Špinatų metanolinis ekstraktas susilpnina diabetu sergančių žiurkių tinklainės degeneraciją

Prašau susisiektioscar.xiao@wecistanche.comDaugiau informacijos

Santrauka:Buvo pasiūlyta, kad špinatų metanolinis ekstraktas (SVV) slopina pažangių glikacijos galutinių produktų (AGE) susidarymą, kurių padaugėja diabeto progresavimo metu, todėl svarbu žinoti, ar MVĮ turi teigiamą poveikį diabetinei tinklainei. Šiame tyrime in vitro tyrimai parodė, kad MVĮ slopina glikaciją, karbonilo grupių susidarymą ir redukuotos tiolio grupės išeikvojimą galvijų serumo albumine, inkubuotame arba redukuojančiais cukrais, arba metilglioksaliu. SME poveikis streptozotocino sukeltų cukriniu diabetu sergančių žiurkių (STZ2) tinklainei taip pat buvo tiriamas (n=10) normoglikemijos grupėje, STZ, STZ žiurkėms, gydytoms SME, ir STZ žiurkėms, gydomoms aminoguanidinu (anti-AGE nuoroda). grupė) per 12 savaičių. Tinklainė buvo perpjauta ir nudažyta imuniniu būdu, kad būtų nustatytas ne-karboksimetillizinas (CML), receptorius RAGE, NADPH-Nox4, indukuojama azoto oksido sintazė (iNOS), 3-nitrotirozinas (NT), branduolinis NF-kB, kraujagyslių endotelio augimo faktorius ( VEGF), glijos fibrilinis rūgštinis baltymas (GFAP), S100B baltymas ir TUNEL tyrimas. Lipidų peroksidacija visoje tinklainėje nustatyta malondialdehido (MDA) kiekiu. Rezultatai parodė, kad MVĮ diabetinėje tinklainėje sumažino CML-RAGE lokalizaciją, oksidacinį stresą (NOX4, iNOS, NT, MDA), uždegimą (NF-B, VEGF, S10B, GFAP) ir apoptozę (p.<0.05).therefore, smes="" could="" attenuate="" retinal="" degeneration="" by="" inhibiting="" cml-rage="">

Raktiniai žodžiai:špinatai; diabetinė retinopatija; pažangūs glikacijos galutiniai produktai; oksidacinis stresas; uždegimas; RAGE; karboksimetil-L-lizinas

Norėdami sužinoti daugiau, spustelėkite čia

1. Įvadas

Augalinės dietos buvo susijusios su mažesne rizika susirgti lėtinėmis ligomis, tokiomis kaip nutukimas, 2 tipo diabetas ir koronarinė širdies liga. Špinatai (Spinacia oleracea L.) yra valgoma lapinė daržovė, vartojama visame pasaulyje, nes juose yra daug skaidulų, vitaminų ir mineralų [1,2]. Buvo nustatyta keletas fitocheminių medžiagų, įskaitant chlorofilus, karotenoidus (liuteiną ir zeaksantiną) [3] ir fenolio junginius (flavonus, flavonoidus, kumarinus) [4-8] (žr. 1 priedą). Buvo pranešta, kad špinatai, vartojami kaip maistas, vandenyje tirpus ekstraktas arba liofilizuoto pavidalo, ir jų tilakoidai turi priešvėžinių, nutukimą mažinančių ir hipoglikeminių savybių [9]. Priešuždegiminis špinatų poveikis buvo įrodytas gyvūnų endotoksemijos modeliuose, nutukusiems gyvūnams ir sveikiems žmonėms [9]. Jo antioksidacinis poveikis buvo tiriamas su žmogaus prostatos karcinomos ląstelėmis, gyvūnų modeliais su nutukimu, UV spinduliais apšvitintomis pelėmis ir transgeninės pelės prostatos adenokarcinoma [9,10]. Špinatų metanolinio ekstrakto (SME) antiglikacinis ir priešuždegiminis poveikis buvo tiriamas atitinkamai naudojant zebražuvių gliukozės sukeltą diabetą ir izoproterenolio sukeltą žiurkių miokardo nekrozę [11,12]. MVĮ sumažino glikozilinto hemoglobino ir fruktozamino kiekį, įskaitant glikuotų baltymų kiekį, sumažindama aldozės reduktazės aktyvumą lęšiuko akyje [11]. Pirmiau pateiktos išvados rodo, kad MVĮ gali turėti prevencinį poveikį cukrinio diabeto komplikacijų, tokių kaip diabetinė retinopatija (DR), progresavimui.

DR laipsniškai praranda regėjimą arba aklumą, kuris buvo susijęs su uždegimu, oksidaciniu stresu ir pažangių glikacijos galutinių produktų (AGE) kaupimu[13,14]. AGE sukelia baltymų kryžminimą, keičia struktūrą / funkciją ir jo apykaitą / klirensą. AGE gali susidaryti vykstant nefermentinei reakcijai tarp gliukozės ir laisvos baltymų amino grupės, suformuojant grįžtamuosius tarpinius produktus, tokius kaip Šifo bazės ir Amadori produktai (fruktozaminas)[15]. Kiti AGE formavimo mechanizmai apima „karbonilo streso“ kelią, kai cukrų ir lipidų oksidacija sukuria tarpinius dikarbonilo junginius, tokius kaip glioksalis ir metilglioksalis (MGO), dėl kurių susidaro AGE kaip N:-karboksimetillizinas (CML). 16]. Padidėjęs LML kiekis serume ir stiklakūnyje gali būti biocheminis DR atsiradimo ir progresavimo žymuo [17,18]. Tinklainėje RAGE receptorių aktyvinimas AGE (AGEs-RAGE) sukelia pernelyg didelę glijos fibrilinio rūgštinio baltymo (GFAP) ir priešuždegiminių faktorių ekspresiją, kurią reguliuoja aktyvuoto B branduolio skaidrumo faktorius kappa-lengvosios grandinės stipriklis. ląstelės (NF-kB)[19]. NF-kB teigiamai reguliuoja RAGE ekspresiją, veikdamas kaip teigiamo grįžtamojo ryšio mechanizmas [20].kas yra cistancheKita vertus, didelė S100B, kalcį surišančio baltymo, koncentracija taip pat gali suaktyvinti NF-kB, sukeldama neurouždegimą ir glijos ląstelių aktyvaciją [21]. Per didelis S100B ekspresija astrocituose sukelia neurotoksinį poveikį, pasireiškiantį tinklainės astroglioze [22].

Cistanche gali kovoti su senėjimu

Eksperimentiškai buvo sukurtos strategijos, skirtos išvengti tinklainės pažeidimo. Kai kurios iš kitų augalų išskirtos špinatų fitocheminės medžiagos buvo susijusios su AGE slopinimu ir oksidaciniu stresu [8, 23-26]. Liuteinas, astaksantinas ir kaempferolis apsaugojo žmogaus gautas tinklainės pigmento epitelio ląsteles (ARPE-19) nuo pažeidimų dėl jų anti-AGE, antioksidacinių ir antiapoptozinių savybių [26-28]. Šie rezultatai rodo, kad špinatų fitocheminės medžiagos vaidina svarbų vaidmenį užkertant kelią tinklainės degeneracijai, pavyzdžiui, DR. Kita strategija buvo naudoti aminoguanidiną (AG) kaip stiprų glikacijos ir iNOS aktyvumo inhibitorių, susilpninantį LML kaupimąsi ir reaktyvių dikarbonilinių pirmtakų susidarymą žiurkėms [29]. Tačiau daugiacentriniame atsitiktinių imčių klinikiniame tyrime, kuriame dalyvavo 690 diabetu sergančių pacientų, teigiamas poveikis nebuvo aiškiai nustatytas [30].

Tinklainės degeneracijos pokyčiai hiperglikemijos sąlygomis buvo mažai ištirti. Todėl įdomu sužinoti, ar MVĮ apsaugo tinklainės sluoksnius nuo pažeidimų, susijusių su jos anti-AGE, antioksidacinėmis ir priešuždegiminėmis savybėmis streptozotocino sukeltų diabetinių žiurkių tinklainėje.

2. Medžiagos ir metodai

2.1. Špinatų metanolinio ekstrakto (MVĮ) paruošimas

Švieži špinatų (S.oleracea L.) lapai buvo nuskinti rudens-žiemos sezono metu Pueblos provincijos (Meksika) žemės ūkio lauke ir identifikuoti botaniko Nacionalinio politechnikos instituto herbariume (IPN, Meksikas, Meksika). Kupono egzempliorius numeris 4532 buvo deponuotas IPN Nacionalinės biologijos mokslų mokyklos herbariume.

Lapai buvo dehidratuoti ir smulkiai sumalti. Išdžiovinti lapai buvo mirkomi metanoliu kambario temperatūroje, filtruojami per celiuliozės filtrus (Whatman, Maidstone, JK) ir džiovinami naudojant rotacinį vakuuminį garintuvą (BUCHI Rotavapor R{{0}}, Šveicarija) 45 laipsnių temperatūroje. duoda žalią dervą (95,0 g/kg sausų lapų).Anti-senėjimo cistancheIki naudojimo SME buvo laikomas tamsoje 4 laipsnių temperatūroje. Atliekant visus tyrimus, ekstraktas buvo ištirpintas distiliuotame vandenyje[11].

2.2. MVĮ antiglikacinės veiklos tyrimai in vitro

2.2.1. Pažangių glikacijos galutinių produktų, gautų iš galvijų serumo albumino (BSA-AGE) susidarymas

BSA-AGE tyrimas buvo atliktas, kaip aprašyta anksčiau [31]. Trumpai tariant, 10 mg/ml BSA (V frakcija; Sigma-Aldrich, Sent Luisas, MO, JAV) buvo pridėta arba D-gliukozės 0,5 M, D-fruktozės {{12 }},5 M, arba metilglioksalis 2,5 mM, ir pagamintas tirpale 0,1 M PBS (pH 7,4) ir 0,02 proc. natrio azido. Į kiekvieną mišinį buvo pridėta MVĮ koncentracijų (5, 10, 25, 50, 100 ir 200 mg/ml) ir inkubuojama 37 laipsnių temperatūroje 4 savaites. Po to nesureagavęs cukrus buvo pašalintas dializės būdu prieš distiliuotą vandenį dvi dienas 4 laipsnių temperatūroje. BSA-AGE lygiai buvo nustatyti fluorescencine spektrofotometrija (Ex370/Em 440 nm; modelis LS 30, PerkinElmer LAS Ltd., Bekingemšyras, JK)[32]. BSA baltymo glikacija redukuojant cukrų ir MGO buvo teigiama kontrolė (glikuotas BSA), o kaip neigiama kontrolė buvo naudojamas BSA glikuotas su aminoguanidinu (1 mg/ml) inkubacija (BSA glikuotas-AG). Tyrimai buvo atlikti trimis egzemplioriais.

2.2.2. Fruktozamino tyrimas

Fruktozamino lygis buvo nustatytas naudojant nitro mėlynojo tetrazolio (NBT) tyrimą [33], kuris pagrįstas fruktozamino gebėjimu redukuoti NBT, sudarydamas formazaną, spalvotą galutinį produktą šarminėmis sąlygomis. Dešimt mikrolitrų kontrolinių arba glikuotų BSA inkubuotų SME koncentracijų (BSA-SME) buvo įpilta į 90 μL 2,5 mM NBT, paruošto karbonatiniame buferyje (0,1 M; pH 10,3); visi buvo inkubuojami 37 laipsnių C temperatūroje 30 min. Išmatuota absorbcija ties 530 nm. Fruktozamino koncentracijos (nmol/mg) buvo apskaičiuotos pagal standartinę formazano kreivę.

2.2.3. Karbonilo grupių susidarymo ir tiolio grupių išeikvojimo nustatymas BSA-AGE

Karbonilo grupės koncentracija buvo išmatuota BSA-SME ir kontroliniuose mėginiuose, remiantis Levine ir kt. [34]. 2,4-dinitrofenilhidrazino (DNPH; 10 mM) tirpalas 400 μL 2,5 M HCl buvo pridėtas prie 100 μL kiekvieno mėginio ir inkubuojamas tamsoje 60 min. kambario temperatūroje.cistanche benefíciosTada įpilta 500 μl trichloracto rūgšties (20 % m/t) ir 5 minutes palaikyta ant ledo. Mėginiai buvo centrifuguojami 4 000 aps./min. greičiu 15 min., o baltymo nuosėdos tris kartus plaunamos etilo acetatu/etanoliu (1:1 v/v). Po to mėginiai buvo suspenduoti 250 μl guanidino hidrochlorido iki 6 M. Karbonilo grupių koncentracija (nmol/mg baltymo) buvo apskaičiuota spektrofotometrija, esant 370 nm absorbcijai (EON, BioTek Instruments, Inc., Winooski, VT, JAV), naudojant DNPH sugerties koeficientas (22 000 M-1 cm-1).

Pagal Elmano metodą atliktas tiolių grupės išeikvojimo nustatymas BSA-SME ir kontroliniuose mėginiuose. Trumpai tariant, 10 μL 5,5'-disulfandiilbis (2-nitrobenzenkarboksirūgštis) (DNTB; 10 mM, paruoštas PBS) su 50 μL glikuotų mėginių buvo inkubuojamas 15 minučių kambario temperatūroje, tada buvo išmatuota absorbcija prie 410 nm. Laisvųjų tiolio grupių lygis buvo apskaičiuotas naudojant standartinę L-cisteino kreivę (0.{12}} μM) ir išreikštas nmol/mg baltymo [34].

2.3. MVĮ poveikis diabetu sergančių žiurkių tinklainei 2.3.1. Diabeto indukcija žiurkėms

Buvo naudojami Wistar žiurkių patinai, sveriantys 250 ± 10 g (N=40), nevalgę 8 valandas. Į pilvaplėvės ertmę buvo suleista streptozotocino dozė (60 mg/kg) citratiniame buferyje (10 mM, pH 4,5) (Sigma-Aldrich, Inc., St. Louis, MO, JAV) [35]. Po trijų dienų buvo išmatuotas gliukozės kiekis (gliukometras; ACCU-CHEK aktyvus; Roche Diagnostics, GmbH, Manheimas, Vokietija), paimant kraujo mėginį iš uodegos. Į tyrimą buvo įtraukti gyvūnai, kurių glikemijos lygis buvo didesnis nei 350 mg/dl. Gliukozės kiekis kraujyje buvo matuojamas kas savaitę 12 savaičių.

2.3.2. Eksperimentinis dizainas

Streptozotocino sukeltos diabetinės žiurkės (STZ) buvo atsitiktinai suskirstytos į tokias grupes (n =10): STZ gydoma intragastriniu būdu 2 ml geriamojo vandens (STZ); STZ, apdorotas SME 400 mg/kg (STZ-SME); normoglikemijos žiurkės (NG); ir STZ, apdorotas 50 mg/kg aminoguanidino (AG; Sigma-Aldrich, Inc.) (STZ-AG). STZ-AG buvo naudojamas kaip anti-AGE etaloninė grupė. Paskirtos dozės buvo skiriamos kas 24 valandas (9:00 val.) 12 savaičių. Glikemijos lygis visose grupėse buvo stebimas kas savaitę. MVĮ dozavimo režimas 400 mg/kg buvo pagrįstas taip: 7 g SVV gaunama iš 100 g šviežių špinatų (duomenys nerodomi). Šis kiekis prilygsta 70 kg vidutinio žmogaus per parą suvartojamam amerikietiškos dietos kiekiui [36], o tai atitinka 100 mg ekstrakto 1 kg kūno svorio.Cistanche ekstraktas, apsaugantis nuo radiacijosKita vertus, dėl žiurkių pagreitėjusios medžiagų apykaitos skirtumo, bet kokio natūralaus ekstrakto suvartojimą rekomenduojama padidinti iki 6,4 karto palyginamiesiems tyrimams su žmonėmis [37]. 400 mg/kg dozė, kurią naudojome, daugiausia buvo pagrįsta Wistar žiurkių sukeltos miokardo nekrozės modelio rezultatais, kurie parodė, kad SVV priešuždegiminis poveikis yra reikšmingesnis vartojant 300 mg/kg [12].

2.3.3. Histologiniai ir imunohistocheminiai vertinimai

Išskirtos akys buvo fiksuotos neutraliu formalinu, po to dehidratuotos rūšiuotuose alkoholiuose ir įterptos į parafiną. 2 μm histologiniai pjūviai buvo sumontuoti ant elektra įkrautų stiklelių, devaškuoti ir rehidratuoti iki antigeno atkūrimo tirpalo (K035; 10 × citrato buferis, pH 6; Diagnostic BioSystems, Pleasanton, CA, JAV). Naudota polimerų pagrindu sukurta imunodetekcijos sistema (PolyVuemouse/rabbit DAB aptikimo sistema, Diagnostic BioSystems). Buvo naudojami šie pirminiai antikūnai: glijos fibrilinis rūgštinis baltymas (anti-GFAP; MAB360; Chemicon International, Inc., Temecula, CA, JAV); kraujagyslių endotelio augimo faktorius (anti-VEGF;sc-7269; Santa Cruz Biotechnology, Inc., Dalasas, Teksasas, JAV), S100 kalcį surišantis baltymas B (anti-S100B; ab52642; Abcam PLC, Kembridžas, JK) , ir aktyvuotų B ląstelių branduolinio faktoriaus kappa-lengvosios grandinės stipriklis (anti-NF-kB p65;sc-8008). Visi praskiedimai buvo 1:200 ir inkubuojami per naktį 4 laipsnių temperatūroje. Antrinis antikūnas (Mouse/Rabbit PolyVueTM) buvo pridėtas pagal tiekėjo instrukcijas.cistanche žolėPjūviai buvo nudažyti DAB plius / chromogeno substratu ir hematoksilinu. Histologiniai stebėjimai ir vaizdų fiksavimas buvo atlikti Carl Zeiss mikroskopu (Carl Zeiss Microscopy GmbH, Jena, Vokietija).

Imunofluorescenciniam dažymui stikleliai buvo inkubuojami per naktį 4 °C temperatūroje su šiais pirminiais antikūnais: karboksimetillizinu (anti-CML; ab124145; Abcam PLC, Kembridžas, JK), AGE receptoriumi (anti-RAGE; sc{4}}), NADPH oksidazė 4 (anti-Nox4;ab133303), 3-nitrotirozinas (anti-NT; ab110282) ir azoto oksido sintazė (indukuojama) (anti-iNOS; A00368-1); Boster Bio, Pleasanton, CA , JAV). Tada buvo naudojami šie antriniai antikūnai: anti-RAGE, ožkos anti-pelės lgG(FITC) konjuguoti (1:200; Santa Cruz, Biotechnology, Inc.); anti-LML ir anti-NT – pelių anti-triušio IgG-PE (SC-3753); o anti-iNOS ir anti-Nox4 – m-IgGkBP-PE (Sc{29}}). Visi buvo inkubuojami kambario temperatūroje 60 min. Vėliau sekcijos buvo sumontuotos terpėje, kurioje yra 4',6-diamidino-2'-fenilindolo dihidrochlorido (DAPI). Anti-CML ir anti-RAGE antikūnai buvo hibridizuoti toje pačioje stiklelėje. Fluorescenciniams vaizdams buvo naudojama FLoidTM ląstelių vaizdo stotis (Life technology Carlsbad, San Diego, CA, JAV).

2.3.4.Apoptozės įvertinimas

Tinklainės ląstelių apoptozė buvo aptikta pagal vadovą, aprašytą naudojant terminalo deoksinukleotidiltransferazės (TdT) tarpininkaujamą deoksiuridino trifosfato (dUTP) slapyvardžio žymėjimo (TUNEL) tyrimą, naudojant In situ ląstelių mirties aptikimo rinkinį, TMR (tetrametilrodaminas{{) 3}}dUTP) raudona, 12 versija (12156792910; Roche Diagnostics). Trumpai tariant, nuvaškuoti stikleliai buvo rehidratuoti ir du kartus nuplauti PBS. Tada jie buvo inkubuojami su TUNEL reakcijos mišiniu drėgnoje atmosferoje 60 minučių 37 C temperatūroje. Po to sekcijos buvo sumontuotos su DAPI ir stebimos fluorescencine mikroskopija (FLoidTM Cell Imaging Station). TUNEL IOD buvo apskaičiuotas tinklainės sluoksniams.

2.3.5. Lipidų peroksidacijos tyrimas

Norint įvertinti malondialdehido (MDA) kiekį tinklainės audinyje, maždaug 3 mg šviežio audinio (n=3) buvo homogenizuoti ir apdoroti, kaip buvo pranešta anksčiau [38]. MDA lygiai buvo kiekybiškai įvertinti pagal rinkinio tiekėjo instrukcijas (OXItek-TBARS tyrimo rinkinys, Enzo Life Sciences, Farmingdale, NY, JAV).

2.4.Statistinė analizė

Statistinei analizei visos tinklainės mikrografijos buvo užfiksuotos 200× 100 μm atstumu už regos nervo srities. Buvo ištirta maždaug 40 vaizdų vienoje gyvūnų grupėje (n=7). Vaizdo analizė atlikta naudojant programinę įrangą Image-Pro Premier Version 9.0 (Media Cybernetics, Inc., Rockville, MD, JAV). Naudojome GraphPad Prism programinę įrangą (La Jolla, CA, JAV; 8.0 versija). Paveikslėliuose parodytos ganglioninių ląstelių sluoksnio (GCL), vidinio branduolinio sluoksnio (INL) ir išorinio branduolinio sluoksnio (ONL) vertės, pateiktos langelių ir ūsų diagramose (mediana, pirmasis-trečiasis kvartilis, mažiausia ir didžiausia vertė). Vidurkis ir standartinis nuokrypis (vidurkis ± SD) pateikti A priede (A1-A3 lentelės). Visais atvejais buvo atliktas vienpusis ANOVA testas, po kurio buvo atliktas Tukey testas. p<0.05 was="" considered="" statistically="">