Mažos, bet galingos – egzosomos, nauji tarpląsteliniai pasiuntiniai neurodegeneracijoje 1 dalis

Paprasta santrauka:

Egzosomos yra biologinės nanodalelės, neseniai pripažintos tarpląsteliniais pasiuntiniais. Juose yra daug lipidų, baltymų ir RNR. Jie gali perkelti savo turinį ne tik į netoliese esančias ląsteles, bet ir į ląsteles per atstumą.

Egzosomos yra naujai atrasta tarpląstelinio ryšio priemonė, kuri gali išleisti mažas ir subtilias pūsleles į aplinkines ląsteles, tiekti kai kuriuos baltymus, signalines medžiagas ir kitas medžiagas į aplinkines ląsteles. Šios medžiagos gali padėti ląstelėms pakeisti savo būseną ir netgi paveikti kitų ląstelių augimą, vystymąsi, medžiagų apykaitą ir kitus aspektus. Pastaraisiais metais atlikti tyrimai parodė, kad egzosomos vaidina svarbų vaidmenį žmogaus smegenų veikloje, ypač palaikant ir gerinant atmintį.

Pirma, egzosomos gali skatinti signalo perdavimą tarp neuronų. Informacijos perdavimas tarp neuronų yra viena iš būtinų sąlygų normaliai nervų sistemos veiklai, o egzosomos atlieka pasiuntinių vaidmenį, todėl informacijos perdavimas tarp neuronų gali būti sklandesnis, taip pagerinant smegenų pažinimą ir atmintį.

Antra, egzosomos taip pat gali reguliuoti neuronų metabolizmą. Neuronų, gaminančių ir atpalaiduojančių egzosomas, procese dalyvauja daugybė medžiagų apykaitos procesų, kurie skatina ląstelių metabolizmo pusiausvyrą ir reguliavimą. Šie procesai gali ne tik sustiprinti neuronų gebėjimą, bet ir padėti pašalinti medžiagų apykaitos atliekas ir kenksmingas molekules bei išlaikyti sveiką smegenų ląsteles.

Galiausiai, egzosomos taip pat gali padėti neuronams ištaisyti žalą. Daugelis baltymų ir nukleino rūgščių, kuriuos perneša egzosomos, yra naudingi ląstelių augimui, taisymui ir regeneracijai, gali skatinti neuronų taisymą ir regeneraciją, taip pagerindami smegenų ląstelių išgyvenamumą ir stiprindami atminties centrus bei pažinimo gebėjimus.

Apibendrinant galima pasakyti, kad tarp egzosomų ir atminties yra glaudus ryšys. Vaikų atmintį galime pakeisti pradėdami nuo dietos. Aktyviai vadovaujant vaikų mitybos struktūrai ir valgant daugiau maisto, kuriame gausu naudingų ingredientų, tokių kaip riebalų rūgštys, baltymai ir vitaminai, gali būti skatinama egzosomų gamyba ir išsiskyrimas, taip padedant vaikams pagerinti jų mokymosi ir atminties gebėjimus. Vaikams taip pat gali būti pasiūlyti tam tikri smegenų lavinimo žaidimai ir pratimai, siekiant iššaukti ir lavinti jų mąstymą, skatinti egzosomų potencialą ir atlikti geresnį vaidmenį. Matyti, kad mums reikia pagerinti atmintį, o Cistanche gali žymiai pagerinti atmintį, nes Cistanche yra tradicinė kinų vaistinė medžiaga, turinti daug unikalių poveikių, iš kurių vienas yra pagerinti atmintį. Cistanche veiksmingumą lemia įvairios jame esančios veikliosios medžiagos, įskaitant tanino rūgštį, polisacharidus, flavonoidinius glikozidus ir kt. Šie ingredientai gali įvairiais būdais skatinti smegenų sveikatą.

Spustelėkite Žinoti, kad pagerintumėte trumpalaikę atmintį

Šis unikalus gebėjimas įgalina juos modifikuoti recipientų ląstelių fiziologiją. Smegenyse egzosomos vaidina svarbų vaidmenį sergant neurodegeneracinėmis ligomis, tokiomis kaip Alcheimerio liga, Parkinsono liga ir amiotrofinė šoninė sklerozė.

Santrauka:

Endosominės kilmės egzosomos yra viena tarpląstelinių pūslelių, kurios yra svarbios tarpląsteliniam ryšiui, klasė. Egzosomas išskiria visos mūsų kūno ląstelės, o jų krovinys, susidedantis iš lipidų, baltymų ir nukleino rūgščių, turi pėdsaką, atspindintį jų tėvų kilmę.

Egzosominis krovinys turi galią moduliuoti recipiento ląstelių fiziologiją šalia atpalaiduojančių ląstelių arba ląstelių per atstumą. Egzosomų potencialo panaudojimas priklauso nuo egzosomų paruošimo grynumo.

Taigi buvo sukurta daug izoliavimo metodų ir pateikiame glaustą kelių metodų santrauką. Nepaisant kraujo ir smegenų barjero sukeltos izoliacijos, CNS ląstelės nėra apsaugotos nuo egzosominio intruzinio poveikio. Tiek neuronai, tiek gliaratpalaiduoja egzosomas, dažnai priklausomai nuo veiklos.

Pateikiamas trumpas skirtingų smegenų ląstelių išskiriamų egzosomų aprašymas ir jų vaidmuo palaikant CNS homeostazę. Kai kurių neurodegeneracinių ligų požymis yra baltymų agregatų kaupimasis. Neseniai atlikti tyrimai susiję su egzosomų tarpląstelinio komunikatoriaus vaidmeniu plintant netinkamai sulankstytiems baltymams, o tai reiškia patologijos plitimą.

Šioje apžvalgoje aptariame galimą egzosomų indėlį progresuojant Alzheimerio ligai, Parkinsono ligai ir amiotrofinei lateralinei sklerozei.

Egzosomų indėlio į neurodegeneracijos patogenezę supratimas atveria galimybę panaudoti egzosomas kaip terapines medžiagas vaistams tiekti į smegenis, nes egzosomos kerta kraujo ir smegenų barjerą.

Raktažodžiai: egzosomos; neuronai; glijos ląstelės; centrinė nervų sistema (CNS); neurodegeneracinės ligos;Alzheimerio liga; Parkinsono liga; amiotrofinė šoninė sklerozė.

1. Įvadas ir istorinė perspektyva

Tarpląstelinis ryšys yra labai svarbus embriono vystymuisi, epitelio regeneracijai / pakeitimui, gametogenezei ir homeostazės palaikymui.

Naudojant ultrastruktūrinius ir biocheminius tyrimus buvo nustatyti keli ląstelių ir ląstelių ryšio mechanizmai, tokie kaip endocitozė / egzocitozė ir išsikišusių citoplazminių dėmių įsisavinimas [1–3]. Buvo nustatytas kitas žaidėjas, tarpląstelinės pūslelės, tačiau jų vaidmuo tarpląstelinėje komunikacijoje nebuvo įvertintas iš karto [4].

Ekstraląstelinės pūslelės buvo aptiktos netikėtai tiriant su plazmos membrana susijusių fermentų, ekto-ATPazės ir ekto-50-nukleotidazės išsiskyrimą į ląstelių auginimo terpę. 1981 m. Tramsas ir bendradarbiai augino normalias ir neoplastines pelių ir žmogaus ląstelių linijas terpėje be serumo, nes buvo žinoma, kad serumas turi katalizinį ATPazės ir 50-nukleotidazės aktyvumą.

Pašalinus plūduriuojančias ląsteles ir šiukšles, kondicionuojama terpė buvo centrifuguojama 310, 000 × g greičiu 90 min. Spinco Ti-70 rotoriuje, o granulės buvo tiriamos elektroniniu mikroskopu. Buvo aptiktos dvi ekstraląstelinės membranos gaubtų pūslelių populiacijos, kurių vidutinis skersmuo yra nuo 500 iki 1000 nm, o antroji, mažesnė populiacija, kurios skersmuo ~ 40 nm.

Šios pūslelės, kurias autoriai iš pradžių apibūdino kaip „išsiskleidusias pūsleles“, turėjo ir 50-50-nukleotidazės, ir ATPazės fermentinį aktyvumą. Be to, išsausėjusiose pūslelėse buvo RNR ir fosfolipidų, kurie skyrėsi atitinkamai nuo pirminių ląstelių ir pradinės plazmos membranos.

C6 gliomos ląstelių eksfoliuotų pūslelių inkubavimas su 32P iš anksto pažymėtomis neuroblastomos ląstelėmis paskatino neuroblastomos baltymų defosforilinimą kartu su laisvo radioaktyviai pažymėto fosforo (32P) išsiskyrimu.

Šie duomenys parodė, kad išsisluoksniavusios pūslelės buvo ne tik ląstelių atliekų (fermentų) nešiotojai, bet ir turėjo fiziologinę funkciją. Tram ir jo kolegos sukūrė terminą egzosomos, kad apibūdintų "išsiskleidusias pūsleles" [5] (žr. [6] straipsnį apie ekstraląstelinių pūslelių istoriją iki 1981 m.). Po kelerių metų dvi tyrėjų grupės savarankiškai tyrė transferino receptoriaus likimą retikulocituose elektroniniu mikroskopu [7–9].

Brendusiems retikulocitams nereikia transferino, todėl jie praranda transferino receptorius. Abi grupės pastebėjo, kad kultivuoti retikulocitai į ekstraląstelinę erdvę išleido mažas ~ 50 nm skersmens pūsleles.

Šiose mažose pūslelėse buvo nesuardytų transferino receptorių. 1987 m. Johnstonas ir bendradarbiai vartojo terminą egzosomos, apibūdindami mažas pūsleles, kuriose yra transferino receptorių [10]. Po šių pirmųjų metų egzosomų potencialas buvo realizuotas kaip nauji tarpląsteliniai pasiuntiniai, galintys moduliuoti tikslinių ląstelių fiziologiją.

Įdomu tai, kad egzosomų genezę inicijuoja endocitozė (procesas, nustatytas 1883 m.; apžvelgė [3]), o egzosomų išsiskyrimas į tarpląstelinę erdvę naudoja egzocitozės procesą. Nuo pirminio jų atradimo dabar žinome, kad egzosomos yra tarpląstelinių ląstelių potipis. endocitinės kilmės, kurių skersmuo yra 40–160 nm [11].

Atsekamieji tyrimai parodė, kad makromolekulės yra endocituojamos šeriais (ty klatrinu padengtose) invaginacijose arba ląstelės paviršiaus duobutėse. Šios invaginacijos galiausiai atsiskiria nuo plazmos membranos ir aptinkamos citoplazmoje.

Netekusios šerių (ty klatrino), endocituotos dengtos pūslelės tampa lygios ir susilieja su ankstyvosiomis endosomomis, kad galėtų greitai perdirbti atgal į ląstelės paviršių (perdirbamos endosomos 1 paveiksle) [12] arba subrandinamos, kad susidarytų vėlyvos endosomos.

Ankstyvosios ir vėlyvosios endosomos veikia kaip „rūšiavimo mazgai“, kad tinkamai nukreiptų savo turinį: (i) retrogradiniam transportavimui į trans-Golgi tinklą (ty endosomų į TGN atkūrimą) [13,14]; (ii) į lizosomas, skirtas makromolekulėms skaidyti iki paprastų produktų, skirtų pakartotiniam naudojimui ląstelėje [15,16]; ir (arba) iii) perdirbti į ląstelės paviršių per daugiapūslelius [17].

Ankstyvųjų endosomų subrendimo metu įeina į endosomas, vidinė endosomų membrana patenka į invaginaciją, todėl susidaro intraluminalinės pūslelės (dabar vadinamos egzosomomis). Specifinės makromolekulės, tokios kaip citozoliniai baltymai, nukleino rūgštys ir lipidai, yra suskirstytos į besivystančias egzosomas.

Vėlyvosios endosomos, supakuotos su egzosomomis, yra identifikuojamos kaip multivezikuliniai kūnai, kurie migruoja į plazmos membraną. Susilieję su plazmine membrana, multivezikuliniai kūnai išskiria egzosomas į tarpląstelinę erdvę per egzocitozės procesą (1 pav.) [18,19]. Didelis nuosekliai įdarbinamų baltymų pogrupis vaidina lemiamą reikšmę endocitozės procese iki ankstyvųjų endosomų, endosomų brendimo iki vėlyvųjų endosomų ir tolesnio jų tarpląstelinio likimo (apžvelgta [17, 18, 20]).

Šių baltymų svarbą pabrėžia jų praradimas ir (arba) mutacija (-os), sukeliančios įvairias ligas. Pavyzdžiui, Strumpellin ir SWIP baltymai yra WASH komplekso dalis, dalyvaujanti aktino polimerizacijoje, taip pat endosomų dalijime ir rūšiavime. Strumpellin geno mutacijos sukelia paveldimą spastinę paraplegiją, kuriai būdinga motorinių neuronų degeneracija [21].

Vieno taško mutacija (Pro1019Arg) SWIP baltyme destabilizuoja WASH kompleksą. Destabilizuotas WASH kompleksas slopina endolizosomų prekybą, sukeldamas endosomų sulipimą. Sugedęs endosominis srautas veikia pažinimą ir motorinių neuronų funkciją, o simptomai apibūdinami kaip nesindrominis protinis atsilikimas [22,23].

Citoplazmoje egzosomos atsiranda iš endosomų, naudojant endosomų rūšiavimo kompleksus, reikalingus transportavimui (ESCRT), dar žinomą kaip nuo ESCRT priklausomas egzosomų biogenezės mechanizmas (peržiūrėta [18, 20]).

Dvi grupės nepriklausomai pranešė apie lipidų sukeltą egzosomų biogenezę, nuo ESCRT nepriklausomą mechanizmą. Šiuose tyrimuose nustatyti du lipidai buvo bis(monoacilglicero)fosfatas/lizobisfosfatido rūgštis (BMP/LBPA) ir keramidas [29,30].

Rab31 yra dar vienas nuo ESCRT nepriklausomas egzosomų biogenezės mechanizmas citoplazmoje. Rab31 aktyvinimas skatina intraluminalinių pūslelių susidarymą [31]. Yra dar vienas mechanizmas, kuris šiuo metu yra nepakankamai aptariamas ir ištirtas.

Šis mechanizmas pagrįstas ultrastruktūriniais stebėjimais, atliktais XX a. šeštojo dešimtmečio pabaigoje – aštuntajame dešimtmetyje, kurie parodė, kad ląstelių branduoliai gali būti daugiapūslinių kūnų, pripildytų mažų pūslelių, atsiradimo vieta. Šiuose tyrimuose aprašytos mažos pūslelės galbūt buvo egzosomos, tačiau terminas egzosoma tuo metu nebuvo sukurtas. Kilarskis ir Jasinski stebėjo procesą, vadinamą branduoliniu pūtimu arba branduolio išspaudimu ešerio Perca fluviatilis L. plaukimo pūslės ląstelėse (2a pav.) [24], kurios turinys panašus į branduolio kararioplazmą [32].

Šie autoriai pažymėjo, kad branduolinį pūtimą galima paskatinti pašalinus dujas iš ešerių plaukimo pūslės [24]. Atrodo, kad branduolinio pūtimo procesas yra vertingas kaip egzosomų, praturtintų nukleino rūgštimis ir (arba) ribonukleoproteinu, kilmės vieta.

Branduolinės pūslelės buvo užpildytos mažomis pūslelėmis, susidariusiomis iš branduolinių pūslelių vidinės membranos sulenkimų (2b paveikslas), o tai yra procesas, panašus į intraluminalinių pūslelių susidarymą endosomose. Branduolinės pūslelės, užpildytos „mažomis pūslelėmis“, galiausiai atsiskyrė nuo branduolių ir tapo citoplazmos dalimi (2c pav.).

Kilarskis ir Jasinskis savo rankraštyje minėjo branduolines pūsles kaip daugiapūsles, nes trūko geresnės terminijos. Netyčia šie autoriai galėjo būti teisūs, nes vėlesni tyrimai pranešė, kad ląstelių branduoliuose yra daug pūslelių [33]. Branduoliniai burbuliukai, užpildyti mažomis pūslelėmis, turi morfologiją, panašią į multivezikulinius kūnus, kilusius iš endosomų citoplazmoje (1 ir 2 paveikslai).

Dėl branduolinių multivezikulinių kūnų panašumo su virusine nukleokapside tyrėjai sutelkė dėmesį į virusologiją ir branduolinio pūtimo fenomeną bei jo ląstelių funkciją [34].

Nepriklausomai nuo biogenezės būdo, egzosomos yra sudarytos iš alipidų dvigubo sluoksnio ir turi makromolekulinį turinį, kurį sudaro lipidai, baltymai ir nukleorūgštys.

Kai kurios makromolekulės yra bendros egzosomoms, kilusioms iš visų ląstelių, todėl yra klasifikuojamos kaip egzosomų žymenys ir yra naudojamos kaip patvirtinamoji priemonė atskirti egzosomas nuo kitų tarpląstelinių pūslelių. Unikalios makromolekulės, esančios egzosomuose, suminkštėja, atspindi jų tėvinę kilmę, todėl tikėtina, kad jos bus pažymėtos kaip biomarkeris (-iai).

Visos ląstelės išskiria egzosomas į tarpląstelinę erdvę. Iš tarpląstelinės erdvės egzosomos patenka į įvairius biologinius skysčius ir pasiekia ląsteles lokaliai bei atstumu. Ląstelės, auginamos in vitro, išskiria savo egzosomas į auginimo terpę. Nuolatinis egzosomų išskyrimas į tarpląstelinę erdvę daro kultūrinę terpę ir biologinius skysčius turtingu šaltiniu egzosomų išskyrimui.

Egzosomose yra daug koduojančių ir nekoduojančių RNR, dvigrandžių genomo DNR fragmentų ir mitochondrijų DNR. Tramsai ir jo kolegos pirmieji aprašė RNR buvimą „išsiskleidusiose pūslelėse“, egzosomų ir mikropūslelių mišinyje.

Jie nustatė, kad „išsiplėtusiose pūslelėse arba egzosomose“ yra 5 % RNR [5]. Valadi ir kolegos buvo pirmieji, kurie sistemingai analizavo RNR supakuotas ineksosomas. Egzosominės RNR apėmė verčiamas mRNR ir mikroRNR (miR) [35].

MikroRNR yra nekoduojančių RNR (ncRNR) klasė. Jie yra ~22 nukleotidų ilgio ir reguliuoja genų ekspresiją potranskripcijos lygiu, prisijungdami prie 30-netransliuotų tikslinių pasiuntinių RNR regionų [36]. Įdomu tai, kad kai kurios miRNR, praturtintos egzosomomis, neaptinkamos pirminėse ląstelėse, o tai rodo selektyvią RNR rūšiavimo / pakavimo sistemą egzosomų biogenezės metu [35, 37].

Skirtingai nuo ląstelių, egzosomose yra mažai arba visai nėra ribosominės RNR, tačiau jose yra tRNR fragmentų [38]. RNR rūšiavimas į egzosomas priklauso nuo (1) su RNR sukelto tylėjimo komplekso (RISC) susieto baltymo, (2) RNR sekos motyvų ir vadovaujančių baltymų, (3) nukleotidų pridėjimo 30 miRNR gale, (4) miRNR prieinamumo ląstelėse ir (5) keramidas [39,40].

Manome, kad branduolinis pūtimas yra dar vienas ląstelių procesas, leidžiantis skirtingai rūšiuoti RNR, RNR-baltymų kompleksus ir genominę DNR į egzosomas. Tokiam požiūriui yra kelios priežastys: (1) „intraluminalinių pūslelių“ turinys buvo panašus į branduolio karioplazmą [32]. „pūslelės“ branduoliniuose multivezikuliniuose kūnuose (MVB II) buvo praturtintos RNR, rūgštiniais ir baziniais baltymais, todėl autoriai manė, kad intraluminalinės pūslelės“ kaip RNR sintezės vieta, be tonucleolio [41].

Proteins present in the vesicles may have been RNA-binding proteins and Dicer1 that were detected in exosomes [42] (unpublished data, Kumari Lab, Kansas State University, Manhattan, KS, USA). (2) Considering the nucleus as a site of exosome biogenesis can explain the presence of RNAs including precursor miRNAs (unpublished data, Kumari Lab) and double-stranded genomic DNA fragments ranging from 100 bp to >10 kbin egzosomos [43–47].

Beje, genominė DNR buvo aptikta tik egzosomose, gautose iš vėžio ląstelių linijų, o ne normaliose ląstelėse [47]. Vėžinės ląstelės turi nenormalų chromatiną dėl chromatino pertvarkymo / perkėlimo ir galbūt ploidijos [48], dėl kurios vėžio ląstelių branduoliuose gali atsirasti genominės DNR fragmentacijos. Šiuos DNR fragmentus galima lengvai įtraukti į II tipo MVB (ir egzosomas), besivystančias branduoliuose. (3) Kilarski ir Jasinski [24] aprašytas „mažų pūslelių“ biogenezės būdas branduolio pūslelėse yra panašus į intraluminalinių pūslelių susidarymą vėlyvosiose citoplazmos endosomose.

Mes tvirtai tikime, kad genominės DNR buvimas egzosomose yra patologinis, todėl jos buvimas egzosomose gali būti naudojamas kaip diagnostikos priemonė nenormalių (arba vėžio) ląstelių vystymuisi organizme. (4) Nuo aktyvumo priklausomas ląstelių išskiriamų egzosomų skaičiaus padidėjimas [49] yra panašus į dujų ląsteles, kuriose pasišalinus dujoms iš ešerių žuvų plaukimo pūslės pasireiškė padidėjęs branduolinis pūtimas [24].

Visai neseniai kai kurių vėžiu sergančių pacientų plazmos egzosomose buvo aptikti mitochondrijų baltymai ir DNR, o jų buvimas yra susijęs su vėžio agresyvumu [50, 51].

Mitochondrijų skilimas dažnai stebimas degeneruojančiose ląstelėse [52, 53]. Iš degeneruojančių mitochondrijų išsiskiriančios mitochondrijos kristos gali būti internalizuotos daugiavazių kūnų ir galiausiai yra supakuotos į ineksosomas.

Šią mintį patvirtina ultrastruktūriniai žmogaus limfoblastoidinių ląstelių ir babuino prostatos acini spindžio vaizdai, kuriuose buvo „mikrovezikulių“ (arba egzosomų), atsiradusių suskaidžius mitochondrijų kriaušes [54].

Remdamiesi aukščiau pateikta diskusija ir patvirtinančiais eksperimentiniais įrodymais, siūlome, kad nevienalytis egzosomų pobūdis kiltų iš daugiapūslių kūnų ir susijusių egzosomų biogenezės skirtingose ​​tarpląstelinėse vietose, o ne tik citoplazmoje, kaip dabar tikime. Mūsų pasiūlymas gali paaiškinti egzosomų nevienalytiškumą. taip pat neatitikimas tarp teorinių skaičiavimų ir eksperimentinių duomenų apie mažų RNR arba baltymų molekulių, esančių vienoje iš serumo išgrynintoje egzosomoje, skaičių [55].

Remdamiesi teoriniais skaičiavimais, naudojant vidutinį egzosomos dydį, Li ir kolegos numatė, kad kiekviena egzosoma talpins maždaug 70–25 000 mažas RNR arba baltymų molekules.

Tačiau jų eksperimentiniai duomenys parodė, kad vienoje egzosomoje, išgrynintoje iš serumo, yra viena RNR molekulė [55]. Mūsų hipotezė reikalauja toliau tirti branduolinį pūtimą, branduolinius multivezikulinius kūnus ir RNR / ribonukleoproteinų turinčių egzosomų biogenezę branduolinių daugiapūslių kūnų. Lipidai yra svarbi egzosomų membranų dalis ir yra pasiskirstę asimetriškai tarp dviejų egzosomų membranų lapelių. Lipidų sudėtis skiriasi tarp pagrindinės ląstelės membranos ir egzosomos membranos.

Apskritai lipidai, praturtinti egzosomų membranomis, yra sfingomielinas, keramidas, cholesterolio ir cholesterolio turtingi lipidų plausto mikrodomenai, gangliozidas GM3, desotieji lipidai ir fosfatidilserinas [56–58]. į tam tikrą tėvų ląstelę.

Visų egzosomų baltymų kiekis paprastai yra praturtintas tiksliniais ir sulietais baltymais, tokiais kaip tetraspaninai, integrinai, chaperoneproteinai, pvz., šilumos šoko baltymai (Hsp60, Hsp70 ir Hsp90), maži HSP membraną pernešantys baltymai, Rab baltymai, ARF GTPazės, aneksinai ir baltymai, dalyvaujantys formuojant multivezikulinius kūnus, tokius kaip ALIX ir TSG101 [59].

Naujausi tyrimai rodo, kad egzosomose yra RNR surišančių baltymų, kurie sudaro RNR ir baltymų kompleksus [38]. Keli ląstelių procesai, užtikrinantys baltymų įkėlimą į egzosomeras, yra (1) ESCRT mechanizmai baltymams su tam tikromis potransliacinėmis modifikacijomis, tokiomis kaip ubikvitinacija, Wnt stimuliuojamas arginino metilinimas, oksidacija, fosforilinimas, glikozilinimas ir citrulinacija; (2) chaperono sukelta autofagija (CMA), kuri priklauso nuo šilumos šoko giminingo 71 kDa baltymo (HSC70) ir baltymų, turinčių KFERQmotifą, sąveika.

Sujungus HSC70 su baltymais su KFERQ motyvu, baltymai nukreipiami į multivezikulinius kūnus. Chaperono sukelta autofagija paprastai veikia lizosomų baltymų skaidymui. Naujausi duomenys rodo, kad kai kurių neurodegeneracinių ligų CMA vaidina svarbų vaidmenį eksosomų išsiskyrime ir baltymų agregatų sklaidoje su egzosomomis [60–63].

Nuo dešimtojo dešimtmečio egzosomų tyrinėjimų skaičius eksponentiškai padaugėjo ir buvo sukaupta daug duomenų apie egzosominius krovinius. Duomenų bazės buvo sukurtos siekiant pateikti egzosominių krovinių rinkinį, kol dar nėra per sunku valdyti didelius duomenų rinkinius.

Paskelbtų duomenų apie egzosomas pakartojamumas yra dar viena priežastis, nes dauguma laboratorijų naudoja skirtingų metodų variantus, sukurtus egzosomoms išskirti. Pavyzdžiui, Vesiclepediais yra rankiniu būdu kuruojamas molekulinių krovinių (lipidų, RNR ir baltymų) rinkinys, identifikuotas skirtingose ​​ekstraląstelinių pūslelių klasėse [64]. Vesiclepedia yra vertingas šaltinis tyrinėtojams.

Duomenų bazė Vesiclepedia yra viešai prieinama ir leidžia vartotojams užklausti ir atsisiųsti eksosominius krovinių duomenis pagal vartotojo įvestus paieškos kriterijus. EV pedia, Exocarta, ExoRbase ir EV miRNR yra papildomos duomenų bazės, kuriose kataloguojami egzosominiai baltymai ir RNR [64].

Duomenų bazes valdo bendruomenės anotacijos. Šiose duomenų bazėse sukaupti duomenys gaunami išskiriant egzosomas, naudojant įvairius atskyrimo metodus, kurie nėra įtraukti į duomenų bazę.

Taigi egzosominis krovinio kiekis gali skirtis priklausomai nuo naudojamo išskyrimo metodo, todėl pateikiami rezultatai gali būti neaiškūs. Siekiant pagerinti eksperimentinį atkuriamumą ir skaidrumą, buvo sukurtas atvirojo kodo žinių bazės EV-TRACK įrankių rinkinys. EV-TRACK apima duomenis apie egzosomų paruošimą ir egzosomų apibūdinimą [65].

Pagrindinė EV-TRACK savybė yra EV-METRIC, kuri pateikia eksperimentinių parametrų ataskaitas kaip devynių sąrašo įvykdytų komponentų procentas [66]. Dėl šių komponentų nusprendė EVTRACK konsorciumas ir buvo nuspręsta, kad jie reikalingi vienareikšmiškam duomenų interpretavimui ir eksperimentinių duomenų atkūrimui. Taigi, EV-METRIC buvo sukurta siekiant padėti tyrėjams ir apžvalgininkams pateikti išsamią duomenų apžvalgą.

2. Dabartiniai egzosomų išskyrimo metodai

Egzosomos yra turtingas šaltinis biomarkerių atradimui ir naujoms terapinėms strategijoms, įskaitant regeneracinę mediciną. Svarbiausia, kad šie tikslai būtų sėkmingi, yra grynų egzosomų išskyrimas atkuriamu metodu.

Funkciškai kompetentingų egzosomų išskyrimas yra ypač svarbus galimiems gydymo tikslams. Egzosomos buvo išvalytos iš įvairių biologinių skysčių, tokių kaip kraujas, plazma, smegenų skystis, seilės, šlapimas ir pienas. Kiekvienas biologinis skystis turi skirtingas fizines ir chemines charakteristikas, į kurias reikia atsižvelgti prieš išskiriant egzosomą.

Kai kuriais atvejais egzosomų izoliacijai gali prireikti specialių atsargumo priemonių. Galutinis išgrynintų egzosomų panaudojimas yra dar vienas veiksnys, turintis įtakos egzosomų išskyrimo metodui.

Iki šiol buvo sukurti keli egzosomų išskyrimo metodai ir kai kurie iš jų yra pagrįsti egzosomų charakteristikomis, tokiomis kaip jų dydis, tankis, paviršiaus krūvis ir baltymai, susiję su egzosomos paviršiumi (3 pav.) [67].

Kai kurie šiuo metu taikomi egzosomų išskyrimo metodai yra išvardyti 1 lentelėje. Dauguma jų nėra atskiri metodai ir reikalauja išankstinio apdorojimo po mėginio. Svarbiausi metodai trumpai aptariami toliau.

3 pav. Dažniausiai naudojami egzosomų išskyrimo metodai ir jų pritaikymas pasroviui. Keli iki šiol sukurti egzosomų išskyrimo metodai yra pagrįsti jų plūduriuojančiu tankiu, 1, 13 schema ir 1,19 g/mL, ultracentrifugavimo metodas (UC) buvo toliau tobulinamas išskirti grynus egzosomų preparatus, remiantis jų plūduriuojančiu tankiu, naudojant izopikninę ultracentrifugavimo persacharozės arba jodiksanolio tankio gradientą (DG).

Norint pašalinti didelį baltymų kiekį proteinurijoje, ultracentrifugavimo metodas buvo derinamas su dydžio išskyrimo chromatografija (SEC). Dėl laiko apribojimų, susijusių su ultracentrifugavimo metodu, buvo sukurtas filtravimo metodas (UF).

Praleidus atskiestus mėginius, tokius kaip auginimo terpė ir šlapimas per nano- arba mikromembraninį koncentratorių, buvo galima išvalyti egzosomus. Dėl membranos užsikimšimo ir prasto egzosominių baltymų atkūrimo šis metodas tapo nepopuliarus tolesniam naudojimui, pvz., RNR izoliacijai ir didelio našumo taikymams.

Kitas metodas, sukurtas egzosomoms išskirti iš labai praskiestų biologinių skysčių hidrostatinės filtravimo dializės (HFD *) kartu su centrifugavimu. Taikant HFD metodą, mėginys dializuojamas per dializės membraną, kurios molekulinė masė yra 1000 kDa, esant hidrostatiniam slėgiui, todėl iš mėginio gali būti pašalintos nepageidaujamos makromolekulės, o egzosomos atgaunamos centrifuguojant.

Egzosomų nusodinimo metodas, pagrįstas tirpumu arba dispersiškumu ir agregacija, buvo sukurtas siekiant apdoroti kelis mėginius vienu metu. Šia strategija pagrįsti prekybiniai egzosomų valymo rinkiniai.

Taikant šį metodą, šlapimo orascitai sumaišomi su polietilenglikoliu (PEG) 6000 arba kartu su protaminu (plius PEG35 000) ir inkubuojami per naktį arba 1 valandą ant ledo.

T gautas drumstas mišinys centrifuguojamas, kad būtų atkurtos egzosomos, naudojamos pasroviui atlikti RNR ir baltymų analizę. Kiti reagentai, naudojami egzosomų nusodinimui: (1) 0.1M natrio acetatas, pH 4,75 (išsūdymo metodas) (NaAc), (2) 4-karto didesnis šalto acetono tūris (–20 ◦C) ( PROtein Organic Solvent Precipitation ir sutrumpintai PROSPR), (3) ir PEG ir dekstrano tirpalo mišinys (iki 1,5 %) (dviejų fazių metodas, leidžiantis atskirti baltymus nuo egzosomų).

Egzosominių paviršiaus baltymų identifikavimas paskatino sukurti imunoafiniteto gaudymu pagrįstus metodus, naudojant antikūnus prieš egzosomų paviršiaus baltymus, tokius kaip Tim4, aneksiną, EpCAM, bendrą egzosomų paviršiaus baltymą, CD63 ir šilumos šoko baltymus (afiniteto sąveika). Afinitetas lektinui (kuris jungiasi su glikoproteinais egzosomų paviršiuje) ir heparinui (kuris jungiasi su heparano sulfato proteoglikanais egzosomų paviršiuje) buvo panaudotas kuriant egzosomų išskyrimo metodus.

Afinitetu pagrįstiems egzosomų valymo metodams buvo naudojamos kelios platformos, tokios kaip magnetiniai rutuliukai, labai porėti monolitiniai silicio dioksido mikroantgaliai, plastikinių plokščių paviršius, celiuliozės filtrai, membranos afiniteto filtrai, agarozesorbentas ir mikrofluidiniai prietaisai, ir jų naudojimas diagnostinės, prognostinės, kaip vaistų tiekimo sistemos, ir forexosominių krovinių aptikimas bei analizės.

Pritaikyta gavus Konoshenko MY, Lekchnov EA, Vlassov AV, Laktionov PP leidimą. Ekstraląstelinių pūslelių išskyrimas: bendrosios metodikos ir naujausios tendencijos. Biomed Res Int. 2018 sausio 30 d.; 2018:8545347. doi: 10.1155/2018/8545347. PMID: 29662902; PMCID: PMC5831698; Autoriaus teisės © 2022 Maria Yu. Konoshenko ir kt.

Tai yra atviros prieigos straipsnis, platinamas pagal Creative Commons Attribution License, kuri leidžia neribotai naudoti, platinti ir dauginti bet kokioje laikmenoje, jei originalus darbas yra tinkamai cituojamas [67].

For more information:1950477648nn@gmail.com