Cistanche desercicola polisacharido cistanche apibūdinimas ir jo apsauginis poveikis dideliam gliukozės sukeltai HK -2 ląstelių sužalojimui

1.2.5.8 Mitochondrijų membranos potencialo aptikimas

HK -2 ląstelės buvo pasėstos 6- šuliniuose plokštelėse ir kultivuotos. Po atitinkamos stimuliacijos {6- šulinių plokštelių auginimo terpė buvo išsiurbta ir prie grupės buvo pridėta stipri teigiamos kontrolės grupė (POS), esant „1.2.5.6“. Kartą nuplaukite PBS, įpilkite 1 ml ląstelių kultūrinės terpės ir 1 ml JC -1 dažymo darbinio tirpalo buvo kruopščiai sumaišytas ir 20 min. Įdėtas į ląstelių kultūros inkubatorių 20 min. Ląstelės buvo du kartus plaunamos JC -1 dažymo buferiu (1 ×), o vaizdai buvo surinkti naudojant fluorescencinį mikroskopą.

 

 

 

 

„Cistanche“ nauda

 

1.2.5.9 Hoechst33258 ląstelių apoptozės nustatymo metodas

Ląstelės skaidrės buvo dedamos į 6- šulinių plokšteles, o HK -2 ląstelės logaritminėje augimo fazėje buvo pasėtos 6- šulinių plokštelėse, kurių ląstelės tankis yra 1 × 105 ląstelės/šulinys. Po atitinkamos narkotikų intervencijos dažymui buvo naudojamas Hoechst33258 dažymo rinkinys. Ląstelių apoptozė buvo aptikta ir vaizdai buvo surinkti naudojant fluorescencinį mikroskopą.

 

1.2.5.10 Western Blotting, kad būtų galima aptikti

Baltymų, susijusių su TLR4/NF-κB signalizacijos keliu, ekspresija buvo analizuojama suskirstant ir apdorojant ląsteles pagal metodą, esantį „1.2.5.6“. Po to bendras baltymų ląstelėse buvo ekstrahuotas pagal baltymų ekstrahavimo rinkinio instrukcijas. Baltymų kiekybinis įvertinimas buvo atliktas naudojant bicinchonino rūgšties (BCA) baltymų kiekybinio įvertinimo metodą, o baltymas buvo denatūruotas ir laikomas -20 laipsnio šaldytuve.
10% natrio dodecilsulfato poliakrilamido gelio elektroforezė (SDS-PAGE), polivinilideno fluoro (PVDF) membranos perdavimas. Įdėkite membraną į TRIS turinčią Tween -20 buferį
Ląstelės buvo inkubuojamos TRIS buferiniame druskos tirpale su Tween -20 (TBST) kamera ir užblokuota kambario temperatūroje. Buvo naudojami pirminiai antikūnai prieš TLR4, NF-κB p65, P-NF-κB p65 ir -aktinąaptikti inkstų audinį(Antikūnai buvo praskiedžiami iki TBST tirpalo, kai tūrio santykis buvo 1: 2000) 4 laipsniais per naktį. Tbst
Membrana praskiedžiama antriniu antikūnu (antikūnų ir TBST tirpalai buvo praskiedžiami santykiu 1: 2000) ir inkubuojama kambario temperatūroje 1 valandą. 3 kartus plaunant membraną TBST, aptikti buvo pridėtas ECL liuminescencinis reagentas, o baltymų ekspresija buvo nustatyta atliekant gelio vaizdą. Vaizdo J programinė įranga buvo naudojama baltymų pilkos spalvos vertei analizuoti, kai vidinė nuoroda yra -Attinas.

1.3 Duomenų apdorojimas

SPSS 23. 0 ir „GraphPad Prism 6.01“ programinė įranga buvo naudojama duomenų analizei. Mėginių duomenų normalumui patikrinti buvo naudojamas „Shapiro-Wilk“ testas, o rudos jėgos ar Bartlett testas buvo naudojamas mėginio duomenų dispersijos homogeniškumui patikrinti. Matavimo duomenys su normaliu pasiskirstymu ir dispersijos homogeniškumu buvo išreikšti kaip vidurkis ± standartinis nuokrypis. (x ± s) nurodo aprašymą, bandymui buvo naudojamas vienpusis ANOVA, o Dunnett'o metodas buvo naudojamas palyginimui poromis, jei statistiškai reikšmingas.
Naudojant nevienodų dispersijų palyginimus po hoc poromis, buvo naudojamas Dunnett T3 metodas, naudojant p <0. 0 5, rodantis statistiškai reikšmingą skirtumą, o p <0,01 rodo reikšmingą skirtumą tarp dviejų grupių.

2 rezultatai ir analizė

2.1 CDPS bendro cukraus, urono rūgšties ir baltymų kiekio nustatymas

PolySacharidų turinio tiesinės regresijos lygtis buvo: y=5. 7628x - 0. 0004, r=0. 999. Eksperimentas parodė, kad nuo 7 iki 70 µg/ml buvo geras tiesinis ryšys tarp standartinės gliukozės koncentracijos (x) ir absorbcijos vertės (y). Apskaičiuotas polisacharidų kiekio procentas imtyje yra: 81,02%.
Standartinės urono rūgšties tiesinės regresijos lygtis yra: y=1. 1571x + 0. 0015, r=0. 9968. Eksperimentas parodė, kad nuo 20 iki 100 μg/ml buvo geras tiesinis ryšys tarp standartinės urono rūgšties koncentracijos (x) ir absorbcijos vertės (y). Urono rūgšties kiekis imtyje yra: 4,43%.
Standartinė baltymo tiesinės regresijos lygtis yra: y=1. 2671x + 0. 2145, r=0. 9969. Eksperimentas parodė, kad nuo 20 iki 1 00 µg/ml buvo geras tiesinis ryšys tarp standartinės baltymo koncentracijos (x) ir absorbcijos vertės (y). Baltymų kiekis imtyje yra: 4,00%.

 

2.2 CDP molekulinės masės pasiskirstymas

CDP molekulinė masė buvo nustatyta atliekant aukštos kokybės gelio prasiskverbimo chromatografijos tandemo kolonėlės aptikimą. Kai RT AS (x) ir LGMP AS (y), LGMP-RT kalibravimo kreivės lygtis buvo apskaičiuota taip: y=-0 1951x + 11. 661, r²=0}. 9956; Rt yra (x), lgmw IS (y), LGMW-RT kalibravimo kreivės lygtis yra: y=-0. 1973x + 11. 738, r²=0. 9956; Rt yra (x), lgmn yra (y), lgmn-rt kalibravimo kreivė Lygtis yra: y=-0. 1964x + 11. 7, r²=0. 9955; Remiantis standartine kreive, gaunama skaičiavimo formulė, kad būtų galima apskaičiuoti kiekvieno mėginio molekulinę masę. Mėginio molekulinės masės spektras yra toks, o skaičiavimo rezultatai parodyti 2 lentelėje. Rezultatai parodė, kad CDP turėjo daugybę eliuavimo smailių, o polisacharidų molekulinė masė daugiausia buvo pasiskirstę tarp 3 iki 8 kDa, o tai buvo heterogeninis mažo molekulinio masto heteropolizakcharidas. Kaip parodyta 1 paveiksle.

 

 

2.3 CDPS monosacharidų sudėtis

CDP buvo analizuojami naudojant jonų chromatografiją, o chromatograma parodyta 2 paveiksle. Rezultatai parodė, kad palyginti su 16 monosacharidų standartų sulaikymo laiku, CDP buvo aptikti 5 monosacharidai. Palyginus spektrus su monosacharidų standartais, CDP daugiausia sudarė gliukozė, galaktozė, rhamnozė, mannozė ir sacharozė. , Arabinose. Molinis santykis yra 0. 734 0 5: 0. 0 5381: {0. 0502: 0,0255: 0,0178. Remiantis moliniu santykiu, galima pastebėti, kad CDP daugiausia sudaro gliukozė, galaktozė ir rhamnozė. Tarp jų gliukozė sudaro 73,405%, galaktozė sudaro 5,381%, o „Rhamnose“ sudaro 5,02%.

 

Pastaba: Man.Mannose, Glc N.gliukozamino hidrochloridas, rha.rhamnose, Glc-ua.gliukurono rūgštis, Gal-ua.galakturono rūgštis, Gal N.Galactozamino hidrochloridas, Glc.glucose, Gal.galaktozė, Xyl.xylose, Ara. Arabinose, fuc.fucose.

2.4 CDPS Furjė infraraudonųjų spindulių analizė

The peak near 3246 cm-1 is caused by the OH stretching vibration of the hydroxyl group, the absorption peak near 2900 cm-1 is the CH stretching vibration peak of -CH3, and the absorption peak at 1594 cm-1 is the C=O stretching vibration peak, indicating that CDPs Presence of uronic acid, 1374,31 cm -1: Ši absorbcijos smailė gali būti susijusi su CH jungčių deformacijos vibracija, ypač metil (-ch3) arba metilen (-h 2-) polisachcharidų grupėse. Absorbcijos smailė esant 1018,38 cm {-1 gali būti susijusi su CO jungties tempimo vibracija, kuri dažniausiai randama polisacharidų eteryje ar esterio jungtyse. Trys silpnos absorbcijos smailės 1200-1000 cm {-1 diapazone rodo piranozės buvimą CDP. Absorbcijos smailės esant 870 ir 930 cm {-1 rodo, kad CDP gali egzistuoti -tipo glikozidinės jungtys. Žr. 3 paveikslą.

 

2.5 Toksiškas CDP poveikis normalioms HK -2 ląstelėms

Palyginti su CON, praėjus 24 valandoms po vartojimo, ląstelių gyvybingumas pradėjo žymiai mažėti po to, kai CDPS koncentracija pasiekė 1000 ug/ml (P)<0.05); at 48 h after administration, the cell viability decreased when the CDPs concentration reached 800 μg/mL and did not exceed 80 %; after 1000 µg/mL, the cell viability began to decline significantly (P<0.05); this may be related to the imbalance of cell osmotic pressure and cell membrane damage caused by the high concentration of polysaccharides. There was no significant difference in cell viability when compared with the concentrations of 25, 50, 100, 200, and 400 µg/mL, so the concentrations of CDPs of 100, 200, and 400 µg/mL when cell viability did not decrease significantly were selected as the drug intervention concentrations. See Table 3.

 

3 Diskusija ir išvada

Polisacharidaiyra didelės molekulinės masės polimerai, sudaryti iš daugiau nei 10 monosacharidų. Buvo pranešta, kad polisacharidai turiImunomoduliacinis, antioksidacinis, priešuždegiminis ir hipoglikeminis poveikis[15]. Kaip viena pagrindinių farmakologiškai veiklių medžiagų Cistanche desercicola, CDP turi didelę vaistinę vertę. Šis tyrimas iš anksto apibūdino CDP struktūrą ir nustatė, kad jie gali pagerinti HK -2 ląstelių pažeidimą, kurį sukelia aukšta cukraus aplinka.

 

Sudėtinga polisacharidų struktūra yra glaudžiai susijusi su jų biologiniu aktyvumu, tarp kurių monosacharidų tipas ir dalis, santykinė polisacharidų molekulinė masė ir glikozidinių ryšių rūšis yra pagrindiniai įtakos veiksniai [16]. Vidutinė santykinė molekulinė masė suteikia polisacharidų aktyvesnes vietas ir gali parodyti stipresnį biologinį aktyvumą.
Tačiau didelė molekulinė masė padidins atsparumą transmembranoje, trukdys absorbcijai polisacharidams ir paveiks aktyvumą. Priešingai, mažos molekulinės masės polisacharidai gali nesugebėti suformuoti veiksmingų aktyvių struktūrų, todėl sumažėja aktyvumas [17]. Tiriant polisacharidų biologinį aktyvumą, būtina išsamiai apsvarstyti monosacharidų sudėties, santykinės molekulinės masės ir glikozidinių ryšių tipą [18]. Šiame tyrime jonų chromatografija nustatė, kad CDP daugiausia sudarė gliukozė, galaktozė ir rhamnozė, o tai atitinka Xu ir kt. [19]. CDP, matuojant didelio našumo skysčio gelio chromatografija, svorio ir vidutinio molekulinis svorio svoris buvo atitinkamai 3444, 4198 ir 8031 ​​kDa. Trijų cistanche polisacharidų molekuliniai svoriai iš keturių cistanche tipo vaistinių medžiagų, išmatuotų Yang ir kt. [20] buvo panašūs. CDP gali būti -tipo glikozidinių ryšių, jame gali būti -Gliukozės arba -Mannozės. Polisacharidai, sudaryti iš -gliukozės arba -mannozės, yra lengviau atpažįstami 4 rinkliavos receptoriais (TLR4) arba TLR2 [21].
DN yra viena rimčiausių mikrovaskulinių diabeto komplikacijų, o jo patogenezė yra glaudžiai susijusi su oksidaciniu stresu, mitochondrijų disfunkcija ir ląstelių apoptoze [22]. Šis tyrimas ištyrė apsauginį CDP poveikį didelėms gliukozės sukeltoms HK -2 ląstelėms, reguliuojant TLR4/NF-κB signalizacijos kelią ir jo molekulinį mechanizmą.

Esant didelėms gliukozės sąlygoms, HK -2 ląstelės turi reikšmingą oksidacinį stresą [23]. Tyrimuose nustatyta, kad didelis cukraus kiekis žymiai padidina tarpląstelinių ROS gamybą. Šis per didelis ROS kiekis gali tiesiogiai pažeisti ląstelių membranos lipidus, todėl padidėja lipidų peroksidacijos produkto MDA kiekis [24]. Tuo pat metu buvo žymiai sumažėjusi SOD ir GSH-PX, svarbios antioksidantų gynybos sistemos, veikla, tai rodo, kad ląstelių antioksidacinis pajėgumas buvo smarkiai pažeistas [25]. Šis oksidacijos ir antioksidacijos sistemos disbalansas dar labiau skatina TLR4 ekspresiją ir aktyvaciją [26]. Ankstesni tyrimai parodė, kad TLR4 per didelę ROS gali pripažinti kaip pavojų susijusius molekulinius modelius (DAMP), sudarydama teigiamą grįžtamojo ryšio kilpą [27]. Šiame tyrime CDP išankstinis gydymas žymiai sumažino ROS lygį, padidėjo SOD ir GSH-PX aktyvumas ir sumažino MDA kiekį. Šis išsamus antioksidacinis poveikis rodo, kad CDP gali reguliuoti oksidacinio streso reakcijas per kelis taikinius.
TLR4/NF-κB signalizacijos keliu aktyvuotas TLR4 skatina IKK komplekso aktyvaciją įdarbindamas pasroviui esančius adapterio baltymus, o tai savo ruožtu lemia fosforilinimą ir IκB skilimą [28]. Šis tyrimas pastebėjo, kad aukšta gliukozė žymiai padidino IκB fosforilinimo lygį, todėl NF-κB p65 perkelia iš citoplazmos į branduolį. Tyrimai parodė, kad p65 branduolinis perkėlimas ne tik pablogina oksidacinį stresą, bet ir daro įtaką mitochondrijų funkcijai [29].
Tai pastebėjo JC -1 dažymas, kad didelis gliukozės gydymas smarkiai sumažėjo mitochondrijų membranos potencialu, parodydamas perėjimą nuo raudonos fluorescencijos prie žaliosios fluorescencijos, tai rodo, kad protonų gradientas tarp vidinio ir išorinio mitochondrijų membranų buvo sutrikdytas. Mitochondrijų disfunkcija dar labiau pablogina ROS gamybą, sudarydama užburtą ciklą [30]. Išankstinis CDP gydymas gali išlaikyti mitochondrijų membranos potencialo stabilumą, ir šį apsauginį poveikį galima pasiekti slopinant TLR4 ekspresiją ir NF-κB aktyvaciją.
Mitochondrijų disfunkcija ir nuolatinis oksidacinis stresas galiausiai sukelia ląstelių apoptozę [31]. Hoechst dažymas atskleidė, kad ląstelių branduoliai aukšto gliukozės gydymo grupėje parodė akivaizdžius tipinius apoptozinius morfologinius pokyčius, tokius kaip kondensacija, kondensacija ir suskaidymas [32]. Šie pokyčiai yra glaudžiai susiję su mitochondrijų sukeltu vidinio apoptozės keliu: mitochondrijų membranos potencialo praradimas lemia citochromo C išsiskyrimą, kaspazės kaskados aktyvaciją ir galiausiai ląstelių apoptozę [33]. CDP išankstinio apdorojimo grupės ląstelių branduolinė morfologija iš esmės buvo normali, o dažymas buvo vienodas, o tai rodo, kad CDP užkirto kelią ląstelių apoptozei palaikant mitochondrijų funkciją ir slopindamas oksidacinį stresą.
Apibendrinant galima pasakyti, kad šis tyrimas sistemingai nustatė oksidacinių streso rodiklius (ROS, MDA, SOD, GSH-PX), mitochondrijų funkciją (JC -1) ir ląstelių apoptozę (Hoechst), kartu su TLR4/NF-κB signalizacijos kelio molekulėmis, kurios išaiškina CDP veikimo mechanizmą: CDPS: CDPS mechanizmą: CDPS mechanizmą: CDPS mechanizmą: CDPS mechanizmą: CDPS mechanizmą: CDPS mechanizmą: CDPS mechanizmą: CDPS mechanizmą: CDPS mechanizmą: CDPS mechanizmą: CDPS mechanizmą: CDPS mechanizmą: CDPS mechanizmą: CDPS mechanizmą: CDPS mechanizmą: CDPS mechanizmą: CDPS mechanizmą: CDPS mechanizmą: CDPS mechanizmą: CDPS mechanizmą: CDPS mechanizmą.
Pirma, pagerindami ląstelių antioksidacinį pajėgumą, sumažinant ROS lygį ir sumažinant TLR4 aktyvaciją; Antra, slopindamas TLR4 raišką ir IκB fosforilinimą, blokuodamas NF-κB branduolinį translokaciją; Galiausiai, pagerindamas mitochondrijų funkciją, slopindamas ląstelių apoptozę. Mirtis, taip vaidindamas apsauginį vaidmenį nuo DN. Šis daugialypis sinergetinis poveikis leidžia CDP parodyti geras taikymo perspektyvas gydant DN. Vėlesniuose tyrimuose polisacharidų struktūra toliau bus nustatyta atliekant rentgeno spindulių difrakciją, branduolinio magnetinio rezonanso spektroskopiją ir dujų chromatografijos-masės spektrometriją. Be to, vidutiniai molekulinės masės rezultatai rodo, kad CDP yra nevienalyčiai polisacharidai. Toliau mes atskirsime ir išvalysime homogeninius polisacharidus, aptiksime polisacharido struktūrą ir biologinį aktyvumą bei paaiškinsime struktūros ir aktyvumo ryšį.