažeisto IgG atveju, taikant 1:2 sąveikos modelį, kaip parodyta S728-1157 ir S451- 1140 mAb, atitinkantį kelių epitopų ekspoziciją su 6P stabilizavimu. pagerėjęs avidiškumas (papildomas 2 paveikslas, A ir C). Visi šie rezultatai rodo, kad tiksliniai epitopai gali būti palyginti labiau prieinami ant 6P stabilizuoto smaigalio, kai UBR yra atviroje būsenoje. Po to buvo atlikta struktūrinė analizė, siekiant patikrinti šią spėjimą.
2 pav. Omikroną neutralizuojančių mAb surišimo plotis
Plačiai neutralizuojančių mAb struktūrinė analizė. Kaip pirmasis surištų epitopų aproksimavimas, buvo naudojamas ELISA konkurencinis tyrimas, siekiant nustatyti, ar šie 3 plačiai neutralizuojantys mAb sutampa su mūsų dabartine mAb grupe, mAb rinkiniu, kurio epitopų specifiškumas žinomas iš ankstesnių tyrimų (15, 25, 35). ir kiti 2 šiuo metu klinikiniai mAb, LY-CoV555 (Eli Lilly) (36) ir REGN10933 (Regeneron) (37). S451-1140 ir S728-1157 surišimo vietos iš dalies sutapo su CC12.3 (23, 25), 1 klasės neutralizuojančiu antikūnu, ir dauguma 2 klasės antikūnų, įskaitant LY-CoV555 ir REGN10933, bet ne su 3 ir 4 klasės antikūnais (3A pav.). S626-161 surišimo srityje sutampa su 1 klasės CC12.3, keliais 4 klasės antikūnais, įskaitant CR3022, ir kitais neklasifikuotais antikūnais, tuo tarpu iš dalies sutampa su keliais 2 klasės ir vienu 3 klasės antikūnais (pav. 3A). Analogiškai konkurencinis BLI tyrimas atskleidė, kad S451-1140 ir S728-1157 stipriai konkuravo tarpusavyje dėl prisijungimo prie smaigalio WT-6P, o S626-161 ne (papildomas paveikslas 3). Apskritai šie duomenys rodo, kad S451-1140 ir S728-1157 atpažįsta panašius epitopus, kurie skiriasi nuo S626-161.
3 pav. Plataus S728-1157 neutralizavimo mechanizmas
Antikūnas S728-1157 buvo užkoduotas IGHV3-66 ir turėjo trumpą komplementarumą lemiantį 3 regioną (CDR-H3). Visų pirma, mAb, kurie suriša RBS 1 surišimo režimu (ty RBS-A arba 1 klasės vieta), kurioms būdingi CC12.1, CC12.3, B38 ir C105 (13, 18, 23, 29, 38, 39), linkę naudoti IGHV3-53 arba 3-66 ir yra jautrūs LOJ mutacijoms (40). Tačiau S728-1157 CDR-H3 sritis labai skiriasi nuo kitų šios klasės antikūnų, o tai gali nulemti platesnį jo aktyvumą. Norėdami suprasti šio epitopo S728-1157 plačios neutralizacijos struktūrinį pagrindą, išsprendėme IgG S728-1157 krioelektroninės mikroskopijos (krio-EM) struktūrą (3B pav.) komplekse su smaigaliu WT{ {31}}P-Mut7, smaigalio WT-6P versija, turinti tarpprotomerų disulfidinę jungtį ties C705 ir C883, esant maždaug 3,3 Å pasaulinei skyrai (papildomas 4E paveikslas). Naudodami simetrijos išplėtimą, tikslinį klasifikavimą ir tobulinimo metodus, pasiekėme vietinę skiriamąją gebą UBD-Fv sąsajoje iki maždaug 4 Å (papildomas 4E paveikslas ir 8 papildoma lentelė). S728-1157 Fab kristalinė struktūra buvo nustatyta 3,1 Å skiriamąja geba ir naudojama atominiam modeliui sukurti RBD-Fv sąsajoje. Mūsų struktūros patvirtina, kad S728-1157 surišo RBS-A (arba 1 klasės) epitopą UBR konformacijoje (3B pav. ir 4E papildomas paveikslas), panašiai kaip kiti IGHV3-53/{{55} } antikūnų (3C pav.). Steerinis angiotenziną konvertuojančio fermento 2 (AKF2) surišimo vietos blokavimas S728-1157 paaiškina jo didelį neutralizavimo potencialą prieš SARS-CoV-2. 32NY33 motyvas ir 53SGGS56 motyvas (23) S728-1157 CDR-H1 ir -H2 sąveikauja su UBR beveik taip pat, kaip CC12.3 (4 papildomas paveikslas, B ir C). Tačiau, palyginti su VH 98DF99 CC12.3, VH 98DY99 S728-1157 CDR-H3 formuoja platesnę sąveiką, įskaitant hidrofobinę ir polinę sąveiką, su UBR, o tai gali lemti plačią LOJ neutralizaciją (pav. 3D ir 6 bei 7 papildomos lentelės). S728- 1157 CDR-H3 esantis diglicinas VH 100GG101 taip pat gali palengvinti platesnį surišimą, palyginti su VH Y100 CC12.3, greičiausiai dėl glicino liekanų lankstumo, dėl kurio CDR galiukas skiriasi. -H3 kilpa ir santykinis likučių poslinkis ties 98DY99.
cistanche tubulosa - stiprina imuninę sistemą
Spustelėkite čia norėdami pamatyti Cistanche Enhance Immunity produktus
【Klauskite daugiau】 El. paštas:cindy.xue@wecistanche.com / Whats App: 0086 18599088692 / Wechat: 18599088692
Nors Omicron LOJ turi daug mutacijų UBR, dauguma šių likučių nesąveikauja su S728-1157, nes vis tiek stebimas surišimas (papildomas 4A paveikslas). Numatoma, kad iš mūsų smaigalio WT-6P-Mut7 + Fab S728-1157 modelio Y505 iki VL Q31 ir E484 iki VH Y99 sudarys vandenilinius ryšius (papildomas 4D paveikslas ir 6 papildoma lentelė ), kuriuos gali sutrikdyti Omicron mutacijos Y505H ir E484A. Tačiau Y505H mutacija vis tiek leistų sukurti vandenilinį ryšį su VL Q31, o mutacija E484A pridėtų kitą hidrofobinę šoninę grandinę šalia hidrofobinių liekanų VL Y99, F456 ir Y489. Šie kontaktai iš dalies gali paaiškinti mechanizmą, leidžiantį S728-1157 išlaikyti neutralizuojantį aktyvumą, nors ir sumažintą, prieš smaigalį BA.1 antigeną (1G pav. ir 2B pav.). BA.1 antigenas, savo ruožtu, gali būti susijęs su Omicron mutacijomis, keičiančiomis smaigalio baltymo konformacinį kraštovaizdį (34). Tačiau kai kurios somatiškai mutavusios liekanos, ty VH L27, L28, R31, F58 ir VL V28 ir Q31, S728-1157 yra susijusios su sąveika su SARS-CoV-2 UBR (papildomas 1 paveikslas ir 7 papildoma lentelė), kuri taip pat gali prisidėti prie plataus jo reaktyvumo, palyginti su CC12.3. Apskritai, mūsų struktūriniai tyrimai atskleidė plataus S728-1157 neutralizavimo pagrindą, kuris gali prisitaikyti prie daugelio SARS-CoV-2 LOJ mutacijų.
4 pav. Apsauginis bnAb veiksmingumas nuo SARS-CoV-2 infekcijos žiurkėnams.
S728-1157 sumažina SARS-CoV-2 BA.1 Omicron, Delta ir WT SARS-CoV-2 replikaciją Sirijos žiurkėnuose. Norėdami įvertinti mūsų plačiai neutralizuojančių mAb apsauginį veiksmingumą, panaudojome auksinio Sirijos žiurkėno infekcijos modelį, kuris buvo plačiai naudojamas SARS-CoV{7}}. Žiurkėnai gavo 5 mg/kg mūsų tiriamųjų mAb arba izotipo kontrolę, nukreiptą į nesusijusį antigeną (ebolaviruso glikoproteiną), suleidžiant į pilvaplėvės ertmę praėjus 1 dienai po užsikrėtimo SARS CoV{10}} virusais. Plaučių ir nosies audiniai buvo surinkti praėjus 4 dienoms po užsikrėtimo (4A pav.). Terapinis S728-1157 skyrimas sumažino WT, BA.1 Omicron ir Delta variantų titrus užsikrėtusių žiurkėnų nosies turbinose ir plaučiuose (4 pav., B–D). S Priešingai nei neutralizavimas in vitro (1G pav.), S451-1140 nesumažino BA.1 Omicron viruso replikacijos plaučių ir nosies turbinose, o tai rodo, kad in vitro neutralizacija ir šio klono apsauga in vivo nutrūko (4E pav.) . Palyginimui, S626-161 vartojimas lėmė nežymiai reikšmingą plaučių viruso titrų sumažėjimą po WT ir BA.1 užkrėtimo (4 pav., F ir G). Šie duomenys pabrėžia, kad norint tiksliai apibrėžti plačiai apsauginius mAb, reikia įvertinti apsaugos veiksmingumą lygiagrečiai su neutralizavimo veikla. Žvelgiant į priekį, bus įdomu ištirti, kokiu mastu S728-1157 apsauginis pajėgumas priklauso nuo Fc. Apskritai S728-1157 yra daug žadantis mAb, turintis platų neutralizavimo veiksmingumą prieš SARS CoV-2 variantus, galinčius smarkiai sumažinti WT, Delta ir BA.1 replikaciją in vivo.
SARS-CoV-2 infekcija retai sukelia stiprių S728-1157 tipo kryžminių neutralizuojančių mAb. Atsižvelgdami į kryžminį S728-1157 neutralizavimą ir profilaktinį potencialą, siekėme įvertinti, ar S728–1157 tipo antikūnai dažnai sukelia polikloninį atsaką SARS-CoV-2 pacientams. Norėdami tai įvertinti, atlikome konkurencijos ELISA tyrimus, naudodami sveikstantį serumą, kad nustatytų anti-RBD antikūnų titrus, kurie galėtų konkuruoti dėl prisijungimo su S728-1157 (5A pav.). Tiriamieji buvo suskirstyti į 3 grupes pagal antikūnų atsakų dydį, kaip apibrėžta anksčiau (15, 16). Nors pacientams, kuriems buvo didelis ir vidutinis atsakas, S728-1157-konkuruojančių serumo antikūnų titrai buvo didesni, palyginti su mažais atsakais (5B pav.), titrai buvo gana žemi visose grupėse, o tai rodo, kad nedažnai gaunamas aukštas S{{ 18}} panašūs antikūnai polikloniniame serume po WT SARS-CoV-2 infekcijos. Be S728-1157, išbandėme sveikstančio serumo konkurenciją su kitais mAb, įskaitant S451- 1140, S626-161, LY-CoV555, REGN10933, CR3022 ir CC12.3. Panašiai kaip S728-1157, daugumos sveikstančių pacientų polikloniniame serume pastebėjome santykinai žemus antikūnų, konkuruojančių su S451-1140, S626-161, LY-CoV555, REGN10933 ir CC12.3 titrus. asmenų (5 pav., C–F ir H). Nepaisant to, pacientų, kuriems buvo didelis atsakas, titrai prieš tuos neutralizuojančius mAb buvo žymiai didesni, nei mažai reaguojančių (5 pav., B–F ir H). Priešingai, antikūnai, nukreipti į CR3022 epitopo vietą, buvo ryškesni sveikstantiems asmenims, o tai rodo, kad polikloniniame serume yra praturtėję 4 klasės RBD antikūnai (5G pav.). Pažymėtina, kad nebuvo reikšmingo CR3022 titrų skirtumo 3 grupėse, kuriems buvo atsakas, o tai rodo, kad daugumos asmenų WT SARS-CoV-2 infekcijos metu CR{45}}vietų antikūnai buvo nuolat indukuojami. Įdomu tai, kad, palyginti su CC12.3, S728-1157 buvo aptiktas 4-kartais mažesniu kiekiu pacientų, kuriems buvo didelis atsakas, serume. Taigi, nepaisant to, kad 1 klasės antikūnus dažnai sukelia natūrali infekcija ir vakcinacija (14, 20, 28, 29, 41–43), mūsų duomenys rodo, kad į S728–1157 panašūs antikūnai, kurie yra šios klasės pogrupis, yra palyginti reti.
Be to, mes ištyrėme reaktyvumo 2P ir 6P stabilizuoto smaigalio skirtumą mūsų sveikstančios kohortos serumuose (5 pav., I–K). Mes nustatėme, kad visose 3 atsakiusiųjų grupėse antikūnai prieš 6P stabilizuotą smaigalį WT buvo didesni nei 2P stabilizuoto smaigalio WT, 6–11 kartų (5J pav.), o tai rodo, kad pagrindiniai antigeniniai epitopai buvo geriau eksponuojami arba stabilizuojami ant 6P stabilizuoto antigeno. Naudojant tuos pačius mėginius, didelio ir vidutinio atsako asmenų antikūnų prieš BA titrai taip pat buvo mažesni.{17}}P nei BA.1-6P, 4–5 kartus (5K pav.). Pažymėtina, kad mažai reaguojančių asmenų prisijungimo reaktyvumo pokytis prieš BA.1 Omikrono-2P ir 6P šuolį buvo mažesnis (2-karto sumažėjimas), palyginti su WT-2P ir 6P smaigaliu ({ {28}}karto sumažėjimas) (5 paveikslas, J ir K), o tai rodo, kad serumo antikūnai prieš BA.1 omikronu reaguojančius epitopus gali būti labiau riboti pacientams, kuriems mažas atsakas. Apskritai šie duomenys rodo, kad natūralios infekcijos sukeltas geresnis polikloninis prisijungimas prie 6P stabilizuoto smaigalio tiek WT, tiek Omicron virusams.
Į S728–1157 panašūs antikūnai yra optimaliai indukuojami hibridinio imuniteto kontekste. Pirminė SARS-CoV-2 infekcija be vakcinacijos dabartinėmis pasaulinėmis sąlygomis tapo reta, o keli tyrimai parodė, kad SARS-CoV-2 imunitetas skiriasi tarp asmenų, turinčių specifinę vakcinacijos / infekcijos istoriją. Dėl to toliau siekėme ištirti, kurios bendros ekspozicijos, neskaitant vien tik WT infekcijos protėvių SARS-CoV-2, veiksmingai sukeltų į S728–1157 panašius antikūnus plazmoje iš monovalentinės mRNR vakcinos su ir be išankstinės vakcinacijos. infekcija. Gavome reikiamą biologinį mėginį iš apsaugos, susijusios su greitu imunitetu nuo SARS-CoV-2 (PARIS) tyrimo grupės, kuri išilgai stebėjo sveikatos priežiūros darbuotojus nuo pandemijos pradžios (44). Plazmos mėginius atrinkome iš visiškai imunizuotų (2 × vakcinuotų) tyrimo dalyvių su infekcija ir be jos, taip pat iš sustiprintų dalyvių (3 × vakcinuotų) su infekcija ir be jos. Be to, įtraukėme mėginius iš tyrimo dalyvių, kuriems buvo skirta dvivalentė mRNR vakcina (protėvių WA1/2020 ir Omicron BA.5) (6A pav. ir 2 papildoma lentelė). Proveržio dalyvių, kurie buvo paskiepyti revakcinacija, infekcijos įvyko tuo metu, kai Omicron giminės išstūmė visas kitas SARS-CoV{22}} linijas Niujorko metropolinėje zonoje. Mes nustatėme, kad dvigubai vakcinuoti asmenys turėjo mažiausią S728-1157 konkurencinių serumo antikūnų titrus iš 5 tirtų mėginių grupių (6B pav.). Pažymėtina, kad šie lygiai buvo panašūs į tuos, kurie buvo stebimi mūsų sveikstanti nevakcinuota kohorta (visi respondentai; 5B pav.). Palyginimui, asmenys, kuriems anksčiau buvo natūrali infekcija, įskaitant sveikstančius asmenis, kuriems buvo sušvirkštos 2 iš 3 vakcinos dozių, ir asmenis, kurie patyrė proveržio infekciją ir gavo dvivalentį revakcinaciją, S728-1157 sukėlė žymiai didesnį lygį, palyginti su neužkrėstais. bet paskiepytų asmenų (6B pav.). Nors neinfekuota 3-dozių grupė, palyginti su 2-dozės grupe, padidėjo tik nežymiai, suskirstymas pagal vakcinos tipą parodė, kad homologinės trečiosios BNT162b2 ir mRNR-1273 dozės žymiai padidino S{{ 38}}, pavyzdžiui, neutralizuojančių antikūnų titrus atitinkamai 2,72 × ir 2,85 × (6 pav., C ir D). Pažymėtina, kad tarp dalyvių, kurie iš viso patyrė 3 kontaktus su šuoliu bet kokiomis priemonėmis, S728-1157-panašių antikūnų titrai sveikstančių dvigubai vakcinuotų asmenų buvo 3 kartus didesni, palyginti su infekcijomis neskiepytomis trigubomis vakcinomis, o tai rodo, kad SARS-CoV{{ 51}} infekcija optimaliau sukelia šį klonotipą. Tarp hibridinio imuniteto grupių pastebėjome, kad daugumos sustiprintų asmenų, kuriems buvo proveržis, ir kurie gavo dvivalentės revakcinacijos dozę, S728-1157 antikūnų titras buvo tik nežymiai didesnis, palyginti su grupėmis, kurios buvo paskiepytos prieš mikroroną, o tai rodo, kad S{53 }} titras greičiausiai artėjo prie plokščiakalnio po 3 ekspozicijų. Taip pat ištyrėme polikloninių antikūnų, konkuruojančių su CC12.3 ir CR3022, be S728-1157, titrus. Visi asmenys pasižymėjo palyginti aukštais CC12.3- ir CR3022-panašių antikūnų titrais, nepriklausomai nuo ekspozicijų skaičiaus ir tipo (5 papildomas paveikslas), priešingai nei stebėjome S728-1157- kaip antikūnai. Apskritai šie duomenys rodo, kad SARS-CoV-2 infekcija ir mRNR vakcinacija prisideda prie S728-1157-panašių antikūnų indukcijos, o infekcija vaidina didesnį vaidmenį vakcinuotų asmenų organizme.
cistanche tubulosa - stiprina imuninę sistemą
Galiausiai, lygindami atsakus prieš 2P ir 6P stabilizuotą smaigalį mRNR vakcinacijos grupėje, mes nustatėme, kad dauguma grupių sukėlė panašų antikūnų kiekį prieš abi konstrukcijas. Išimtis buvo neinfekuota trigubai vakcinuota grupė, kuri statistiškai parodė didesnį, nors ir tik šiek tiek padidėjusį reaktyvumą 2P, palyginti su 6P stabilizuotu smaigaliu (6E pav.). Šie duomenys rodo, kad priešingai nei natūrali infekcija (5 pav., J ir K), vien tik vakcinacija sukelia polikloninį atsaką, kuris labiau apsiriboja Spike{11}}P konstrukto epitopais, kaip ir Spike{12 }}P dabartinių vakcinų formulė. Galiausiai šios išvados patvirtina mintį, kad būsimų SARS-CoV-2 vakcinų stabilizavimas 6P gali būti labai naudingas skatinant plačiai apsaugoti antikūnų klonotipus, tokius kaip S728-1157.
5 pav. Gydomųjų serumo antikūnų konkurencija su plačiai neutralizuojančiais RBD reaktyviais mAb ir serumo antikūnų atsako palyginimas su 6P ir 2P stabilizuotais šuoliais
6 pav. mRNR vakcinuotų serumo antikūnų konkurencija su S728-1157 neutralizuojančiais RBD reaktyviais mAb ir serumo antikūnų atsako palyginimas su 6P ir 2P stabilizuotais šuoliais.
Diskusija
Šiame tyrime mes nustatome stiprų bnAb, išskirtą iš asmens, kuris pasveiko nuo SARS-CoV-2 infekcijos per pradinę COVID-19 pandemijos bangą, atminties B ląstelės. Šis bnAb, S728- 1157, išlaikė didelį prisijungimo reaktyvumą ir nuoseklų neutralizuojantį aktyvumą prieš visus ištirtus SARS-CoV-2 LOJ, įskaitant Omicron BA.1, BA.2, BA.2.75, BL.1 ( BA.2.{12}}R346T), BA.4, BA.5 ir XBB, ir sugebėjo iš esmės sumažinti infekcinių virusų titrus po Delta ir BA.1 infekcijos žiurkėnams.
Mes nustatėme, kad sveikstančiame serume iš mūsų kohortos buvo nedidelė antikūnų, konkuruojančių su S728-1157 (1 klasės/RBS-A antikūnu) ir 2 klasės epitopų mAb, koncentracija. Tai rodo, kad S728-1157 yra šiek tiek unikalus, palyginti su kitais antikūnais, nukreiptais į 1 klasės epitopus, ir yra retai indukuojamas UBR specifiniame atminties B ląstelių telkinyje. Vietoj to, mūsų natūralios infekcijos grupė sukėlė antikūnus, nukreiptus į CR3022 (4 klasės) epitopą; tokio specifiškumo antikūnai dažnai yra kryžmiškai reaguojantys, bet mažiau neutralizuojantys nei į RBS nukreipti antikūnai (14, 17). Šie duomenys papildo mūsų ankstesnius duomenis, rodančius, kad 3/S309 klasės antikūnų gausa sveikstančiame serume gali prisidėti prie neutralizuojančio aktyvumo prieš alfa ir gama variantus, o 2 klasės antikūnų trūkumas gali lemti sumažėjusią neutralizavimo galimybę prieš Delta (15). . Nepaisant to, pranešama, kad daugumos šių į RBS nukreiptų antikūnų (RBS-A / 1 klasė, RBS-B, C / 2 klasė ir RBS-D, S309 / 3 klasė) aktyvumas prieš Omicron variantus yra labai ribotas. (11, 40, 45).
Pagrindinis iššūkis ateityje bus nustatyti, kaip pagerinti plačiai kryžmiškai reaguojančių antikūnų prieš konservuotus RBS epitopus atsiradimą. Šiuo atžvilgiu pastebėjome, kad hibridinį imunitetą turintys asmenys padidino S728-1157-panašių antikūnų titrus nei paskiepyti asmenys, anksčiau neužsikrėtę. Svarbu tai, kad šis reiškinys buvo pastebėtas net tada, kai buvo kontroliuojamas ekspozicijų skaičius (ty sveikstantiems dvigubai vakcinuotiems, palyginti su neužkrėstais trigubais vakcinuotais), o tai rodo, kad tam tikras su infekcija susijusio imuniteto elementas (arba vakcinos formulė, galinti imituoti tokio tipo imunitetą) yra svarbus šio klonotipo atsiradimui. Tai atitinka eksperimentinius įrodymus, patvirtinančius, kad hibridinį imunitetą turintys asmenys turi platesnį antikūnų reaktyvumo profilį, palyginti su tais, kurie turi tik vakcinacijos sukeltą arba pirminės infekcijos sukeltą imuninį atsaką (9).
Čia pateiktos struktūros iliustruoja, kad S728-1157 surišo RBS-A/1 klasės epitopą aukštesnės konformacijos UBR. Atrodo, kad šis epitopas lengviau pasiekiamas ant 6P stabilizuotų smaigalių, kurie, kaip pranešama, turi 2 UBR viršutinėje valstijoje, palyginti su 2P smaigaliais, kuriuose yra tik 1 (30, 33, 46, 47) ir prieš kuriuos mūsų antikūnai. būdingas aukštesnės konformacijos smaigalys, rodo patobulintą surišimą. S728-1157 buvo išskirtas po natūralios infekcijos; tokiais atvejais tikimybė, kad S728-1157 tipo klonai bus sukelti, yra didesnė, atsižvelgiant į tai, kad UBR turi sugebėti priimti aukštesnę konformaciją, net ir laikinai, prisijungti prie ACE2 ir taip atskleisti šį epitopą. Skirtingai nuo daugumos IGHV3-53/3-66 RBS-A/1 klasės antikūnų, S728-1157 gali prisitaikyti prie pagrindinių mutacijų LOJ šuoliais, naudojant plačią sąveiką tarp CDR-H3 ir UBR (29, 48–50). S728-1157 taip pat naudoja skirtingą lengvąją grandinę (IGLV3-9), palyginti su kitais ne tokiais plačiais antikūnais, kaip CC12.3 (IGKV3-20), o tai gali turėti įtakos bendrai surišimo sąveikai; tačiau mūsų analizė rodo, kad vandenilinis ryšys tarp S728-1157 lengvosios grandinės ir UBR yra mažesnis, palyginti su CC12.3 (7 papildoma lentelė). Nors dauguma CDR-H3 kontaktinių likučių, svarbių LOJ kryžminiam reaktyvumui šioje sąveikoje, yra užkoduotos gemalo linijos ir neįvedamos somatinių mutacijų, kelios somatiškai mutavusios liekanos karkaso regionuose arba CDR-H1, CDR-H2 ir CDR-L1 yra dalyvauja sąveikoje su SARS-CoV{47}} UBR. Viena vertus, tai rodo, kad atminties B ląstelės, koduojančios IGHV3-53/66 klasės antikūnus, gali įgyti panašų kryžminio reaktyvumo laipsnį, bręsdamos afinitetu. Kita vertus, tai taip pat rodo galimybę sukurti į lytinius santykius nukreiptus imunogenus, nukreiptus į S{52}}kaip naivias B ląsteles. Nors gali būti sudėtinga sukurti vakcinas, kurios galėtų išskirti į S728-1157 panašius antikūnus su atrinktais CDR-H3, galinčiais įveikti LOJ mutacijas, tai, kad IGHV geno apribojimas stebimas ir kitose stipriose SARS-CoV{ {58}} neutralizuojančių mAb tyrimai (13, 15, 20–27). Arba tai taip pat gali būti įmanoma atliekant pakartotinę imunizaciją optimizuotais UBR imunogenais, kaip anksčiau buvo pranešta apie kitus patogenus (51–55).
Nors RBS-A/ 1 klasės antigeninėje vietoje buvo pastebėta daug mutacijų (18), atsižvelgiant į S728-1157 epitopą, 13 iš 15 visų UBR kontaktinių liekanų ir 2 iš 3 CDR-H{{9} }Surišti UBR kontaktiniai likučiai yra išsaugoti Omicron ir visuose kituose LOJ. Tai rodo, kad UBR regione, kuriame randamas S728-1157 epitopas, gali būti likučių, būtinų jo dinaminei funkcijai ir viruso tinkamumui, todėl ji būtų mažiau tolerantiška mutacijoms ir antigeniniam dreifui nei aplinkinės RBS-A/ 1 klasės vietos liekanos. Tokiu atveju turėtų būti sumažinta tendencija, kad šis konkretus epitopas išnyks, kai vystosi viruso variantai, todėl S728-1157 ir panašių antikūnų bei epitopų apibūdinimas yra svarbus variantams atsparioms vakcinoms arba mAb terapiniam vystymuisi. Apibendrinant galima pasakyti, kad mūsų tyrime nustatyti bnAb, kurie gali padėti sukurti naujos kartos variantams atsparių koronaviruso vakcinų imunogeną arba naudoti kaip mAb terapijos preparatai, atsparūs SARS CoV-2 evoliucijai. Visų pirma, pagal bendrą stiprumą ir plotį S728-1157 yra geriausias iki šiol išskirtas antikūnas klasėje. Atsižvelgiant į tai, kad šis antikūnas lengviau jungiasi su 6P stabilizavimu, manoma, kad jį pirmiausia sukels 6P stabilizuoti rekombinantiniai smaigalio baltymai arba visas virusas, o tai rodo, kad heksaprolino modifikavimas galėtų būti naudingas būsimoms vakcinos konstrukcijoms, siekiant optimaliai apsaugoti nuo būsimos SARS-CoV. -2 variantai ir kiti arbovirusai.
cistanche tubulosa - stiprina imuninę sistemą
Metodai
Monokloninių antikūnų išskyrimas. PBMC buvo išskirti iš leukoredukcijos filtrų ir užšaldyti, kaip aprašyta anksčiau (24). B ląstelės buvo praturtintos iš PBMC per FACS. Ląstelės buvo nudažytos CD19, CD3 ir antigeno zondais, konjuguotais su oligofluoroforu; dominančios ląstelės buvo identifikuotos kaip CD3–CD19+ antigenas+. Visi mAb buvo sukurti iš oligožymėmis pažymėtų, antigenais surūšiuotų ląstelių, identifikuotų per vienos ląstelės RNR-Seq, kaip aprašyta anksčiau (15, 24). Šiame tyrime sugeneruoti vienos B ląstelės duomenys buvo perkelti į Gene Expression Omnibus: GSE171703 ir GSM5231088 – GSM5231123.
Antigenui specifinės B ląstelės buvo parinktos mAb generuoti pagal antigeno zondo intensyvumą, analizuotą JMP Pro 15. Antikūnų sunkiosios ir lengvosios grandinės genai buvo susintetinti naudojant Integrated DNA Technologies (IDT) ir klonuoti į žmogaus IgG1 ir žmogaus κ arba λ lengvąją grandinę. ekspresijos vektoriai naudojant Gibsono surinkimą, kaip aprašyta anksčiau (56). Atitinkamo mAb sunkiosios ir lengvosios grandinės buvo laikinai kotransfekuotos į HEK293T ląsteles (ATCC). Po 18 valandų transfekcijos, transfekuotos ląstelės buvo papildytos baltymų neturinčiu hibridomos terpės supernatantu (PFHM-II, Gibco). Supernatantas, turintis išskirtą mAb, buvo paimtas 4 dieną ir išgrynintas naudojant baltymo A-agarozės granules (Thermo Fisher Scientific), kaip aprašyta anksčiau (56). Gerai apibūdintų antikūnų sunkiųjų ir lengvųjų grandinių sekos buvo gautos iš baltymų duomenų banko (PDB), LY-CoV555 (PDB ID: 7KMG), CR3022 (PDB ID: 6W7Y) ir REGN1{{ 125}}933 (PDB ID: 6XDG) ir buvo susintetinti, kaip aprašyta aukščiau. CC12.3 mAb (PDB ID: 6XC4) pateikė Meng Yuan iš Scripps tyrimų instituto (San Diegas, Kalifornija, JAV). Rekombinantinio smaigalio baltymo ekspresija. Rekombinantinis D614G SARS-CoV-2 viso ilgio (FL) smaigalys, BA.2-6P, BA.4/5-6P, BQ.1-6P, BQ. 1.1-6P, XBB-6P, WT UBR, pavieniai RBD mutantai (R346S, K417N, K417T, G446V, L452R, S477N, F486A, F486Y, N487Q, Y489F, Q493N, 5 Y505A ir Y505F), kombinuotas UBD mutantas (K417N/E484K/L452R/NN501Y), SARS-CoV-1 UBR ir MERS-CoV UBR buvo sukurtas įmonės viduje. Trumpai tariant, rekombinantiniai antigenai buvo išreikšti naudojant Expi293F ląsteles (Thermo Fisher Scientific). Dominantis genas buvo klonuotas į žinduolių ekspresijos vektorių (vidinis modifikuotas AbVec) ir transfekuotas naudojant ExpiFectamin 293 rinkinį (Thermo Fisher Scientific) pagal gamintojo protokolą. Supernatantas buvo paimtas 4 dieną po transfekcijos ir inkubuojamas su Ni-nitrilotriacto rūgšties (Ni-NTA) agaroze (Qiagen). Valymas buvo atliktas naudojant gravitacijos srauto kolonėlę ir eliuuojamas imidazolo turinčiu buferiu, kaip aprašyta anksčiau (57, 58). Eliuatas buvo buferinis ir pakeistas PBS naudojant Amicon centrifugal unit (Millipore). Rekombinantiniai FL šuoliai, stabilizuoti B.1.1.7 Alfa, B.1.351 Beta, P.1 Gamma, B.1.617.2 Delta, BA.1, BA.2 ir BA.4 Omicron variantų 2P mutacijomis ir buvo pagamintas Sietlo laboratorijoje Sietlo vaikų tyrimų institute. K417V, N439K ir E484K UBR ir rekombinantiniai FL smaigaliai WT-2P ir 6P buvo pagaminti Krammer laboratorijoje Icahn medicinos mokykloje Sinajaus kalne. SARS-CoV-2-6P-Mut7 ir smaigalys BA.{91}}P buvo sukurti ir pagaminti taip, kaip aprašyta ankstesniame tyrime (59). Kiekvieno antigeno baltymų sekos ir ištekliai yra išvardyti 4 papildomoje lentelėje. ELISA. Rekombinantiniai SARS-CoV-2 smaigalys / RBD baltymai buvo padengti ant daug baltymų surišančių mikrotitravimo plokštelių (Costar) 2 ug/ml PBS, esant 50 μL/šuliniui, ir laikomi per naktį 4 laipsnių temperatūroje. Plokštelės buvo plaunamos PBS, turinčiu 0, 05% Tween 20 (PBS-T), ir blokuojamos 150 μL PBS, turinčiu 20% FBS, 1 valandą 37 laipsnių temperatūroje. Monokloniniai antikūnai buvo serijiniu būdu skiedžiami 3-kartu, pradedant nuo 10 ug/mL PBS ir inkubuojami šuliniuose 1 valandą 37 laipsnių temperatūroje. Tada plokštelės buvo plaunamos ir inkubuojamos su HRP konjuguotu ožkos antikūnu prieš žmogaus IgG (Jackson ImmunoResearch; 109- 035-098), 1:1, 000) 1 valandą 37 laipsnių temperatūroje. Po plovimo į kiekvieną duobutę buvo pridėta 100 μl Super AquaBlue ELISA substrato (eBioscience). Absorbcija buvo matuojama esant 405 nm mikroplokštelės spektrofotometru (Bio-Rad). Tyrimai buvo standartizuoti naudojant kontrolinį antikūną S144-509 (15), su žinomomis rišimosi charakteristikomis kiekvienoje plokštelėje, ir plokštelės buvo vystomos tol, kol kontrolinės medžiagos absorbcija pasiekė 3,0 OD. Visi mAb buvo išbandyti dviem egzemplioriais ir kiekvienas eksperimentas buvo atliktas du kartus.
Serumo ELISA. Daug baltymų surišančios mikrotitro plokštelės buvo padengtos rekombinantiniais SARS-CoV-2 smaigalių antigenais 2 ug/ml PBS per naktį 4 laipsnių temperatūroje. Lėkštelės buvo plaunamos PBS 0.05 % Tween ir užblokuotos 200 μL PBS 0,1 % Tween + 3 % nugriebto pieno miltelių 1 valandą kambario temperatūroje (RT). Prieš atliekant serologinį eksperimentą, plazmos mėginiai buvo termiškai inaktyvuoti 1 valandą 56 laipsnių temperatūroje. Plazma buvo serijiniu būdu skiedžiama 2-kartą PBS 0,1 % Tween + 1 % lieso pieno milteliais. Plokštelės buvo inkubuojamos su serumo praskiedimais 2 valandas kambario temperatūroje. Antikūnų prisijungimui nustatyti buvo naudojamas HRP konjuguotas ožkos anti-žmogaus Ig antrinis antikūnas, praskiestas santykiu 1:3, 000 su PBS 0,1 % Tween + 1 % lieso pieno milteliais. Po 1 valandos inkubacijos plokštelės buvo sukurtos 100 μL SigmaFast OPD tirpalu (Sigma-Aldrich) 10 minučių. Tada vystymosi reakcijai sustabdyti buvo panaudota 50 μL 3M HCl. Absorbcija buvo matuojama esant 490 nm mikroplokštelės spektrofotometru (Bio-Rad). Galutinių taškų titrai buvo ekstrapoliuoti iš kiekvieno mėginio sigmoidinės 4PL (kur x yra log koncentracija) standartinės kreivės. Aptikimo riba (LOD) apibrėžiama kaip vidutinis + 3 OD signalo SD, įrašytas naudojant plazmą iš asmenų, prieš SARS-CoV-2. Visi skaičiavimai buvo atlikti GraphPad Prism programine įranga (9.0 versija).
Varžybų ELISA. Norint nustatyti su UBD reaguojančių mAb tikslinę epitopų klasifikaciją, konkurencijos ELISA buvo atlikti naudojant kitus mAb, turinčius žinomų epitopų surišimo charakteristikas kaip konkurentų mAb. Konkurentų mAb buvo biotinilinti naudojant EZ-Link sulfo-NHS-biotiną (Thermo Fisher Scientific) 2 valandas kambario temperatūroje. Biotinilinto mAb biotino perteklius buvo pašalintas naudojant 7k molekulinės masės ribą (MWCO) Zeba sukimosi druskų šalinimo kolonėles (Thermo Fisher Scientific). Plokštelės buvo padengtos 2 ug/mL RBD antigenu per naktį 4 laipsnių temperatūroje. Plokštelės buvo blokuojamos PBS-20% FBS 2 valandoms kambario temperatūroje ir buvo pridėta 2-karto praskiedimo nenustatytos klasės arba serumo mAb, pradedant nuo 20 ug/mL mAb ir serumo praskiedimas santykiu 1:10. Po antikūnų inkubacijos 2 valandas kambario temperatūroje, buvo pridėta biotinilinto konkurento mAb, kurios koncentracija buvo dvigubai didesnė už jo disociacijos konstantą (KD), ir inkubuojama dar 2 valandas kambario temperatūroje kartu su mAb arba serumu, kuris buvo pridėtas anksčiau. Plokštelės buvo plaunamos ir inkubuojamos su 100 μL HRP konjuguotu streptavidinu (Southern Biotech), praskiedus 1:1, 000 1 valandą 37 laipsnių temperatūroje. Plokštelės buvo sukurtos naudojant Super AquaBlue ELISA substratą (eBioscience). Norint normalizuoti tyrimus, konkuruojantis biotinilintas mAb buvo pridėtas į duobutę be jokių konkuruojančių mAb ar serumo kaip kontrolė. Duomenys buvo užfiksuoti, kai kontrolinio šulinio absorbcija pasiekė 1,0–1,5 OD. Konkurencijos procentas tarp mAb buvo apskaičiuotas padalijus mėginio stebimą OD iš teigiamos kontrolės pasiekto OD, atėmus šią vertę iš 1 ir padauginus iš 100. Serumo OD buvo transformuojami log10 ir analizuojami netiesine regresija, siekiant nustatyti 50 % slopinimo koncentracijos (IC50) vertės naudojant GraphPad Prism programinę įrangą (9.0 versija). Duomenys buvo transformuoti į Log1P ir nubraižyti į grafiką, atspindintį abipusį serumo praskiedimo serumo praskiedimo IC50, kuris gali pasiekti 50 % konkurenciją su dominančiu konkurentu mAb. Visi mAb buvo išbandyti dviem egzemplioriais, kiekvienas eksperimentas buvo atliktas 2 kartus nepriklausomai, o vertės iš 2 nepriklausomų eksperimentų buvo suvidurkintos.
Plokštelių tyrimai. Apnašų tyrimai buvo atlikti su SARS-CoV-2 varianto virusais Vero E6/TMPRSS2 ląstelėse (Japonijos tyrimų bioresursų kolekcija (JCRB)) (5 papildoma lentelė). Ląstelės buvo kultivuojamos, kad būtų pasiektas 90% susiliejimas, prieš jas tripsinizuojant ir sėjamos 3 × 104 ląstelių/šulinėlio tankiu į 96-šulinėlių plokšteles. Kitą dieną 102 PFU SARS-CoV{11}} varianto buvo inkubuojami su 2-kartu praskiestomis mAb 1 valandą. Antikūnų ir virusų mišinys buvo inkubuojamas su Vero E6 / TMPRSS2 ląstelėmis 3 dienas 37 laipsnių temperatūroje. Plokštelės buvo fiksuotos 20% metanoliu ir nudažytos krištolo violetiniu tirpalu. Visiškos slopinančios koncentracijos (IC99) buvo apskaičiuotos naudojant log (inhibitorių) ir normalizuotą atsaką (kintamas nuolydis), atliktas GraphPad Prism (9.0 versija). Visi mAb buvo išbandyti dviem egzemplioriais ir kiekvienas eksperimentas buvo atliktas du kartus. Židinio mažinimo neutralizavimo testas. Židinio mažinimo neutralizacijos testai (FRNT) buvo naudojami neutralizavimo veiklai nustatyti kaip papildoma platforma, be apnašų tyrimo. Serumo praskiedimai, pradedant nuo galutinės koncentracijos 1:20, buvo sumaišyti su 103 židinį formuojančiais viruso vienetais vienoje duobutėje ir inkubuojami 1 valandą 37 laipsnių temperatūroje. Suvestas priešpandeminis serumo mėginys buvo kontrolė. Antikūnų ir virusų mišinys buvo inokuliuotas į Vero E6/TMPRSS2 ląsteles (JCRB) 96-šulinėlių plokštelėse ir 1 valandą inkubuojamas 37 laipsnių temperatūroje. Į kiekvieną duobutę buvo įpiltas vienodas tūris metilceliuliozės tirpalo. Ląstelės buvo inkubuojamos 16 valandų 37 laipsnių temperatūroje, o po to fiksuojamos formalinu. Pašalinus formaliną, ląstelės buvo imuniniu būdu nudažytos pelės mAb prieš SARS-CoV-1/2 nukleoproteiną [klonas 1C7C7 (Sigma-Aldrich)], po to HRP pažymėtu ožkos antipelės imunoglobulinu (Sigma- Aldrichas; A8924). Užkrėstos ląstelės buvo nudažytos TrueBlue substratu (SeraCare Life Sciences) ir po to plaunamos distiliuotu vandeniu. Po džiovinimo židinio skaičiai buvo kiekybiškai įvertinti naudojant ImmunoSpot S6 Analyzer, ImmunoCapture programinę įrangą ir BioSpot programinę įrangą (Cellular Technology). IC50 buvo apskaičiuotas pagal interpoliuotą reikšmę iš log (inhibitoriaus) ir normalizuoto atsako, naudojant kintamo nuolydžio (4 parametrų) netiesinę regresiją, atliktą GraphPad Prism (9.0 versija).
Nuorodos
1. Hou YJ ir kt. SARS-CoV-2 D614G variantas pasižymi efektyviu replikavimu ex vivo ir perduodamu in vivo. Mokslas. 2020;370(6523):1464–1468.
2. Garcia-Beltran WF ir kt. Keli SARS CoV-2 variantai išvengia neutralizavimo vakcinos sukelto humoralinio imuniteto. Ląstelė. 2021;184(9):2523.
3. Siena EC ir kt. Neutralizuojantis antikūnų aktyvumą prieš SARS-CoV-2 LOJ B.1.617.2 ir B.1.351 vakcinuojant BNT162b2. Lancetas. 2021;397(10292):2331–2333.
4. Edara VV ir kt. Infekcija ir vakcinos sukeltas neutralizuojančių antikūnų atsakas į SARS-CoV-2 B.1.617 variantus. N Engl J Med. 2021;385(7):664–666.
5. Zhou D ir kt. Įrodymai, kad SARS-CoV-2 variantas B.1.351 ištrūko iš natūralių ir vakcinų sukeltų serumų. Ląstelė. 2021;184(9):2348–2361.
6. Weisblum Y ir kt. Pabėkite nuo SARS-CoV-2 smailių baltymų variantų neutralizuojančių antikūnų. Elife. 2020;9:e61312.
7. Graham F. Kasdienis instruktažas: Omicron koronaviruso variantas mokslininkus įspėja. Gamta. 2021 m.;.
8. Karim SSA, Karim QA. Omicron SARS-CoV-2 variantas: naujas COVID-19 pandemijos skyrius. Lancetas. 2021;398(10317):2126–2128.
9. Carreño JM ir kt. Gydomojo ir vakcinos serumo aktyvumas prieš SARS-CoV-2 Omicron. Gamta. 2021;602(7898):682–688.
10. Wang Q ir kt. Nerimą keliančios didėjančių SARS-CoV-2 BQ ir XBB subvariantų antikūnų vengimo savybės. Ląstelė. 2022;186(2):279–286.
11. VanBlargan LA ir kt. Infekcinis SARS-CoV-2 B.1.1.529 Omicron virusas išvengia neutralizavimo terapiniais monokloniniais antikūnais. Nat Med. 2022;28(3):490–495.
12. Takashita E ir kt. Antikūnų ir antivirusinių vaistų nuo Covid-19 Omicron Variant veiksmingumas. N Engl J Med. 2022;386(10):995–998.
13. Yuan M ir kt. SARS-CoV-2 receptorių surišimo domeno atpažinimas neutralizuojant antikūnus. Biochem Biophys Res Commun. 2021;538:192–203.
14. Barnes CO ir kt. SARS-CoV-2 neutralizuojančios antikūnų struktūros informuoja apie gydymo strategijas. Gamta. 2020;588(7839):682–687.
15. Changrob S ir kt. Susirūpinimą keliančių naujų SARS-CoV-2 variantų kryžminis neutralizavimas antikūnais, nukreiptais į skirtingus smaigalio epitopus. Mbio. 2021;12(6):e0297521.
16. Guthmiller JJ ir kt. SARS-CoV-2 infekcijos sunkumas yra susijęs su geresniu humoraliniu imunitetu prieš smaigalį. Mbio. 2021;12(1):e02940–20.
17. Greaney AJ ir kt. Mutacijų susiejimas su SARS-CoV-2 UBR, kurios išvengia skirtingų antikūnų klasių prisijungimo. Nat Commun. 2021;12(1):4196.
18. Liu H, Wilson IA. Apsauginiai neutralizuojantys epitopai sergant SARS-CoV-2. Immunol Rev. 2022;310(1):76–92.
19. Jette CA ir kt. Platus kryžminis arbovirusų reaktyvumas, kurį rodo COVID{2}} donorų gautų neutralizuojančių antikūnų pogrupis. Cell Rep. 2021;36(13):109760.
20. Brouwer PJM ir kt. Stiprūs neutralizuojantys antikūnai iš COVID{1}} pacientų apibrėžia kelis pažeidžiamumo objektus. Mokslas. 2020;369(6504):643–650.
21. Pinto D ir kt. Kryžminis SARS CoV-2 neutralizavimas žmogaus monokloniniu SARS-CoV antikūnu. Gamta. 2020;583(7815):290–295.
22. Robbiani DF ir kt. Konvergencinis antikūnų atsakas į SARS-CoV-2 sveikstantiems asmenims. Gamta. 2020;584(7821):437–442.
23. Yuan M ir kt. Bendro antikūnų atsako į SARS-CoV struktūrinis pagrindas-2. Mokslas. 2020;369(6507):1119–1123.
24. Dugan HL ir kt. Profiliuojant B ląstelių imunodominavimą po SARS-CoV-2 infekcijos, atskleidžiama antikūnų evoliucija prieš neneutralizuojančius viruso taikinius. Imunitetas. 2021;54(6):1290–1303.
25. Rogers TF ir kt. Stiprių SARS CoV-2 neutralizuojančių antikūnų išskyrimas ir apsauga nuo ligų naudojant mažų gyvūnų modelį. Mokslas. 2020;369(6506):956–963.
26. Schmitz AJ ir kt. Vakcinos sukeltas viešasis antikūnas apsaugo nuo SARS-CoV-2 ir naujų variantų. Imunitetas. 2021;54(9):2159–2166.e6.
27. Shi R ir kt. Žmogaus neutralizuojantis antikūnas yra nukreiptas į SARS-CoV-2 receptorių surišimo vietą. Gamta. 2020;584(7819):120–124.
28. Cao Y ir kt. Stiprūs neutralizuojantys antikūnai prieš SARS-CoV-2, nustatyti atliekant didelio našumo vienos ląstelės sveikstančių pacientų B ląstelių seką. Ląstelė. 2020;182(1):73–84.
29. Barnes CO ir kt. Žmogaus antikūnų, susietų su SARS-CoV-2 smaigaliu, struktūros atskleidžia bendrus epitopus ir pasikartojančius antikūnų požymius. Ląstelė. 2020;182(4):828–842.
30. Corbett KS ir kt. SARS-CoV-2 mRNR vakcinos dizainas, kurį įgalino prototipo paruošimas patogenams. Gamta. 2020;586(7830):567–571.
31. Amanat F ir kt. Dviejų prolinų įvedimas ir daugiabazio skilimo vietos pašalinimas padidino rekombinantinės smaigalio pagrindu pagamintos SARS-CoV-2 vakcinos veiksmingumą pelės modelyje. mBio. 2021;12(2):e02648–20.
32. Sun W ir kt. Niukaslio ligos virusas, ekspresuojantis stabilizuotą SARS-CoV-2 smaigalio baltymą, sukelia apsauginį imuninį atsaką. Nat Commun. 2021;12(1):6197.
33. Hsieh CL ir kt. Struktūra pagrįsta prefuzija stabilizuotų SARS-CoV-2 spyglių dizainas. Mokslas. 2020;369(6510):1501–1505.
34. Gobeil SM ir kt. SARS-CoV-2 Omikroninio smaigalio struktūrinė įvairovė. Mol Cell. 2022;82(11):2050–2068.
35. Yuan M ir kt. Labai konservuotas slaptas epitopas SARS-CoV-2 ir SARS-CoV receptorių surišimo domenuose. Mokslas. 2020;368(6491):630–633.
36. Starr TN ir kt. Visas SARS-CoV-2 UBR mutacijų, kurios išvengia monokloninio antikūno LY-CoV555 ir jo kokteilio su LY-CoV016, žemėlapis. Cell Rep Med. 2021;2(4):100255.
37. Baum A ir kt. REGN-COV2 antikūnai užkerta kelią SARS-CoV-2 infekcijai rezus makakos ir žiurkėnuose ir ją gydo. Mokslas. 2020;370(6520):1110–1115.
38. Wu NC ir kt. Alternatyvus IGHV3-53 antikūnų prisijungimo prie SARS-CoV-2 receptorių prisijungimo domeno būdas. Cell Rep. 2020;33(3):108274.
39. Wu Y ir kt. Nekonkuruojanti žmogaus neutralizuojančių antikūnų pora blokuoja COVID-19 viruso prisijungimą prie jo receptoriaus ACE2. Mokslas. 2020;368(6496):1274–1278.
40. Yuan M ir kt. Naujausių SARS-CoV-2 variantų antigeninio dreifo struktūriniai ir funkciniai padariniai. Mokslas. 2021;373(6556):818–823.
41. Yan Q ir kt. Germline IGHV3-53-užkoduotų UBR neutralizuojančių antikūnų dažnai yra COVID-19 pacientų antikūnų repertuare. Užkrečiami atsirandantys mikrobai. 2021;10(1):1097–1111.
42. Zhang Q ir kt. Stiprūs ir apsaugantys IGHV3- 53/3-66 viešieji antikūnai ir jų bendras pabėgimo mutantas ant SARS-CoV-2 smaigalio. Nat Commun. 2021;12(1):4210.
43. Wang Z ir kt. mRNR vakcinos sukelti antikūnai prieš SARS-CoV-2 ir cirkuliuojančius variantus. Gamta. 2021;592(7855):616–622.
44. Simonas V ir kt. PARYŽYS ir SPARTA: SARS-CoV Achilo kulno radimas-2. mSphere. 2022;7(3):e0017922.
45. Starr TN ir kt. SARS-CoV-2 UBR antikūnai, kurie padidina plotį ir atsparumą pabėgimui. Gamta. 2021;597(7874):97–102.
46. Sienos AC ir kt. SARS-CoV-2 smaigalio glikoproteino struktūra, funkcija ir antigeniškumas. Ląstelė. 2020;181(2):281–292.
47. Henderson R ir kt. Kontroliuoti SARS-CoV-2 smaigalio glikoproteino konformaciją. Nat Struct Mol Biol. 2020;27(10):925–933.
48. Shrestha LB ir kt. Plačiai neutralizuojantys antikūnai prieš naujus SARS-CoV-2 variantus. Priekinis imunolis. 2021;12:752003.
49. Greaney AJ ir kt. Antikūnai, sukurti po vakcinacijos mRNR{1}}, prie receptorių prisijungimo domeno jungiasi plačiau nei nuo SARS-CoV-2 infekcijos. Sci Transl Med. 2021;13(600):eabi9915.
50. Reincke SM ir kt. SARS-CoV-2 Beta varianto infekcija sukelia stiprius specifinius ir kryžmiškai reaguojančius antikūnus. Mokslas. 2022;375(6582):782–787.
51. Wrammert J ir kt. Plačiai kryžmiškai reaguojantys antikūnai dominuoja žmogaus B ląstelių atsake prieš 2009 m. pandeminę H1N1 gripo viruso infekciją. J Exp Med. 2011;208(1):181–193.
52. Guthmiller JJ ir kt. Pirmasis pandemijos H1N1 viruso sukeltas plačiai neutralizuojančių antikūnų poveikis, nukreiptas į hemagliutinino galvos epitopus. Sci Transl Med. 2021;13(596):eabg4535.
53. Bajic G ir kt. Gripo antigenų inžinerija sutelkia dėmesį į imuninį atsaką į subdominuojantį, bet plačiai saugantį viruso epitopą. Ląstelės šeimininko mikrobas. 2019;25(6):827–835.
54. Nachbagauer R ir kt. Chimerinė hemagliutinino pagrindu sukurta universali vakcina nuo gripo viruso sukelia platų ir ilgalaikį imunitetą atsitiktinių imčių, placebu kontroliuojamame I fazės tyrime. Nat Med. 2021;27(1):106–114.
55. Angeletti D ir kt. Aplenkia imunodominavimą, siekiant nukreipti į subdominuojančius plačiai neutralizuojančius epitopus. Proc Natl Acad Sci US A. 2019;116(27):13474–13479.
56. Guthmiller JJ ir kt. Veiksmingas būdas sukurti monokloninius antikūnus iš žmogaus B ląstelių. Metodai Mol Biol. 2019;1904:109–145.
57. Amanat F ir kt. Serologinis tyrimas, skirtas SARS-CoV-2 serokonversijai žmonėms nustatyti. Nat Med. 2020;26(7):1033–1036.
58. Stadlbauer D ir kt. SARS-CoV-2 serokonversija žmonėms: išsamus serologinio tyrimo, antigeno gamybos ir tyrimo nustatymo protokolas. Curr Protoc Microbiol. 2020;57(1):e100.
59. Torres JL ir kt. Struktūrinės įžvalgos apie labai stiprų visą neutralizuojantį SARS-CoV-2 žmogaus monokloninį antikūną. Proc Natl Acad Sci USA. 2022;119(20):e2120976119.
60. Suloway C ir kt. Automatizuota molekulinė mikroskopija: nauja Leginon sistema. J Struct Biol. 2005;151(1):41–60.
61. Lander GC ir kt. Appion: integruotas duomenų baze valdomas vamzdynas, palengvinantis EM vaizdų apdorojimą. J Struct Biol. 2009;166(1):95–102.
62. Voss NR ir kt. „DoG Picker“ ir „TiltPicker“: programinės įrangos įrankiai, palengvinantys dalelių pasirinkimą atliekant vienos dalelės elektronų mikroskopiją. J Struct Biol. 2009;166(2):205–213.
63. Pettersen EF ir kt. UCSF Chimera{1}}vizualizacijos sistema, skirta tiriamiesiems tyrimams ir analizei. J Comput Chem. 2004;25(13):1605–1612.
64. Punjani A ir kt. Nevienodas tobulinimas: adaptyvus reguliavimas pagerina vienos dalelės krio-EM rekonstrukciją. Nat metodai. 2020;17(12):1214–1221.
65. Zhang K. Gctf: CTF nustatymas ir taisymas realiuoju laiku. J Struct Biol. 2016;193(1):1–12.
66. Zivanov J ir kt. Nauji įrankiai, skirti automatizuotam didelės raiškos krio-EM struktūros nustatymui programoje RELION-3. Elife. 2018;7:e42166.
67. Casanal A ir kt. Dabartinė elektronų krio-mikroskopijos ir kristalografinių duomenų makromolekulinio modelio kūrimo plėtra. Protein Sci. 2020;29(4):1069–1078.
68. Frenz B ir kt. Automatinis glikoproteinų struktūrų klaidų taisymas su rozeta. Struktūra. 2019;27(1):134–139.
69. Klaholz BP. Atominių modelių sudarymas ir tobulinimas kristalografijoje ir krio-EM: naujausi Phenix įrankiai, palengvinantys struktūros analizę. Acta Crystallogr D Struct Biol. 2019;75(pt 10):878–881.
70. Pettersen EF ir kt. UCSF ChimeraX: Struktūrų vizualizacija tyrėjams, pedagogams ir kūrėjams. Protein Sci. 2021;30(1):70–82.
71. Otwinowski Z, Minor W. Rentgeno spindulių difrakcijos duomenų, surinktų virpesių režimu, apdorojimas. Metodai Enzymol. 1997;276:307–326.
72. McCoy AJ ir kt. Fazinės kristalografijos programinė įranga. J Appl Crystallogr. 2007;40(pt 4):658–674.
73. Qiang M ir kt. Neutralizuojantys antikūnai prieš SARS CoV-2 buvo atrinkti iš žmogaus antikūnų bibliotekos, sukurtos prieš dešimtmečius. Adv Sci (Weinh). 2022;9(1):e2102181.
74. Emsley P, Cowtan K. Coot: modelių kūrimo įrankiai molekulinei grafikai. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 2004;60 (12 pt 1): 2126–2132.
75. Adams PD ir kt. PHENIX: išsami Python pagrindu sukurta sistema, skirta makromolekulinės struktūros sprendimui. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 2010; 66 (pt 2): 213–221.
76. Montiel-Garcia D ir kt. Epitopo analizatorius: struktūra pagrįstas žiniatinklio įrankis, skirtas plačiai neutralizuojantiems epitopams analizuoti. J Struct Biol. 2022;214(1):107839.