Naujo kvercetino acetilinto darinio struktūrinis projektavimas, sintezė ir antioksidantas, antileishmanija, priešuždegiminė ir priešvėžinė veikla

Norėdami gauti daugiau informacijos. kontaktas:tina.xiang@wecistanche.com

Abstraktus: Kvercetinas(Q) yra bioflavonoidas, turintis biologinį potencialą; tačiau prastas tirpumas vandenyje, intensyvus fermentinis metabolizmas ir sumažėjęs biologinis prieinamumas riboja jo biofarmakologinį panaudojimą. Šio tyrimo tikslas buvo atlikti Q acetilinimo būdu struktūrinę modifikaciją, tokiu būdu gaunant kvercetino pentaacetato (Q5) analogą, siekiant ištirti biologinius potencialus (antioksidantas, antileishmanija, priešuždegiminis ir citotoksinis aktyvumas) ląstelių kultūrose. Q5 buvo apibūdintas FTIR, 'H ir 13C BMR spektrais. Theantioksidantaspotencialas buvo įvertintas pagal radikalą ABTS· plus . Priešuždegiminis potencialas buvo įvertintas matuojant priešuždegiminį citokinų naviko nekrozės faktorių (TNF) ir azoto oksido (NO) gamybą pilvaplėvės makrofaguose iš BALB/c pelių. Citotoksiškumo tyrimai buvo atlikti naudojant AlamarBlue metodą vėžinėms ląstelėms HepG2 (žmogaus hepatokarcinoma), HL-60 (promielocitinė leukemija) ir MCR-5 (sveiki žmogaus plaučių fibroblastai), taip pat MTT metodas C6 ląstelėms. kultūros (žiurkių glioma). Q ir Q5 parodė atitinkamai 29 ir 18 procentų antioksidacinį aktyvumą, o tai pateisinama hidroksilų pakeitimu acetilo grupėmis. Q ir Q5 parodė nuo koncentracijos priklausomą NO ir TNF gamybos sumažėjimą (p<0.05); q="" and="" q5="" showed="" higher="" activity="" at="" concentrations="">40μM when compared to dexamethasone （20 μM）. For the HL-60 lineage, Q5 demonstrated selectivity, inducing death in cancer cells, when compared to the healthy cell line MRC-5（IC50>80 μM). Galiausiai buvo patikrintas Q5 citotoksinis pranašumas (IC50=11 μM), kuris, esant 50 μM 24 valandas, sukėlė C6 gliomos ląstelių morfologijos pokyčius, kuriems būdinga apvali kūno forma (literatūroje dar nepateikta). ). Analogas Q5 turėjo galimą biologinį poveikį ir gali būti perspektyvus tolesniems tyrimams su kitomis ląstelių kultūromis, ypač neuroninėmis.

Raktažodžiai: kvercetinas;sintezė; kvercetino pentaacetatas; antioksidantas; antileishmania; priešuždegiminis;citotoksinis aktyvumas

Spustelėkite norėdami sužinoti daugiau apie produktus

1. Įvadas

kvercetinasyra bioflavonoidas, turintis įrodytą poveikį sveikatai ir gerai dokumentuotą biocheminę veiklą. Šis junginys laikomas vienu stipriausių antioksidantų tarp polifenolių [1-3]. Dėl savo savybių kvercetinas buvo išbandytas įvairioms terapinėms reikmėms, pvzantioksidantas, antiparazitinis,priešuždegiminis, ir priešvėžinę veiklą [4,5]. Sergant parazitinėmis ligomis flavonoidai yra labai svarbi grupė. Taip yra dėl mažo jų toksiškumo šeimininkams ir kelių mechanizmų, kuriais jie gali moduliuoti patologiškai pakitusius procesus infekcijų metu [6].Flavonoidaituri daug taikinių gydant leišmaniozę ir apima tokius taikinius kaip arginazė, ribonukleotidų reduktazė ir topoizomerazė II [7, 8].

kvercetinasturi daug priešvėžinių veiksmų kelių tipų solidiniuose navikuose. Be to, buvo įrodyta, kad jis veikia HL-60 ląsteles (kurios kilusios iš ūminės mieloidinės leukemijos (AML)) ir žymiai sumažina naviko augimą, nes sumažina intratumorinį oksidacinį stresą, suaktyvina ekstraląstelinės reguliuojamos kinazės (ERK) signalą ir vėlesnė apoptozė [9]. Kvercetinas pagerino priešuždegiminį atsaką, sumažindamas IL-6 ir TNF ekspresiją ir teigiamai veikia priešuždegiminį poveikį žmogaus THP1 makrofagų populiacijose [10].

Tarp įvairių vėžio rūšių glioma yra viena agresyviausių ir su bloga prognoze. Deja, pagrindiniai gydymo būdai (chirurginis pašalinimas, spindulinė terapija ir chemoterapija) nėra veiksmingi. Vidutinis bendras pacientų išgyvenamumas išlieka maždaug 14 mėnesių [11]. Nepaisant to, nauji junginiai, tokie kaip temozolomidas [12], retinoidai [13] ir flavonoidai [14], parodė antigliominį aktyvumą. Buvo aprašytas priešnavikinis kvercetino poveikis glioblastomos ląstelėms, kurios yra agresyviausios iš gliomų [15].

Nenormalus imuninis atsakas yra susijęs su daugelio ligų, įskaitant autoimunines ligas, alergijas, vėžį ir neurodegeneracines ligas, atsiradimu ir vystymusi.Flavonoidaituri galimą imunomoduliacinį aktyvumą ir yra tiriamos kaip alternatyvos klinikiniam naudojimui. Kvercetinas gali turėti reikšmingą imunomoduliacinį poveikį citokinų, gautų iš Th-1 ir Th-2 profilio, gamybai ląstelėse ir limfocitų proliferacijai, reguliuodamas ląstelinį imunitetą[16]. Be to, kvercetinas gali skirtingai moduliuoti interleukino genų ekspresiją periferinio kraujo mononuklearinėse ląstelėse (PBMC), palankiai veikiant Th-1 profilį, kuris skatina ląstelių imunitetą gama interferonu (IFN-y), sumažindamas Th{ {6}} profilis, susijęs su humoraliniu imunitetu ir makrofagų aktyvavimu IL-4 [17].

Mažas tirpumas vandenyje, intensyvus metabolizmas ir fermentinis skaidymas riboja biologinį prieinamumą ir mažina biofarmakologinį kvercetino, kaip terapinės medžiagos, naudojimą[13]. Įdomus būdas įveikti mažą polifenolių biologinį prieinamumą, siekiant ištirti ir ištirti jų aktyvumą in vivo, yra cheminis natūralaus junginio modifikavimas, didinant tirpumą ir lėtinant medžiagų apykaitą. Taigi, tiriama daug sintetinių būdų, tokių kaip acetilinimas, aminų pridėjimas ir brominimas, modifikavimas į oksimus ir kompleksavimas su hidrazinais [18-20].

Šiame tyrime atliekame struktūrinę kvercetino modifikaciją, siekdami gauti analoginį kvercetino pentaacetatą (Q5), kad būtų galima įvertinti antioksidacinį potencialą, priešuždegiminį aktyvumą ir vėžinių ląstelių, hepatokarcinomos (HepG2), promielocitinės leukemijos augimo slopinimą. (HL-60) ir žiurkės gliomos (C6) ląstelės.

2. Rezultatai ir aptarimas

2.1.Sintezė ir apibūdinimas

Analoginio kvercetino (3,3', A',5,7-pentaacetato) sintezei buvo taikomas viso acetilinimo metodas, kuris buvo pritaikytas literatūroje aptinkamoms eksperimentinėms sąlygoms [21]. Tokiu būdu acto rūgšties anhidridas išsaugomas kaip acilinimo agentas, o piridinas – kaip katalizatorius.

Gautas produktas (Q5), geltona kieta medžiaga, pasižymėjo 178-186 laipsnio lydymosi temperatūra, suderinama su literatūros duomenimis[18]. Be to, lyginamoji kvercetino ir produkto FTIR analizė parodė, kad 3400 cm-1 kvercetino hidroksilams būdingų absorbcijos juostų nėra, o juostos aplink 1600-1650 cm-' rodo karbonilo esterį. , rodantis hidroksilo grupių pakeitimą acetilo grupėmis: IR (KBr)v(cm-1):1761,1652,1615, 1505, 1442,1377,1208,1176,1121,1085,1012,892,83 ir 6,060 (Figūra 1). Spektrai buvo lyginami su literatūroje aprašytais [21].

Kvercetino (Q) ir gauto produkto (Q5) branduolinio magnetinio rezonanso (BMR) analizė parodė bendrą acetilinimą, o H BMR spektre išnyko hidroksilams būdingi singletai, viršijantys 9 ppm (papildomi paveikslai S1, S2 ir S{ {4}}S6) ir didelių bei būdingų metilo signalų atsiradimas alifatinėse spektro srityse, nuo 2 iki 3 ppm. 13C BMR spektre (papildomi paveikslai S3 ir S7-S9) gautas produktas parodė esterių karbonilų tipinių signalų padidėjimą iki 170 ppm ir signalų atsiradimą tarp 20 ir 21 ppm, atitinkančių cheminę medžiagą. penkių alifatinių metilų anglies atomų poslinkiai, patikrinti integruojant signalus. Spektrai buvo lyginami su literatūroje aprašytais [22].

Biasutto ir kt. [23] buvo pirmtakų, kurių pagrindą sudaro esteriai, tyrimo pionieriai, siekiant padidinti kvercetino biologinį prieinamumą. Remdamiesi savo tyrimais, Mattarei ir kt. [21] skatino bendrą kvercetino acetilinimą ir gavo Q5 darinį su dideliu derliumi (79-97 proc.). Visai neseniai Mohajeri ir kt. [24] kaitinant (180 laipsnių 6 val.), gautas analogas Q5, gautas 85 procentų išeiga. Šiame tyrime Q5 sintezė buvo efektyvi, ir mes gavome vieną junginį, tinkamai apibūdintą pagal literatūroje aprašytus duomenis.

2.2. Antioksidantas ABTS· plius radikalus aktyvumas

Lyginamoji Q ir Q5 antioksidacinio aktyvumo analizė parodė, kad kvercetinas (Q) aktyviau pašalino ABTS* ir radikalą nei O5 (atitinkamai 29 proc. ir 18 proc.), o IC50 vertės (μM). 188,850±0,003 ir 379,560 ± 0,004 atitinkamai Q ir Q5.

Flavonoidų antioksidacinis aktyvumas yra tiesiogiai susijęs su jų molekuline struktūra. Yra du mechanizmai, kuriais fenoliniai junginiai gali atlikti savo antioksidacines funkcijas: vandenilio atomų perdavimas ir elektronų donorystė [25]. Puikus kvercetino antioksidacinis aktyvumas gali būti siejamas su reikšmingu hidroksilų ir jų vandenilių indėliu, kurie Q5 analoge yra pakeisti acetilais, todėl sumažėja vandenilio donorystės ar laisvųjų radikalų pašalinimo sintetinėmis molekulėmis galimybė.

Mokslinėje literatūroje nerasta duomenų apie Q5 junginio antioksidacinį aktyvumą. O ir kt. [26] įvertino kvercetino esterio preparatus ir jų antioksidacinį aktyvumą, parodydamas, kad tarp ištirtų mėginių kvercetinas pasižymi didžiausiu radikalų sunaikinimo aktyvumu. Todėl didelis hidroksilo grupių indėlis į kvercetino antioksidacinį aktyvumą yra labai svarbus [27].

2.3.Antileishmania Actoity

In order to evaluate the activity of the compound(O and O5)against the promastigote forms of the two Leishmania species, the 50% inhibitory concentration(IC50)was calculated from the cell viability assay in axenic culture. For Leishmania braziliensis, Q and Q5 had ICs0 values>100 μM, lyginant su amfotericinu B (IC501,1 μM±0,1). Be to, buvo įvertintas Q5 poveikis promastigotinėms L.amazonenses formoms, ir šio junginio IC50 vertė buvo mažesnė (75,1). ± 4,7 μM） šiai rūšiai, palyginti su L. braziliensis.

Tasdemiras ir kt. [8] palygino flavonoidų ir jų analogų (gautų iš kvercetino) antitripanosominį ir antileishmaninį aktyvumą ir nustatė, kad jie yra stiprūs ir veiksmingi antiprotoziniai agentai prieš amastigotines L donovani formas (IC50=1.0ug mL). -l). Dėl promastigotinių L.amazonensis formų Fonseca ir Silva et al.[27] rasta IC50=31,4 uM kvercetinu apdorotose kultūrose per 48 val. Be to, jie pranešė apie visišką ląstelių augimo sustabdymą naudojant 96 μM kvercetino per 96 valandas, o tai rodo patenkinamą antileishmanial-dal aktyvumą. Cataneo ir kt. [28]įvertino kvercetino (iki 192 μM）) antipromastigotinį poveikį L.brasiliensis makrofagų pilvaplėvės ląstelėse. L. major promastigotinėse kultūrose kvercetinas ir jo analogas kvercetino-pentaacetatas parodė nuo koncentracijos priklausomą poveikį (IC). 50 =2.5±0.92 ir 2.85±0.99 μM, atitinkamai 【24】.

Kai kurie autoriai įrodė, kad kvercetinas sukelia L amazonensis promastigotų mirtį dėl mitochondrijų membranų disfunkcijos, atsirandančios dėl reaktyviųjų deguonies rūšių [27, 28] ir kitų taikinių, tokių kaip arginazė [7], ribonukleotidų reduktazė [8, 29] ir topoizomerazės, gamybos. II[30]. Šiame tyrime gauti rezultatai rodo, kad kiti bandymai turėtų būti svarstomi per perspektyvą tirtiems junginiams (Q ir Q5), atsižvelgiant į in silico testus, kad būtų galima ištirti taikinius, kurie gali būti susiję su stebimais mirties mechanizmais.

2.4. Priešuždegiminė ir citotoksinė veikla

Tada mes sutelkėme dėmesį į naujojo darinio biologinio aktyvumo įvertinimą. Pirma, netoksiškos Q ir Q5 koncentracijos buvo nustatytos pilvaplėvės makrofaguose, gautuose iš BALB / c pelių. CCs0 reikšmės neparodė citotoksiškumo, kai koncentracija yra lygi arba mažesnė nei 80 μM (2A pav., D). Deksametazonas nebuvo citotoksinis, kai tirta koncentracija (20 μM). Remiantis tuo, buvo atlikti tolesni bandymai, kurių koncentracija neviršija 80 μM.

Buvo tiriamas Q ir Q5 imunomoduliacinis aktyvumas, siekiant nustatyti junginių poveikį priešuždegiminių mediatorių sekrecijai. Junginių (Q ir Q5) imunomoduliacinis poveikis iš pradžių buvo įvertintas pilvaplėvės makrofagų kultūrose, gaminant azoto oksidą. Kaip ir tikėtasi, makrofagų aktyvinimas naudojant LPS PLUS IFNy padidino nitritų gamybą (2B pav., E). Gydymas kvercetinu, priklausomai nuo koncentracijos, slopino nitritų gamybą (p<>

Pentadaktilo junginys (Q5) neparodė panašaus aktyvumo esant 20 μM. Įdomu tai, kad abiejų junginių aktyvumas buvo reikšmingas esant didžiausioms tirtoms koncentracijoms (40 ir 80 μM). Esant didžiausiai tirtai koncentracijai (80 uM), junginių poveikis buvo panašus į tą, kuris buvo pastebėtas aktyvuotų makrofagų kultūrose ir apdorotose 20 μM deksametazonu. Tirtose koncentracijose (20, 40 ir 80 μM) junginiai nebuvo citotoksiški pilvaplėvės makrofagams.

Norėdami geriau apibūdintipriešuždegiminisjunginių (O ir O5) poveikį, uždegiminis citokinas TNF buvo kiekybiškai įvertintas su fermentais susieto imunosorbento tyrimo (ELISA) metodu. Makrofagų stimuliacija naudojant LPS ir INF-y sukėlė ryškų TNF gamybos padidėjimą. Gydymas Q ir Q5 žymiai sumažino TNF gamybą (p<0.05) in="" a="" concentration-dependent="" manner="" (figure="" 2c,="">

Uždegiminių faktorių mažinimas kvercetinu aprašytas įvairiai, įskaitant Th-2 uždegiminių profilių moduliavimą, susijusį su apsauga nuo nervų ligų [31,32]. Kvercetino priešuždegiminis poveikis yra gerai aprašytas literatūroje [33, 34]. Tačiau yra keletas tyrimų, įrodančių O5 analogo priešuždegiminį potencialą. Šis tyrimas patvirtina Chen ir kt. [35], kuris įrodė Q ir O5 vaidmenį slopinant LPS sukeltą NO gamybą, priklausomai nuo koncentracijos, be žalingo citotoksinio poveikio RAW 264.7 makrofagų linijai. Be to, šis tyrimas parodė precedento neturintį Q5 poveikį slopinant priešuždegiminį citokiną TNF.

Gauti duomenys rodo poveikio pusiau sintetinei molekulei (O5) išsaugojimą; tačiau kitų veiksnių, pvz., citokino IL-10, dozės gali būti šių profilių vertinimo perspektyva. Todėl Q5 gali būti laikomas potencialia molekule būsimiems in vitro ir in vivo tyrimams, kuriais siekiama papildomos terapinės alternatyvos, turinčios priešuždegiminį poveikį.

Tirtų junginių (Q ir Q5) citotoksiškumas buvo įvertintas esant 20, 40 ir 80 uM, naudojant AlamarBlue kolorimetrinį metodą sveikų ląstelių linijoje (MRC-5, žmogaus plaučių fibroblastuose) ir dviejose skirtingose ​​vėžio ląstelių linijose. , HepG2 (žmogaus hepatoceliulinė karcinoma) ir HL-60 (žmogaus promielocitinė leukemija), kaip parodyta 3 paveiksle. Doksorubicinas buvo standartinis vaistas, naudojamas kaip teigiama kontrolė.

Kaip parodyta 3 paveiksle, HepG2 ląstelėse kvercetinas (Q) neparodė reikšmingo citotoksinio aktyvumo esant didžiausiai tirtai koncentracijai (80 μM), o jo pentaacetato analogas (Q5) parodė sumažėjusį aktyvumą (IC{{4). }}.9 μM). Nustatyta, kad HL-60 vėžio ląstelių linijoje kvercetinas nėra labai aktyvus (IC50=51.3 uM); tačiau įdomu tai, kad Q5 buvo žymiai aktyvesnis nei kvercetinas, kurio IC50 buvo 33,6 uM. Standartinio vaisto doksorubicino IC50 vertės svyravo nuo 0,1 iki 0,2 uM vėžio ląstelių linijoms, turinčioms reikšmingą citotoksinį poveikį sveikų ląstelių linijai MRC{18}} (1 lentelė), o tai nebuvo pastebėta junginiams (Q ir Q5). .

For the HL-60 cell line, the Land O5presented values of 51.3 and 33.6 μM, respectively, in agreement with Massi et al.[17]. Regarding cytotoxicity in non-tumor cells, O and Q5 presented IC50 values >80 μM, rodantis selektyvų profilį prieš vėžio ląstelių liniją. Keletas tyrimų parodė kvercetino O5 analogo aktyvumą vėžio ląstelių linijose. Tačiau Q5 aktyvumą HeLa naviko ląstelių linijoje dokumentavo Danihelovået al. [22], kuris parodė, kad acetilinti kvercetino esteriai buvo veiksmingiausi citotoksiniai dariniai. Duomenų apie citotoksinį Q5 vaidmenį HepG2 linijos ląstelėse nerasta. Literatūroje rastas tik vienas tyrimas, atskleidęs, kad tetraacetilintas kvercetino analogas turėjo reikšmingą poveikį HL-60 linijos ląstelių slopinimui, aktyvindamas kaspazę-3, skatindamas apoptozę [36].

C6 ląstelių kultūros citotoksiškumui gauti buvo naudojamas kolorimetrinis metodas MTT tyrimas. Kvercetinas ir Q5 sukėlė 57{{10}} nm MTT absorbcijos sumažėjimą, o tai rodo mitochondrijų dehidrogenazės aktyvumą ir rodo, kad sumažėjo ląstelių gyvybingumas C6 ląstelėse. Kaip parodyta 4 paveiksle, kvercetino sukeltas citotoksiškumas C6 ląstelėse, kai koncentracija didesnė nei 25 uM 72 valandas (4A pav.), o 0,78 μM Q5 72 val. sumažino ląstelių gyvybingumą (4B pav. ). Pastebėta, kad 50 uM kvercetino (O) ir O5 sumažino ląstelių gyvybingumą atitinkamai iki 41,3 proc. ± 2,9 proc. ir 47,5 proc. ±1,2 proc., palyginti su kontroline grupe (100,0 proc. ± 6,4 proc.) (4A, B pav.). . C6 kultūrose, apdorotose DMSO (0,05 proc.), reikšmingų ląstelių gyvybingumo pokyčių nebuvo matyti, palyginti su neapdorotomis ląstelėmis.

Remdamiesi gautais rezultatais, optine mikroskopija ištyrėme junginių Q ir Q5 (50 μM) morfologinį poveikį C6 ląstelėms po 24, 48 ir 72 valandų apdorojimo. Kvercetino pentaacetatas (Q5), esant 50 μM, sukėlė C6 gliomos ląstelių morfologijos pokyčius per pirmąsias 24 valandas ir pastebimai sumažėjo citoplazmos pailgėjimas, palyginti su kontroline grupe (5 pav.). Po 48 valandų gydymo Q5 ląstelės įgavo apvalią morfologiją, kuriai būdingas ląstelės kūno atsitraukimas ir beformė membrana (apie tai nebuvo pranešta mokslinėje literatūroje), skirtingai nei kvercetinas, kuris šiuo gydymo laikotarpiu turėjo morfologinį aspektą. panašus į fibroblastus [37]. Bet kokie kiti morfologiniai pokyčiai buvo vizualizuoti ląstelėse kitomis gydymo sąlygomis.

Hidroksilo pakeitimas acetilo grupėmis gali paskatinti geresnę kvercetino analogų absorbciją ląstelėse, o tai skatina įvairius biologinius tyrimus, ypač vėžio ląstelėse [38, 39]. Bispo da Silva ir kt. [40] parodė, kad apdorojant C6 ląsteles flavonoidais rutinu ir kvercetinu, žymiai sumažėjo prilipusių C6 ląstelių, turinčių plonesnį ir bipolinį morfologinį fenotipą, dalis, palyginti su kontrolinėmis kultūromis. C6 ląstelių gydymas flavonoidais slopino gyvybingų C6 ląstelių migracijos savybes po 24 valandų gydymo. Kontrolinėmis sąlygomis mikroglia turėjo apvalesnį fenotipą; po gydymo rutinu daugiau nei 50 procentų ląstelių įgavo šakotą daugiapolį fenotipą, o kitos – ameboidinį fenotipą, kurie abu rodo aktyvaciją.

Tyrimai rodo, kad kvercetinas trukdo reguliuoti ląstelių signalizacijos perdavimo kelius, susijusius su ląstelių mirtimi dėl apoptozės ir ląstelių ciklo progresavimo stadijose [41, 42]. Santos ir kt. [14] parodė galimą GL-15 žmogaus glioblastomos ląstelių augimo sumažėjimą. Bi ir kt. [43] vaizdavo U87 ir U251 žmogaus glioblastomos ląstelių autofagijos indukciją priklausomai nuo dozės.

Gauti rezultatai patvirtina Danihelova ir kt. [22], kurioje acetilo grupės, įterptos į kvercetino molekulę, pagerino priešvėžinį aktyvumą. Be to, jie parodė didesnį vėžio ląstelių tropizmą, ypač nervinių linijų ląsteles. Šis tyrimas yra precedento neturintis, palyginti su O5 analogu gydant C6 gliomos ląsteles. Dell'Albani ir kt. [44] parodė geresnį kvercetino acilo darinių veikimą žmogaus gliomos padermių U373-MG ir pelių gliomos 9L kultūrose, o tai rodo mirties kelius dėl apoptozės. Ląstelių morfologijos pakeitimas į apvalų profilį gali reikšti mirties mechanizmus, tokius kaip apoptozė, plačiai priskiriama kvercetinui [45-47]. Ateityje, bandymai su sveikomis nervinėmis ląstelėmis gali padėti išsiaiškinti šią hipotezę.

3. Medžiagos ir metodai

3.1.Reagentai ir medžiagos

Visi reagentai (kvercetinas, piridinas, acto rūgšties anhidridas, trispalvė izocianuro rūgštis, dichlormetanas, 2,4-dinitrofenilhidrazinas, hidroksilamino hidrochloridas, natrio acetatas, petrolio eteris, sieros rūgštis, kalio persulfatas) ir komerciškai prieinami (Ouimex, Merck, Brazilija ir Sigma Aldrich, Sent Luisas, MO, JAV). Visiems standartiniams tirpalams ir mėginiams ruošti buvo naudojamas itin grynas vanduo (kurio varža 18 MOcm-I), gautas iš Milli-Q Plus vandens valymo sistemos (Millipore, Molsheim, Prancūzija). Visi laboratoriniai stikliniai indai buvo išplauti 10 proc. o/ø） HNO3 tirpalas 24 valandas, nuplaunamas didelio grynumo vandeniu ir išdžiovinamas aplinkos temperatūroje.

3.2. Sintezė ir apibūdinimas

Struktūrinis analogas buvo gautas pokvercetinasmolekulinė modifikacija iš labiau prieinamo ir atkuriamo sintetinio kelio (Penta acetilinimas). Taikėme žaliosios chemijos principus, sumažindami medžiagų naudojimą. Pentadaktilo analogas (Q5) buvo gautas po kvercetino molekulinės modifikacijos sintetiniu būdu, kai kaip acilinimo agentas naudojamas acto rūgšties anhidridas, o kaip katalizatorius - piridinas.

Mišinys, kuriame yra kvercetino (300 mg, 1 pvz.), acto rūgšties anhidrido (0,80 ml, 20 pvz.) ir piridino (7,5 ml), buvo laikomas magnetiniu būdu maišant kambario temperatūroje. Po 24 valandų maišymo į reakcijos terpę įpilama 250 ml dichlormetano. Tada reakcija buvo plaunama 10 procentų HCl (3 × 100 ml), praskiestu NaOH (3 × 50 ml) ir vandeniu (3 × 100 ml); džiovintas bevandeniu natrio sulfatu; filtruojamas; ir išgarinamas rotaciniame garintuve (Fisatom, Minas Gerais, Brazilija)[21]. O5 kiekis ir išeiga buvo atitinkamai 280 mg ir 54 proc.

Kvercetino molekulės struktūros modifikavimo reakcija buvo stebima plonasluoksne chromatografija (TLC), naudojant heksano ir etilo acetato (1:1) mišinį kaip tirpiklius. Fizikiniam ir cheminiam apibūdinimui buvo naudojama lydymosi temperatūra. Furjė transformacijos infraraudonųjų spindulių (FTIR) testai, naudojant susilpninto visiško atspindžio (ATR) metodą, buvo atlikti FTIR Spectrum 100S modeliu (Perkin Elmer, Waltham, MA, JAV), imant skenavimo spektrus infraraudonųjų spindulių viduryje (nuo 4000 iki 600 cm-1).

Mėginys (masė ~ 50 mg) buvo dedamas ant ATR kristalo ir rankiniu mechaniniu presu veikiamas maždaug 20 N slėgiu. FTIR spektrai buvo atsekti naudojant „OriginPro8“ programinę įrangą „OriginLAB4“ (www.originlab.com, pasiekiama 2021 m. rugsėjo 10 d.). Branduolinio magnetinio rezonanso (BMR) spektrai buvo įrašyti Bruker Avance IⅢI500 MHz (Usteris, Šveicarija) spektrometru -500 MHz 1H BMR ir 125 MHz 13C BMR, naudojant DMSO kaip tirpiklį. Cheminiai poslinkiai buvo išreikšti ppm skale (ug/mL), o chloroformas (CHCla) buvo naudojamas kaip vidinė atskaita.

BMR spektrai buvo apdoroti TopSpin⑤4.{1}} programine įranga (Bruker Biospin, Coventry, JK) ir palyginti su literatūros duomenimis [38]. BMR duomenys buvo tokie: 'H BMR (5{34}}0 MHz, CDCl3) 2,34 (6H, s, -OCOCH3); 2,35 (3H, s, -OCOCH3); 2,35 (3H, s, -OCOCH3); 2,44 (3 H, s, -OCOCH3); 6,88 (1 H, d, J=2,5 Hz); 7,34 (1 H, d, J=2). Hz);7,36(1H,d,J=8.5);7,70 (1Hd, J=2.0Hz）;7,73（1H,dd,J1=8.5 Hz,J 2=2.0 Hz）;13CNMR (125 MHz, CDCl3）δ 170,04; 169,24; 167.{60}}; 167,79; 156,87; 154,28; 150,43; 150,43; 144,28; 150,43; 144,28; 150,43; 144,28; 150,43; 144,43; 150,43; 144,28; 150,43; 144,28; 150,43; 150,43; 144,43; 150,43; 144,20; 150,43; 150,43; 144,20; 150,43; 144,20; 1,3; ;113.89;108.96;21.16;21.02;20.65; ir 20.49 val.

3.3. Antioksidantas ABTS* ir radikalus aktyvumas

ABTS* ir sekvestracijos veikla buvo pritaikyta pagal Dormano ir Hiltuneno aprašytą metodą[48]. Kalio persulfatas ir ABTS (Sigma Aldrich, St. Louis, MO) buvo ištirpinti distiliuotame vandenyje, kad susidarytų atitinkamai 2,45 mM ir 7 mM galutinė koncentracija. ABTS tirpalas buvo pagamintas pridedant abu tirpalus santykiu 1: 1, o po to tirpalas buvo inkubuojamas kambario temperatūroje 16 valandų tamsoje.

Gautas tirpalas, intensyviai nudažytas, prieš naudojimą buvo sureguliuotas etanoliu spektrofotometre iki {{0}},7±0,05 nm, esant 734 nm. Mes naudojome 30 μL mėginių arba Trolox (Sigma Aldrich⑧, St. Louis, MO), kaip etaloninį etaloną, esant skirtingoms koncentracijoms (5, 10, 25, 50, 75 ir 100 μM), buvo pridėta į 3 ml ABTS* plus tirpalas ir laukiama, kol sureaguos 6 min. Absorbcija buvo matuojama esant 734 nm, lyginant su tuščiuoju mėginiu (etanolis). ABTS· plius valymo pajėgumas buvo apskaičiuotas taip:

ABTS* ir valymo efektas (procentais ){{0}} (1- A0/A1)×100;

kur A0 yra kontrolinės medžiagos absorbcija, o A1 yra mėginio arba etalono absorbcija. Visi nustatymai buvo atlikti trimis egzemplioriais. IC5so reikšmės buvo apskaičiuotos ir išreikštos kaip vidurkis ± SD μM.

3.4.Antileishmania Actoity

Lamazonensis (MHOM/BR88/BA-125Leila padermė) ir Lbraziliensis (MHOM/BR88/BA-3456) promastigotai (1 × 10 laipsnių vienoje duobutėje) buvo auginami 96-šulinėlių plokštelėje Schneider terpė (Sigma-Aldrich⑧, Sent Luisas, MO, JAV), papildyta 10 procentų galvijų vaisiaus serumo (FBS; GIBCO) ir 50 ug mL gentamicino (Life, Carlsbad, CA, JAV) ir apdorota skirtingomis koncentracijomis. 100 μM; šeši Q5 praskiedimai 1–2）. Parazitai buvo inkubuojami 72 valandas 26 laipsnių temperatūroje. Tada per 2 valandas buvo pridėta 20 μl į vieną duobutę AlamarBlue (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA). Skaitymas buvo atliktas spektrofotometru, naudojant 570 ir 600 nm bangos ilgius. Akseninės kultūros slopinimo apskaičiavimas buvo nustatytas remiantis neapdorota kontrole [49].

3.5. Priešuždegiminė ir citotoksinė veikla

3.5.1.Narkotikai

Deksametazonas (Sigma-Aldrich⑧, Sent Luisas, MO, JAV), sintetinis gliukokortikoidas, buvo naudojamas kaip teigiama kontrolė atliekant imunomoduliacinius tyrimus. Doksorubicinas (doksorubicino hidrochloridas, Laboratory IMA SAIC, Buenos Airės, Argentina) buvo naudojamas kaip etaloninis vaistas nuo vėžio. Visi junginiai buvo ištirpinti dimetilsulfokside (DMSO; PanReac, Barselona, ​​Ispanija) ir praskiesti ląstelių auginimo terpėje, kad būtų galima naudoti tyrimuose. Galutinė DMSO koncentracija visuose eksperimentuose buvo mažesnė nei 1 proc.

3.5.2.Gyvūnai

4-10 sav. amžiaus BALB/c pelėms buvo suteiktas Goncalo Moniz instituto/FIOCRUZ-BA vivariumas (IGM, Salvadoras, Bahia, Brazilija), kur jos buvo laikomos narvuose, kuriuose buvo daugiausia penkios pelės. Visi narvai buvo laikomi aklimatizuotoje patalpoje 21 laipsnio ± 1 laipsnio temperatūroje 12-h šviesos / tamsos ciklu, su vandeniu ir maistu ad libitum visą eksperimentinį laikotarpį. Eksperimentus su gyvūnais patvirtino Goncalo Moniz/FIOCRUZ-BA instituto etikos ir gyvūnų naudojimo komitetas (IGM{6}}/15).

3.5.3. Ląstelės

HL-60(žmogaus ūminė promielocitinė leukemija) ir HepG2 (žmogaus hepatoceliulinė karcinoma) buvo gauti iš Amerikos tipo kultūrų kolekcijos – ATCC (Rokvilis, ML.USA). Norint įvertinti kvercetino (O) ir O5 darinio selektyvumą ne vėžinių ląstelių dauginimuisi, buvo naudojama MRC-5 linija (žmogaus plaučių fibroblastas), taip pat gauta iš ATCC. Ląstelių linijos buvo auginamos ląstelėje. kultūriniai buteliai (75 cm3 250 ml tūrio), naudojant RPMI 1640 auginimo terpę (GibcoTM), papildytą 10 procentų galvijų vaisiaus serumu (GibcoM) ir 50 ug/ml gentamicino (GibcoTM). Ląstelės buvo laikomos inkubatoriuose su 5 procentų atmosfera. CO, 37 laipsnių ir stebimas kasdien. Visos ląstelių linijos buvo tiriamos dėl mikoplazmos naudojant Hoechst dažymo mikoplazmos aptikimo rinkinį (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, JAV). C6 ląstelių linija buvo gauta iš žiurkių glijos navikų, sukeltų n-nitrozometilkarbamido [50]. Šios gliomos ląstelės buvo kultivuojamos, kaip aprašyta de Oliveira ir kt. [51]. Ląstelės buvo inkubuojamos 37 laipsnių temperatūroje drėgname inkubatoriuje, esant 5 procentams CO2. C6 ląstelės buvo auginamos ant ląstelių kultūros lėkštelių (100-mm Ø, TPP) DMEM terpėje, papildytoje 100 UI/mL penicilino G, 100 ug/ml streptomicino, 7 mM gliukozės, 2 mM L-glutamino, 1 mM piruvato, ir 10 procentų vaisiaus veršelio serumo. Auginimo terpė buvo keičiama kas 2 dienas. Likus 24 valandoms iki apdorojimo, C6 ląstelės buvo pasėtos į 35 mm skersmens Petri lėkštes arba 96-šulinėlių plokšteles, kurių tankis buvo 3,5 × 10* ląstelių/šulinėlių.

Visos ląstelių linijos buvo tiriamos dėl mikoplazmos, naudojant Mycoplasma Stain Kit (Sigma-Aldrich), kad būtų patvirtintas neužterštų ląstelių naudojimas. Informacija apie ląstelių linijas yra duomenų bazėje „Rio de Žaneiro ląstelių bankas (BCRJ)“: HepG2 ląstelė (kodas: 0291), HL-60 ląstelė (kodas: 0104) ir C6 ląstelė (kodas: 0057) .

3.5.4. Citotoksinio aktyvumo tyrimas

Norint įvertinti tiriamų junginių (Q ir Q5) citotoksiškumą HL-60 (žmogaus ūminė promielocitinė leukemija) ir HepG2 ląstelėms, buvo naudojamas Alamar Blue (Invitrogen, Carlsbad, CA, JAV) kolorimetrinis metodas. Alamar Blue (resazurinas) yra indikatorius, sukeliantis kolorimetrinį pokytį ir fluorescencinį signalą, reaguodamas į metabolinį aktyvumą. Metaboliškai aktyvios ląstelės resazuriną redukuoja į resorufiną. Oksiduota forma yra mėlyna (nefluorescencinė / negyvybinga ląstelė), o redukuota forma yra rausva (fluorescencinė / gyvybinga ląstelė). Resazurino sumažinimas iki resorufino atspindi ląstelių gyvybingumą [52].

Atliekant tyrimą, ląstelės buvo paskirstytos {{0}}šulinėlių plokštelėse iš anksto nustatytu tankiu 0,3 × 1{{10}} laipsnio ląstelių/ml ląstelėms HL-60 linija ir 0,7 × 10 ląstelių/mL HepG2 linijos ląstelėms. Junginiai buvo dedami iš aštuonių koncentracijų (nuo 80 iki 0,62 uM), išskyrus doksorubiciną, kuris buvo naudojamas koncentracijomis nuo 0,003 iki 5 μM. Neigiama kontrolė gavo tokį patį kiekį DMSO (0,025 proc.). Plokštelės buvo inkubuojamos 72 valandas orkaitėje 37 laipsnių temperatūroje ir 5 proc. CO2. Po šio laikotarpio buvo pridėta 20 μl / duobutę Alamar Blue ir plokštelės buvo inkubuojamos dar 4 valandas. Plokštelės buvo nuskaitytos naudojant spektrofotometrą (Spectramax 190, Molecular Devices, Sunnyvale, CA, JAV), esant 570 ir 600 nm bangos ilgiams.

C6 ląstelių gyvybingumas buvo nustatytas naudojant kolorimetrinį metodą, aprašytą Hansen ir kt. [53]. MTT (3-4,5-dimetiltiazol-2-il,25-difeniltetrazolio bromidas) buvo ištirpintas 5 mg/ml koncentracijos steriliame fosfatiniu buferiniu tirpalu (PBS) kambaryje. temperatūroje, o tirpalas toliau sterilizuojamas praleidžiant per 0.2- mm filtrą ir laikomas 4 laipsnių temperatūroje tamsoje. Atliekant tyrimą, ląstelės buvo paskirstytos 96-šulinėlių plokštelėse iš anksto nustatytu 3,5 × 10* ląstelių/ml tankiu C6 ląstelių linijai. Junginiai buvo dedami aštuoniomis koncentracijomis (nuo 80 iki 0,39 uM).

Į kiekvieną šulinėlį buvo pridėta MTT, kurios galutinė koncentracija buvo 2 mg / ml, ir ląstelės buvo inkubuojamos 2 valandas. Po to ląstelės buvo lizuojamos 20 procentų (m/ø) natrio dodecilsulfatu (SDS) ir 50 procentų (o/ø) dimetilformamido (DMF) tirpalu (pH 4,7), inkubuojant per naktį kambario temperatūroje [54,55]. . Absorbcija buvo matuojama spektrofotometro mikroplokštelių skaitytuvu (570 nm), Thermo ScientificFlash Varioskan (3001 versija, Thermo Fisher Scientific, Vantaa, Suomija). Kiekvienai koncentracijai buvo naudojami aštuoni pakartojimai. Ląstelių gyvybingumas buvo išreikštas kaip absorbcijos procentas esant 570 nm, o kontrolė buvo priimta kaip 100 procentų. Po apdorojimo ląstelių morfologija buvo įvertinta šviesos mikroskopu naudojant optinį mikroskopą („Eclipse TS100“ apverstas mikroskopas, „Nikon Instruments“, Tokijas, Japonija) ir nufotografuotas naudojant skaitmeninę kamerą („Coolpix S4300“, „Nikon Instruments“, Tokijas, Japonija).

3.5.5. Makrofagų kultūra

Pilvaplėvės eksudato makrofagai (2 × 105 ląstelės / duobutėje) buvo inkubuojami 96-šulinėlių plokštelėse DMEM terpėje, papildytoje 10 procentų PBS ir 50 ug/ml gentamicino, trimis egzemplioriais, stimuliuojami arba nestimuliuojami LPS (500 ng/mL) ir IFN-y (5 ng/mL) ir apdorotas arba neapdorotas skirtingomis junginių koncentracijomis (20,40 ir 80 uM). Ląstelės buvo laikomos inkubatoriuje 37 laipsnių temperatūroje ir 5 proc. CO2 4 24 val. Pasibaigus šiam laikotarpiui, kultūros supernatantai buvo paimti citokinams ir azoto oksido dozėms nustatyti. Kai kuriuose tyrimuose, siekiant įvertinti citotoksiškumą, supernatantas buvo pakeistas terpės plius 10 procentų Alamar Blue (Invitrogen, Carlsbad, CA, JAV) ir plokštelės. buvo inkubuojami dar 4 val. Spektrofotometro rodmenys buvo atlikti esant 570 ir 600 nm.

3.5.6. TNF dozavimas

TNF matavimas atliktas iš ląstelių kultūros supernatantų, naudojant sumuštinių ELISA metodiką, naudojant Development System kitsDuoset ELISA (R&D Systems, Mineapolis, MI, USA), pagal gamintojo rekomendacijas. ELISA plokštelės (NUNC-IMMUNO PLATE Maxisorp paviršius) buvo jautrinamos 50 μL/šulinėliais fiksuojančių antikūnų, kurių koncentracija 2 ug/mL, praskiestos PBS 1x ir inkubuojamos 16 valandų 4 laipsnių temperatūroje. Plokštelės tris kartus plaunamos 1 × PBS/0.05 procentai tween 20 ir blokuojamos 100 μL/šulinėlio 1 × PBS ir 0,05 procento tween 20 ir 0,1 procento galvijų albumino 2 val. .

Tada 50 μl mėginių duobutei, tuščioji ir standartinė rekombinantų, praskiestų Tris-fiziologinio tirpalo buferiu (20 mM Trix bazėje ir 150 mM NaCl), kreivė, kurioje yra Kambario temperatūroje 2 valandas buvo pridėta 0,1 procento galvijų albumino ir 0,05 procento tween 20. Standartas buvo skiedžiamas nuosekliai (1:2) nuo pradinės koncentracijos 2000 pg/mL su 11 dvigubų skiedimų. Plokštelė tris kartus plaunama PBS/0,05 procento tween ir 2 valandas inkubuojama su 50 μl aptikimo antikūno (biotinilinto), kurio koncentracija buvo 400 ng/ml.

Plokštelė tris kartus plaunama PBS/{0}},05 proc. tween ir 20 min. inkubuojama su avidino peroksidaze, praskiesta santykiu 1:200. Kūrimas buvo atliktas pridedant TMB substrato (Thermo Fisher) ir nutraukiant 0, 05 M fosforo rūgštimi. Reakcijos rodmuo buvo nustatytas naudojant spektrofotometrą (Spectramax) (Molecular Devices, San Chosė, CA, JAV) su 450 nm filtru. Analizės buvo atliktos naudojant Softmax 4.3.1 programinę įrangą (Molecular Devices, San Chosė, CA, JAV).

3.5.7.Azoto oksido dozavimas

Nitrito gamyba makrofagų supernatantuose buvo įvertinta kiekybiškai įvertinus oksidacinį produktą, nitritą, Grieso metodu [50]. Absorbcija buvo nustatyta spektrofotometru (Spectramax) (Molecular Devices, San Chosė, CA, JAV), su 570 nm filtru. Analizė buvo atlikta naudojant Softmax Software 4.3.1 (Molecular Devices, San Chosė, CA, JAV), o rezultatai buvo išreikšti μM nitrito, remiantis standartine natrio nitrito kreive, kurios pradinė koncentracija yra 400 uM.

3.6. Statistinė analizė

Tyrimų grupių palyginimų statistiniam reikšmingumui nustatyti buvo naudojamas vienpusis ANOVA testas, po kurio buvo atliktas Bonferroni daugkartinis palyginimas. Rezultatai buvo laikomi statistiškai reikšmingais, kai p<0.05. all="" analyses="" were="" performed="" using="" the="" graphpad="" prism="" version="" 5.01="" program="" (graphpad="" software,="" san="" diego,="" ca,="">

4. Išvados

Kvercetino analogų sąlygų ir reakcijų sintezės terpės parodė efektyvumą gaunant vieną tinkamai apibūdintą junginį, remiantis literatūroje aprašytais duomenimis. Lyginamoji Q ir Q5 antioksidacinio aktyvumo analizė parodė, kad kvercetinas (O) aktyviau pašalino ABTS* ir radikalą nei O5 (atitinkamai 29 proc. ir 18 proc.). Sumažėjęs antioksidacinis potencialas neparodė trukdžių imunomoduliuojančiai ir priešnavikinei veiklai. Šiame tyrime pasiūlytos cheminės modifikacijos sustiprino antiproliferacinį poveikį ir išlaikė priešuždegiminį aktyvumą, bet ne citotoksiškumą sveikose ištirtose ląstelėse.

Esamas acetilintas darinys (Q5) pagerino citotoksiškumą vėžio kepenų ląstelių (HepG2), promielocitinės leukemijos (LH-60) ląstelėse ir ypač gliomos (C6) ląstelėse. Žiurkių gliomos C6 ląstelės, kuriomis prekiaujama, parodė morfologinį precedento neturintį ląstelių mirties modelį. Q5, esant 50 μM 24 valandas, sukėlė C6gliomos ląstelių morfologijos pokyčius, kuriems būdinga apvali kūno forma (apie tai nebuvo pranešta mokslinėje literatūroje), skirtingai nei kvercetinas, kurio morfologija buvo panaši į fibroblastus.

Reikia atlikti tolesnius tyrimus, kad būtų galima geriau suprasti acetilintų kvercetino darinių poveikį, ypač neuronų ląstelėse. Šis tyrimas leido pirmą kartą panaudoti struktūriškai modifikuotą kvercetiną nervų ląstelėse dėl galimo neuroprotekcinio poveikio.

Nuorodos

1. Formica, JV; Regelson, W. Kvercetino ir susijusių bioflavonoidų biologijos apžvalga. Food Chem. Toksikolis. 1995, 33, 1061–1080. [CrossRef]

2. Materska, M. Kvercetinas ir jo dariniai: cheminė struktūra ir biologinis aktyvumas – apžvalga. Pol. J. Food Nutr. Sci. 2008, 58, 407–413.

3. Wang, TY; Li, Q.; Bi, KS Bioaktyvūs flavonoidai vaistiniuose augaluose: struktūra, veikla ir biologinis likimas. Azijos J. Pharm. Sci. 2018, 13, 12–23. [CrossRef] [PubMed]

4. D'Andrea, G. Quercetin: flflavonolis su įvairiomis terapinėmis priemonėmis? Fitoterapija 2015, 106, 256–271. [CrossRef]

5. Araújo, MV; Queiroz, AC; Silva, JFM; Silva, AE; Silva, JKS; Silva, GR; Silva, ECO; Souza, ST; Fonseca, EJS; Camara, Kalifornija; ir kt. Flavonoidai sukelia ląstelių mirtį Leishmania amazonensis: In vitro apibūdinimas srauto citometrija ir Ramano spektroskopija. Analitikas 2019, 144, 5232–5244. [CrossRef] [PubMed]

6. Faixová, D.; Hrˇcková, G.; Kubašková, TM; Mudro ˇnová, D. Antiparazitinis atrinktų izoflavonų poveikis fliplokščiais kirminams. Helmintologija 2021, 58, 1–16. [CrossRef]

7. Manjolin, LC; Reisas, MBG; Maquiaveli, CC; Santos-Filho, OA; Silva, ER Dietiniai flavonoidai fisetinas, liuteolinas ir jų dariniai slopina arginazę, pagrindinį fermentą, susijusį su Leishmania (Leishmania) amazonensis infekcija. Food Chem. 2013, 141, 2253–2262. [CrossRef]

8. Tasdemiras, D.; Kaizeris, M.; Brunas, R.; Yardley, V.; Schmidt, TJ; Tosunas, F.; Rüedi1, P. Antitripanosominė ir antileishmaninė flflavonoidų ir jų analogų veikla: in vitro, in vivo, struktūros ir aktyvumo ryšio ir kiekybiniai struktūros ir aktyvumo ryšio tyrimai. Antimikrobinis. Chemother agentai. 2006, 50, 1352–1364. [CrossRef] 9. Lee, WJ; Hsiao, M.; Chang, JL; Yang, SF; Tseng, TH; Chang, CW; Čau, JM; Linas, KH; Linas, YW; Liu, CC; ir kt. Kvercetinas sukelia mitochondrijų sukeltą apoptozę per reaktyviųjų deguonies rūšių sukeltą ERK aktyvavimą HL-60 leukemijos ląstelėse ir ksenografe. Arch. Toksikolis. 2015, 89, 1103–1117. [CrossRef]

10. Drummondas, EM; Harbourne, N.; Maretė, E.; Martynas, D.; Jacquier, J.; O'Riordanas, D.; Gibney, ER Priešuždegiminių biomarkerių slopinimas THP1 makrofaguose polifenoliais, gautais iš ramunėlių, pievinių smėlų ir gluosnių žievės. Phytother Res. 2013, 27, 588–594. [CrossRef]