Spermidinas mažina intrauterinės hipoksijos sukeltą palikuonių naujagimių miokardo mitochondrijų pažeidimą žiurkėms, slopindamas oksidacinį stresą ir reguliuodamas mitochondrijų kokybės kontrolę. 1 dalis

Abstraktus

Fonas: Intrauterinė hipoksija (IUH) padidina palikuonių širdies ir kraujagyslių ligų riziką. Kaip reaktyviųjų deguonies rūšių (ROS) siurblys, poliamino spermidinas (SPD) yra būtinas embriono ir vaisiaus išlikimui ir augimui. Tačiau reikia atlikti tolesnius BPD apsaugos ir IUH sukeltų palikuonių širdies pažeidimo mechanizmų tyrimus.

Cistanche glikozidas taip pat gali padidinti SOD aktyvumą širdies ir kepenų audiniuose ir žymiai sumažinti lipofuscino ir MDA kiekį kiekviename audinyje, efektyviai pašalindamas įvairius reaktyvius deguonies radikalus (OH-, H2O₂ ir kt.) ir apsaugodamas nuo DNR pažeidimo. OH-radikalais. Cistanche feniletanoidiniai glikozidai turi tvirtą laisvųjų radikalų šalinimo gebėjimą, didesnį redukcinį gebėjimą nei vitaminas C, pagerina SOD aktyvumą spermos suspensijoje, sumažina MDA kiekį ir turi tam tikrą apsauginį poveikį spermos membranos funkcijai. Cistanche polisacharidai gali sustiprinti SOD ir GSH-Px aktyvumą eksperimentiškai senstančių pelių eritrocituose ir plaučių audiniuose, kuriuos sukelia D-galaktozė, taip pat sumažinti MDA ir kolageno kiekį plaučiuose ir plazmoje bei padidinti elastino kiekį. geras sugeriantis poveikis DPPH, pailgina senstančių pelių hipoksijos laiką, pagerina SOD aktyvumą serume ir lėtina fiziologinę plaučių degeneraciją eksperimentiškai senstančiose pelėse Dėl ląstelių morfologinės degeneracijos, eksperimentai parodė, kad Cistanche pasižymi geru antioksidaciniu gebėjimu. ir gali būti vaistas, skirtas odos senėjimo ligų prevencijai ir gydymui. Tuo pačiu metu Cistanche esantis echinakozidas turi didelį gebėjimą sunaikinti DPPH laisvuosius radikalus ir geba pašalinti reaktyviąsias deguonies rūšis ir užkirsti kelią laisvųjų radikalų sukeltam kolageno skaidymui, taip pat turi gerą atkuriamąjį poveikį timino laisvųjų radikalų anijonų pažeidimams.

Spustelėkite Cistanches Herba, skirta kovoti su senėjimu

【Daugiau informacijos:george.deng@wecistanche.com / WhatApp:86 13632399501】

Tikslai: Šio tyrimo tikslas buvo ištirti prenatalinio SPD gydymo prevencinį poveikį IUH sukeltam širdies pažeidimui naujagimių žiurkių palikuonims ir pagrindinį su mitochondrijomis susijusį mechanizmą.

Metodai: IUH žiurkės modelis buvo nustatytas veikiant 10 procentų O2 septynias dienas prieš terminą. Tuo tarpu septynias dienas nėščioms žiurkėms buvo skiriamas SPD (5 mg.kg -1.d-1; ip). Vienos dienos palikuonių žiurkės buvo paaukotos, siekiant įvertinti keletą parametrų, įskaitant augimo vystymąsi, širdies pažeidimus, kardiomiocitų dauginimąsi, miokardo oksidacinį stresą, ląstelių apoptozę ir mitochondrijų funkciją, ir turėti mitochondrijų kokybės kontrolę (MQC), įskaitant mitofagiją, mitochondrijų biogenezę ir mitochondrijų sintezė/skilimas. In vitro eksperimentuose pirminiai kardiomiocitai 24 valandas buvo hipoksija su SPD arba be jo.

Rezultatai: IUH sumažino kūno svorį, širdies svorį, širdies Ki67 ekspresiją, SOD aktyvumą ir CAT bei adenozino 5'-trifosfato (ATP) lygį ir padidino BAX/BCL2 ekspresiją ir TUNEL teigiamų branduolių skaičių. Be to, IUH taip pat sukėlė mitochondrijų struktūros anomalijas, disfunkciją ir sumažino mitofagiją (sumažėjo mitofagosomų skaičius), susilpnėjo mitochondrijų biogenezė (sumažėjo SIRT-1, PGC-1, NRF-2 ekspresija ir TFAM) ir sukėlė dalijimosi / sintezės disbalansą (padidėjo mitochondrijų fragmentų procentas, padidėjo DRP1 ekspresija ir sumažėjo MFN2 ekspresija) miokarde. Keista, bet gydymas SPD normalizavo IUH sukeltų parametrų pokyčius. Be to, SPD taip pat užkirto kelią hipoksijos sukeltam ROS kaupimuisi, mitochondrijų membranos potencialo skilimui ir mitofagijos sumažėjimui kardiomiocituose.

Išvada: Gydymas motinos SPD sukėlė IUH sukeltą širdies pažeidimą naujagimių žiurkių palikuonims, pagerindamas miokardo mitochondrijų funkciją per antioksidaciją ir antiapoptozę bei reguliuodamas MQC.

1. Fonas

Epidemiologiniai ir tyrimai su gyvūnais rodo, kad adv se intrauterinė aplinka yra susijusi su padidėjusia širdies ir kraujagyslių ligų rizika suaugusiesiems (1). Prenatalinė hipoksija, dažniausiai pasitaikanti nepalanki intrauterinė aplinka, gali priversti vaisius nesugebėti realizuoti savo genetiškai nulemto augimo potencialo, kuris pasireiškia augimo sulėtėjimu ir organų funkcijų pažeidimu pavasario pradžioje (2). Lėtinė vaisiaus hipoksija dažnai atsiranda dėl nėštumo, kai padidėja placentos kraujagyslių pasipriešinimas, pvz., priešklampsija, tarpnėštumas dideliame aukštyje arba motinos kvėpavimo takų ligos. Dar svarbiau, kad trečdalį jų paveikia obstrukcinis miego apnėjos hipoventiliacijos sindromas (OSAHS) vėlyvuoju nėštumu, taip pat jis yra susijęs su gestacinės hipertenzijos sindromo išsivystymu. Svarbiausias patofiziologinis SAHS pokytis yra lėtinė protarpinė hipoksija (3, 4). Kai kuriuose gyvūnų modeliuose intrauterinė hipoksija (IUH) sumažina širdies veiklos efektyvumą, sukelia diastolinę ir sistolinę disfunkciją, hipertrofinį augimą, sulėtėjo kardiomiocitų proliferaciją ir uždelstą kardiomiocitų brendimą vaisiaus ir naujagimio širdyje, todėl padidėja širdies sutrikimų rizika suaugusiems palikuonims. 5). Lėtinės hipoksijos programavimo poveikis daugiausia gali paaiškinti mechanizmą kritiniais širdies vystymosi etapais, dėl kurių sustiprėja širdies oksidacinis stresas ir padidėja palikuonių ląstelių apoptozė (6-9). Vystymosi programavimo sąvoka yra prasminga, nes mūsų fiziologija ankstyvuoju gyvenimo būdu yra daug lankstesnė ir plastiškesnė. Intrauterinė būklė lemia ir programuoja mūsų gyvenimo fiziologijos ir medžiagų apykaitos sąvokas. Atitinkamai, vaisiaus adaptacinis atsakas į IUH sukelia suaugusiųjų širdies ir kraujagyslių ligų vystymąsi (10). Mitochondrijos yra sudėtingos organelės, atliekančios lemiamą vaidmenį ląstelių energijos generavime ir daugybėje rūsio signalizacijos įvykių. Struktūrinis ir funkcinis mitochondrijų vientisumas yra labai svarbus kardiomiocitų išlikimui, o kai pažeidžiama mitochondrijų homeostazė, gali išsivystyti carac ligos. Pastaruoju metu keliuose tyrimuose pagrindinis dėmesys buvo skiriamas lėtinės prenatalinės hipoksijos sukeliamos mitochondrijų disfunkcijos vaidmeniui tarpininkaujant palikuonių širdies pažeidimams. Buvo pranešta, kad buvo sutrikusi mitochondrijų ir kvėpavimo funkcija, o kelių mitochondrijų molinių taisyklių išraiška pakeitė perinatalinę širdį, kuri buvo veikiama IUH (11). Be to, IUH sumažina mitochondrijų kompleksų fermentų aktyvumą ir širdies pjūvio disfunkciją palikuonims po miokardo išemijos (12). Atitinkamai, šiuo tyrimu buvo siekiama atrasti naujų palikuonių molekulinį ryšį tarp prenatalinės hipoksijos, oksidacinio streso, mitochondrijų disfunkcijos ir širdies pažeidimo (13).

Šios didelio tūrio mitochondrijų sistemos vystymasis ir brendimas miokarde daugiausia vyksta perinatalinio ir postnatalinio vystymosi stadijose, visų pirma dėl širdies metabolinio poslinkio nuo gliukozės arba riebalų rūgščių naudojimo adenozino 5'-trifosfato (ATP) generavimui po gimimo. (14). Nauji įrodymai rodo, kad mitochondrijų kokybės kontrolės (MQC) mechanizmai yra esminiai kardiomiocitų brendimo veiksniai (15). Mitochondrijų kokybės kontrolė, daugiausia apimanti mitochondrijų biogenezę, mitofagiją kartu su dinamika, tiksliai suderintu reguliavimo tinklu, reguliuoja mitochondrijų kiekį ir kokybę bei pagerina mitochondrijų funkciją ir kardiomiocitų išgyvenimą streso sąlygomis (16). Peroksisomų proliferatoriai-aktyvina receptorius (PPAR) koaktyvatorius 1 (PGC{8}}) ​​vaidina lemiamą vaidmenį skatinant mitochondrijų biogenezę ir funkciją širdyje (17). Peroksisomų proliferatoriai-aktyvina receptorius koaktyvatorius 1 / (-/-) pelių širdyse yra brendimo defekto ir rimtų mitochondrijų funkcijos ir tankio anomalijų požymiai (18). Be to, ištrynus mitofagijos tarpininką Parkiną, naujagimių stadijoje išvengiama morfologinio ir funkcinio mitochondrijų brendimo (19). Mitochondrijos yra labai dinamiškos organelės, kuriose nuolat vyksta dalijimasis ir sintezės įvykiai, susiję su jų funkcija. Vėlyvuoju embrioniniu periodu, automobiliams būdinga genetinė mitochondrijų sintezės pro abliacija MFN1 ir MFN2 pelėms po gimimo rodo rimtą mitochondrijų disfunkciją ir išsivysto kardiomiopatija (20). Stebėtina, kad neseniai atliktas tyrimas atskleidė, kad lėtinis hiperaktyvumas sutrikdė mitochondrijų dinamiką vaisiaus gui ir kiaulės priekinėje smegenyse (21). Atitinkamai, MQC gali veikti kaip IUH naujagimių palikuonių miokardo pažeidimo vystymosi židinys. Tačiau mažai žinoma apie prenatalinės hipoksijos poveikį naujagimių širdies MQC sistemai ir MQC disfunkcijos poveikį naujagimių širdies sveikatai. Šis tyrimas perėmė šią misiją, siekiant ištirti su mitochondrijomis susijusį IUH sukelto miokardo pažeidimo mechanizmą naujiems palikuonims ir toliau tirti prevencines strategijas, kaip sumažinti IUH širdies pažeidimą.

Poliaminai (PA), įskaitant putresciną (PU), spermidiną (SPD) ir sperminą (SP), yra beveik visuose gyvuose organizmuose ir yra būtini embriono ir vaisiaus išlikimui, augimui ir vystymuisi (22-24). . Tyrimai parodė, kad avys, paveiktos IUH, gali pagerinti embriono displaziją, papildydamos egzogeninius poliaminus (25, 26). Be to, vis gausėjanti literatūra rodo poliaminų vaidmenį šalinant laisvuosius radikalus ir apsaugant DNR, baltymus ir lipidus nuo žalingos oksidacinio streso žalos. Taip pat paaiškėjo, kad poliamino papildai padidina modelių organizmų gyvenimo trukmę dėl antioksidantų, priešuždegiminių ir mitofagiją sukeliančių bandymų (27-29). Naujausi tyrimai parodė, kad SPD papildymas mityboje apsaugo širdį ir pailgina pelių ir žmonių gyvenimo trukmę, nes skatina mitofagiją ir mitochondrijų kvėpavimą bei gerina širdies veiklą (30, 31). Dar svarbiau, kad anksčiau pranešėme, kad motinos hipoksinis poveikis vėlyvose vaisiaus vystymosi stadijose lėmė pasenusią anų sąrašą ir padidino poliaminų katabolizmą naujagimių žiurkių kaulo audinyje. SPD užkirto kelią širdies sužalojimui venų dienų palikuonių žiurkėms, kurios buvo paveiktos IUH, nes slopino mitochondrijų mąstymą (32).

2. Tikslai

Šiame tyrime iškelta hipotezė, kad IUH sukelia mitochondrijų struktūros ir funkcijų deficitą, padidindamas oksidacinį stresą ir sunaikindamas MQC mechanizmą naujagimio širdyje, o motinos SPD gydymas gimdoje sumažins miokardo pažeidimą, sumažindamas mitochondrijų vystymosi programą. Šis tyrimas gali prisidėti prie IUH palikuonių prevencinių ar terapinių strategijų kūrimo, siekiant užkirsti kelią suaugusiųjų širdies ir kraujagyslių ligoms.

3. Metodai

3.1. Gyvūnai

Wistar žiurkių patinai ir patelės (3 mėnesių amžiaus) buvo įsigyti iš Harbino medicinos universiteto laboratorinių gyvūnų katedros. Visas procedūras patvirtino Harbino medicinos universiteto (Kinija) etikos peržiūros komitetas, o visi eksperimentai buvo atlikti pagal Nacionalinių sveikatos institutų gaires. Žiurkės, kurių patinų ir patelių santykis buvo 2:1, buvo atsitiktinai patalpintos į narvą poravimuisi. Makšties tepinėlis buvo atliktas kitą dieną, siekiant nustatyti spermatozoidų buvimą makšties kamščiuose arba makšties tepinėliuose, o tai patvirtinta kaip nulinė nėštumo diena. Nėščios žiurkės buvo laikomos patalpoje, kurioje buvo kontroliuojama drėgmė (60 proc.) ir temperatūra (21 laipsnis), o šviesos ir tamsos ciklas buvo 12:12 valandų.

3.2. Intrauterinės hipoksijos modelis

Nuo 15 iki 21 nėštumo dienos hipoksijos grupės žiurkės (n=10) buvo patalpintos į uždarą organinio stiklo kamerą, įšvirkščiamos oro ir azoto ir stebimos deguonies analizatoriumi (Pro OX12{13). }}; BioSpherix, Niujorkas, JAV) ir keturias valandas per dieną įkvėpti su 10 procentų deguonies. Arterinio kraujo mėginiai buvo paimti iš dešinės šlaunikaulio arterijos, išmatuotos kraujo dujų ir pH vertės, siekiant palaikyti 50 - 55 mmHg dalinį arterinio deguonies slėgį, kraujo prisotinimas deguonimi buvo palaikomas 80 - 85 proc. buvo atliktos specialios procedūros, kaip aprašyta anksčiau (32). Eksperimentinės žiurkių patelės buvo atsitiktinai suskirstytos į keturias grupes: kontrolinę grupę (kontrolinę), intrauterinės hipoksijos grupę (Hpx), intrauterinę hipoksijos ir spermidino grupę (Hpx-Spd) ir intrauterinę hipoksiją su spermidinu ir inhibitoriais (Hpx-Spd-DFMO). ). Šešioms žiurkėms vienai grupei buvo sušvirkšta į pilvaplėvės ertmę 15-ą - 21-ą nėštumo dieną. Žiurkėms buvo duodama 0,9 proc. fiziologinio tirpalo (1 ml/kg/d) kontrolinėje ir Hpx grupėje, SPD (5 mg/kg/d) Hpx-Spd grupėje ir SPD (5 mg/kg/d) ir difuorometilą. -L-ornitinas (DFMO, pagrindinio poliamino sintezės fermento ODC inhibitorius) (5 mg/kg/d) atitinkamai Hpx-Spd-DFMO grupėje. Po gimdymo 1-dienų senumo naujagimiai buvo paaukoti, o jų širdys buvo ištrauktos tolesniems eksperimentiniams tyrimams.

3.3. Histologinė analizė

Žiurkių kairiojo skilvelio audinys buvo supjaustytas < 1 cm storio, fiksuotas 4 procentų paraformaldehidu, dehidratuotas alkoholiu ir įterptas į parafiną. Įterptas parafinas buvo supjaustytas 5 mm storio griežinėliais, po to džiovinamas pastovioje 60 laipsnių orkaitės temperatūroje, nuvaškuotas ksilenu ir po to dažomas hematoksilino-eozinu (HE). Audinių griežinėliai buvo stebimi siekiant įvertinti širdies morfologijos ir struktūrų pokyčius optiniu mikroskopu (Eclipse E200; Nikon, Tokijas, Japonija).

3.4. Imunofluorescencinė analizė

Ki67 imunofluorescencinis dažymas buvo atliktas, kaip aprašyta anksčiau (33). Trumpai tariant, žiurkių kairiojo skilvelio audinys buvo fiksuotas 4 procentų formalinu, įterptu į parafiną; vaško šalinimas, drėkinimas ir antigenų taisymas buvo pirmą kartą užbaigti. Tie audiniai buvo užblokuoti 0,5 procento galvijų serumo albumino 2 valandas, o po to inkubuoti su Ki67 triušio monokloniniu antikūnu (1: 100, AF1738, Beyotime, Kinija) 4 laipsnių temperatūroje per naktį. Po plovimo PBS, audinys buvo inkubuojamas su Alexa fluoru pažymėtu ožkų anti-triušio IgG (1: 500, A 0468, Beyotime, Kinija) ir nudažytas DAPI branduoliams. Vaizdai buvo peržiūrėti ir nuskaityti naudojant lazerinę konfokalinę mikroskopiją (OLYMPUS, FV1000, Japonija). Programinė įranga buvo naudojama sujungtų vaizdų kolokalizacijos analizei.

3.5. Fibrozės kiekybinis nustatymas

Širdies fibrozė buvo įvertinta Massono dažymu trichromu. Kaip aprašyta aukščiau, naujagimių žiurkių širdies audinio sekcijos buvo devaškuotos ir hidratuotos standartiniais metodais, o po to nudažytos Massono trichromu pagal protokolus. Kiekvienai širdžiai buvo naudojami du negretimi skerspjūviai. Fibrozinio ploto procentinė dalis bendrame kairiojo skilvelio miokardo plote buvo analizuojama naudojant ImageJ programinę įrangą, vl.52 (NIH, Bethesda, MD).

3.6. TdT tarpininkaujantis dUTP slapyvardžio pabaigos žymėjimas ir apoptotinių ląstelių matavimai

Apoptozinių ląstelių skaičiui vienos dienos naujagimių žiurkių širdyse nustatyti buvo naudojamas TdT sukeltas dUTP slapyvardžio žymėjimo (TUNEL) tyrimas. Širdies audiniai buvo apdoroti pagal mūsų anksčiau aprašytą procedūrą, naudojant ląstelių mirties aptikimo rinkinį (Roche, Vokietija) pagal gamintojo instrukcijas. Trys skaidrės iš kiekvieno bloko buvo įvertintos pagal apoptozinių ląstelių procentą. Keturi skaidrių laukai buvo atsitiktinai ištirti su 200 kartų padidinimu. Iš viso kiekviename lauke buvo suskaičiuota 100 ląstelių.

3.7. Antioksidacinio fermento aktyvumo matavimas

Superoksido dismutazės (SOD) ir katalazės (CAT) aktyvumas buvo matuojamas naudojant komercinius rinkinius (SOD: A001-3- 1 ir CAT: A007-1-1; Jiancheng Bio. Institute, Nanjing, Kinija) su spektrofotometru (Perkin- Elmer, Norwalk, CT, Jungtinės Amerikos Valstijos). Pagal gamintojo nurodymus operacija buvo baigta, baltymų koncentracija matuojama naudojant bicinchonino rūgšties metodą (Pierce, Rockford, Jungtinės Amerikos Valstijos), standartiškai naudojant galvijų serumo albuminą (BSA) (34).

3.8. Adenozino 5'-trifosfato kiekio matavimas

ATP kiekis širdies audinyje buvo matuojamas naudojant ATP tyrimo rinkinį (S0026B, Beyotime, Bio. Institute, Kinija). Pagal gamintojo nurodymus, lizatas buvo pridėtas proporcingai pagal audinio masę, homogenizuotas stikliniu homogenizatoriumi, o po to centrifuguojamas 4 laipsniais 12000 g. Supernatantas buvo paimtas ir ATP kiekis kiekviename mėginyje buvo aptiktas luminometru (NanoDrop, Nanodrop2000, Thermo, JAV) BCA rinkiniu (P0012s, Beyotime, Bio. Institute, Kinija). Bicinchonino rūgšties metodas buvo naudojamas baltymų koncentracijai nustatyti ir ATP koncentracijai paversti nmol/g baltymo.

3.9. Transmisijos elektronų mikroskopija

Širdies viršūninis audinys buvo išpjaustytas į maždaug 1 mm × 1 mm × 1 mm mažus gabalėlius ir fiksuotas glutaraldehido fosfato buferyje 4 laipsnių kampu. Po įprasto dehidratavimo, mirkymo, įterpimo ir dažymo buvo padarytos itin plonos 50 - 70 nm pjūviai. Širdies audinio ultrastruktūra buvo stebima transmisijos elektronų mikroskopu (TEM) ir nufotografuota (H600 Hitachi, Tokijas, Japonija). Pavienės mitochondrijos ir miofilamentai buvo pažymėti 10 000 kartų padidinus naudojant „Image J“ programinės įrangos versiją 1.80 (Nacionaliniai sveikatos institutai), o jų plotai buvo išmatuoti iš kiekvienos širdies (35). Tuo tarpu buvo identifikuoti < 1 µm3 mitochondrijų fragmentai, kurie nebuvo padalinti (dažniausiai apvalūs), o vidutinis mitochondrijų fragmentų procentas vaizdo lauke buvo suskaičiuotas naudojant mitochondrijų fragmentacijos indeksą (MFI).

3.10. Mitochondrijų izoliacija

Mitochondrijos buvo išskirtos 4 laipsniu, naudojant diferencinę centrifugą su Mitochondria Isolation Kit (Beyotime Biotechnology, Šanchajus, Kinija). Trumpai tariant, šviežias širdies audinys buvo supjaustytas į audinio gabalus ir centrifuguojamas su 10 tūrių iš anksto atšaldyto PBS, supernatantas buvo išmestas, nuosėdos buvo virškinamos tripsinu 20 minučių, pridėtas izoliacinis buferis A centrifuguojamas, supernatantas perkeltas į kitą. mėgintuvėlyje, vėl centrifuguojamas, o nusodinta frakcija buvo izoliuotos mitochondrijos. Galutinė širdies mitochondrijų granulė buvo resuspenduota homogenizuojančiame buferyje, laikoma ant ledo ir naudojama mitochondrijų kvėpavimo funkcijos eksperimentams per 4 valandas.

3.11. Mitochondrijų deguonies suvartojimo matavimas

Mitochondrijų deguonies suvartojimas buvo matuojamas Clark tipo deguonies elektrodu (Hansatech Instruments, Norfolkas, JK) mitochondrijų kvėpavimo buferyje. Piruvatas (5 mM) ir malatas (5 mM) buvo naudojami kaip substratas I kompleksą turinčioms mitochondrijoms, kurių galutinė koncentracija buvo 500 µg baltymo/ml. ADP stimuliuojamas deguonies suvartojimas (3 būsenos kvėpavimas) buvo matuojamas esant 200 µM ADP, ir buvo stebimas nuo ADP nepriklausomas deguonies suvartojimas (4 būsenos kvėpavimas). Kvėpavimo kontrolės santykis (RCR, 3 būsena padalinta iš 4 būsenos) atspindi deguonies suvartojimą fosforilinimo (sujungimo) būdu. Procedūros buvo tęsiamos, kaip aprašyta anksčiau (36).

3.12. Western blot analizė

Širdies audinių mėginys buvo paimtas ir laikomas -80 laipsnio temperatūroje. Užšaldyti kairiojo skilvelio širdies audiniai buvo homogenizuoti lediniame RIPA lizės buferyje (Beyotime Inc., Šanchajus, Kinija P0013B). Baltymų koncentracijos buvo kiekybiškai įvertintos naudojant BCA baltymų tyrimo rinkinį (Beyotime Inc., Šanchajus, Kinija P0006C). Mėginiai, kuriuose yra viso baltymo, buvo atskirti 10 procentų (m/v) SDS-PAGE ir perkelti ant PVDF membranos (Millipore, Bedford, MA, Jungtinės Valstijos). Buvo naudojami šie antikūnai: GAPDH (1:2000,10494-1-AP), MFN2 (1:1000,12186-1- AP), SIRT-1 (1:1000,{{16) }}AP), NRF-2 (1:600,16396-1-AP), TFAM (1:1000,19998-1-AP) ir BAX (1,1000,509599-2-Ig) buvo įsigyti iš „Proteintech“ (WuHan, Kinija), BCL2 (1: 2000, sc-7382) ir DRP1 (1:1000, sc-271583) buvo įsigyti iš „Santa Cruz Biotechnology“ (Dalasas, Teksasas) ir PGC -1 (1:1000, ab106814, Abcam, Kembridžas, MA, JK). Antrinis antikūnas (krienų peroksidaze pažymėtas ožkos anti-triušio IgG) buvo iš Beyotime Corporation (Šanchajus, Kinija). Baltymų juostų intensyvumas buvo kiekybiškai įvertintas naudojant Fluor Chem Chemiluminescence gelio vaizdavimo sistemą (Protein Simple, JAV). Baltymų juostų optinis tankis buvo analizuojamas naudojant Image J programinės įrangos versiją l.52 (NIH, Bethesda, MD).

3.13. Hipoksinis kardiomiocitų modelis

Naujagimių žiurkių kardiomiocitai (NRMC) buvo išskirti ir auginami standartiniais metodais, kaip aprašyta anksčiau (32). Trumpai tariant, trijų dienų naujagimių žiurkių širdys buvo ekstrahuotos, susmulkintos, kultivuojamos ir tada suvirškintos 0,25 proc. tripsino ir 0,02 proc. EDTA (Beyotime Biotechnology, Šanchajus, Kinija). Po centrifugavimo nuosėdos buvo perkeltos į DMEM, papildytą 10 procentų veršelio vaisiaus serumo (Biolot, Rusija), ir inkubuojamos drėgname ore, kuriame yra 5 procentai 2. Praėjus trims dienoms po pasėjimo, ląstelės buvo patalpintos į stiklinę hipoksinę kamerą (Biospherix OxyCycler C42). , Redfield, NY) ir 8 minutes pripildytas azotu, kad pašalintų likusį deguonį. Šie kardiomiocitai buvo atsitiktinai suskirstyti į šias grupes: (1) Kontrolinė grupė (kontrolė), ląstelės kultivuojamos normaliomis inkubacijos sąlygomis; (2) hipoksijos (Hpx) grupė, ląstelės dedamos į hipoksinę kamerą 24 val., o paskui normaliai kultivuojamos 24 valandas; (3) Hpx-Spd grupė, ląstelės dedamos į hipoksinę kamerą ir inkubuojamos su 10 µmol/L SPD 24 valandas; (4) Hpx-SpdDFMO grupė, ląstelės dedamos į hipoksinę kamerą ir inkubuojamos su 10 µmol/L SPD plius 2 mmol/L DFMO 24 valandas.

3.14. Reaktyviųjų deguonies rūšių matavimas

ROS generacija buvo matuojama naudojant dihidroetidžio (DHE) dažymo testą (kat. Nr. S0063, Beyotime, Kinija). Trumpai tariant, pirminiai kardiomiocitai buvo inkubuojami su 5 µmol / L DHE 37 laipsnių temperatūroje 30 minučių, plaunami PBS ir po to perkeliami po mikroskopu, kad būtų galima stebėti fluorescencijos intensyvumo pokyčius. Vaizdai buvo paimti naudojant Olympus FluoView FV1000 fluorescencinį mikroskopą (Olympus Optical Co., Ltd., Takachiho, Japonija), kai sužadinimo bangos ilgis yra 535 nm, o didžiausias emisijos bangos ilgis buvo 610 nm, n> 20 ląstelių vienoje grupėje.

3.15. Mitochondrijų membranos potencialo nustatymas

Dažiklis tetrametilrodamino etilo esteris (TMRE) yra teigiamai įkrautas ir gali būti selektyviai išsidėstęs mitochondrijose. Jis plačiai naudojamas mitochondrijų membranos potencialui (∆Ψm) nustatyti. Trumpai tariant, TMRE dažymo darbinis tirpalas, kurio koncentracija yra 200 µmol / L, buvo pridėta prie sugrupuotų apdorotų kardiomiocitų, kruopščiai sumaišoma ir 20 minučių įdėta į ląstelių inkubatorių 37 laipsnių temperatūroje. Supernatantas buvo išsiurbtas, o ląstelės plaunamos PBS ir perkeltos į apverstą mikroskopą, kad būtų galima stebėti fluorescencijos intensyvumo pokyčius. Sužadinimo bangos ilgis buvo 549 nm, o spinduliuotės šviesa – 579 nm. Raudonos fluorescencijos intensyvumas rodė ∆Ψm pokytį, n > 20 ląstelių vienoje grupėje.

3.16. Mitochondrijų ir lizosomų lokalizacijos eksperimentas

Pagal instrukcijas Mito-Tracker Green (NO.C1048, Beyotime, Kinija) ir Lyso-Tracker Red (NO.C1046, Beyotime, Kinija) naudojo mitochondrijų ir lizosomų kolokalizacijos analizę. NRCM buvo pakrautas su 200 nM MitoTracker Green FM ir 50 nM LysoTracker Red HBSS 30 minučių prieš eksperimentus, ląstelės buvo plaunamos PBS, o tada ląstelių vaizdai buvo gauti naudojant Olympus FluoView FV1000 fluorescencinį mikroskopą. 488 nm lazerio linija buvo naudojama MitoTracker Green fluorescencijai sužadinti, matuojama nuo 505 iki 515 nm. LysoTracker Red buvo naudojama 577 nm lazerio linija, kurios matavimas buvo 590 nm. Raudonos ir žalios spalvos pikselių intensyvumo perdanga buvo nustatyta naudojant Nikon Eclipse Microscope kiekybinio nustatymo programinę įrangą, n > 20 ląstelių vienoje grupėje.

3.17. Statistinė analizė

Visi eksperimentinių grupių duomenys buvo lyginami naudojant vienkryptį ANOVA, po to Bonferroni post hoc testą su GraphPad Prism programinės įrangos versija 8 (GraphPad Software Inc., La, Jolla.CA) ir SPSS programinės įrangos versija 17.1 (SPSS, Chicago, IL, United). valstybės). Duomenys buvo išreikšti kaip vidurkis ± SEM, o reikšmingumo lygis nustatytas kaip P < 0,05.

4. Rezultatai

4.1. Palikuonys ir širdies charakteristikos

Buvo išmatuotas kūno svoris (KW) ir širdies svoris (HW), taip pat buvo apskaičiuotas KW ir KW santykis (HW / KW) (1 pav.). Rezultatai parodė, kad dėl intrauterinės hipoksijos sumažėjo naujagimių žiurkių KW ir KW, o jų KW/KW padidėjo. Palyginti su IUH grupe, naujagimių žiurkių BW ir HW SPD grupėje padidėjo (P < 0.05), o HW/BW sumažėjo (P < 0). 05); Lyginant su SPD grupe, DFMO gydymo grupės KW ir KW sumažėjo (P < 0,05), o KW/KW reikšmingai padidėjo (P < 0,05).

4.2. SPD poveikis miokardo morfologinei struktūrai, ląstelių dauginimuisi ir fibrozei naujagimiams, paveiktiems

Širdies HE dažymo rezultatai parodė, kad vienadienių palikuonių, paveiktų IUH, širdyse buvo patinimas ir laisvai išsidėsčiusios miokardo skaidulos. Tačiau IUH širdys, gydytos SPD, išlaikė priimtiną miokardo audinio struktūrą (2A pav.). Toliau mes įvertinome dvibranduolių kardiomiocitų skaičių su HE dažytu audinio pjūviu; dvibranduolinių kardiomiocitų skaičius buvo didesnis IUH grupėje nei kontrolinėje grupėje (P < 0.05). Lyginant su IUH grupe, dvibranduolių kardiomiocitų dalis SPD gydymo grupėje reikšmingai sumažėjo (P < 0.05); DFMO susilpnino SPD poveikį (P < 0.05) (2C pav.). Imunofluorescencijos metodu toliau aptikome Ki67 (ląstelių proliferacijos žymeklio) ekspresiją žiurkės miokarde. Kuo didesnė Ki67 išraiška, tuo stipresnė rausva fluorescencija sujungiant raudoną ir mėlyną (2E pav.). Rezultatai parodė, kad lyginant su kontroline grupe, Ki67 ekspresija IUH grupėje reikšmingai sumažėjo (P < 0.05), Ki67 ekspresija reikšmingai padidėjo po SPD skyrimo (P < { {28}}.05), o SPD poveikį DFMO panaikino (P < 0,05) (2F pav.). Šie rezultatai rodo, kad SPD gali slopinti priešlaikinį kardiomiocitų pasitraukimą iš IUH sukelto ląstelių ciklo ir skatinti kardiomiocitų dauginimąsi naujame palikuonyje, paveiktame IUH. Tada naudojome Masson dažymą, kad nustatytų miokardo kolageno kiekio pokyčius, ir įvertinome miokardo fibrozę matuodami kolageno plotą (2 juosta ir D). Nustatėme, kad naujagimių žiurkių, paveiktų IUH, širdyse padidėjo miokardo kolageno nusėdimas (P < 0,05), kurio lygis buvo didesnis, palyginti su kontroline grupe. Priešingai, miokardo fibrozės plotas po gydymo SPD reikšmingai sumažėjo (p < 0,05). Tačiau, palyginti su SPD gydymo grupe, fibrozės plotas reikšmingai padidėjo HpxSpd-DFMO grupėje (P < 0,05).

4.3. Spermidino poveikis miokardo mitochondrijų struktūrai, kvėpavimo funkcijai ir adenozino 5'-trifosfato kiekiui naujagimių palikuonių, paveiktų intrauterinės hipoksijos

Širdies audinio ultrastruktūrinės struktūros pokyčiai ir mitochondrijų charakteristikos buvo išanalizuoti TEM (3A pav.). Vaizdo J programinė įranga buvo naudojama norint kiekybiškai įvertinti mitochondrijų kiekį procentais (mitochondrijų plotas visoje ląstelės srityje) ir mitochondrijų plotas (3B ir C paveikslai). Rezultatai parodė, kad kontrolinėje grupėje miokardo miofilamentai buvo tvarkingai išsidėstę, sarkomerų struktūra buvo aiški, mitochondrijos kompaktiškos, matrica tankesnė, o mitochondrijų krioslės tvarkingai išsidėsčiusios. Tačiau mitochondrijos išsipūtė, kai kuriuose IUH grupės kardiomiocituose buvo pastebėta atsipalaidavusi matrica ir sumažėjęs tankis. Palyginti su kontroline grupe, sumažėjo tiek mitochondrijų dalis kardiomiocituose, tiek mitochondrijų plotas (P < 0.05). Tačiau SPD gydytų žiurkių širdyse miokardo miofilamentai buvo tvarkingi, sarkomero struktūra buvo aiški, mitochondrijų matrica buvo kompaktiška, o mitochondrijų patinimas sumažėjo. Palyginti su IUH grupe, mitochondrijų dalis kardiomiocituose padidėjo (P < 0.05), o mitochondrijų plotas padidėjo (P < 0,05). DFMO slopino šiuos SPD sukeltus efektus (p < 0,05).

Mes naudojome piruvatą / malatą kaip substratą, kad įvertintume mitochondrijų kvėpavimo funkciją, įskaitant 3 ir 4 būsenų kvėpavimo dažnį ir RCR (3D pav. – F). Pastebėjome, kad lyginant su kontroline grupe, 3 ir 4 būsenų kvėpavimo dažnis ir IUH grupės RCR buvo žymiai mažesni (P < 0.{{10}}5). Įdomu tai, kad 3 ir 4 būsenų RCR atsistatė po gydymo SPD (P < 0.05). Priešingai, šis SPD poveikis buvo reikšmingai slopinamas DFMO gydymo grupėje (P < 0,05). Panašiai, lyginant su kontroline grupe, IUH grupėje miokardo ATP kiekis reikšmingai sumažėjo (P < 0,05). Palyginti su IUH grupe, ATP kiekis labai padidėjo SPD gydytoje grupėje (P < 0,05), o DFMO susilpnino SPD poveikį (P <0,05) (3G pav.). Šie duomenys rodo, kad SPD gali apsaugoti miokardo mitochondrijų struktūrą ir funkcijų pažeidimus bei užkirsti kelią ATP lygio mažėjimui naujagimių palikuonių žiurkėms, paveiktoms IUH.

【Daugiau informacijos:george.deng@wecistanche.com / WhatApp:86 13632399501】