Wen-Lan Li, Jing-Xin Ding, Jing Bai, Yang Hu, Hui Song, Xiang-Ming Sun, Yu-Bin Ji

Norėdami gauti daugiau informacijos, kreipkitės:Joanna.jia@wecistanche.com

Abstraktus

LC technologija yra visame pasaulyje pripažintas metodas tradicinių kinų vaistų (TCM) kokybei įvertinti. TCM kokybė turi tiesioginės įtakos jo veiksmingumui. Todėl norint nuodugniai atskleisti, kaip TCM veikia savo veiksmingumu, pirmiausia reikia suprasti jo veiksmingumo materialinį pagrindą, o tada kontroliuoti veikliųjų junginių kokybę. Spektro ir poveikio ryšio metodo taikymas yra labai svarbus nustatant farmakologinę medžiagą. Šio darbo tikslas buvo ištirti pagrindines sąsajas tarp cheminių profilių ir estrogeninio aktyvumo.Cistanche, atskleisti aktyvius junginius. Cheminiai profiliaiCistanchebuvo užfiksuoti naudojant HPLC/Q-TOF-MS/MS, o estrogeninis aktyvumas buvo nustatytas gimdos augimo testu ir MTT tyrimu. Tada sujungus dvimatės analizės, pagrindinių komponentų analizės ir pilkosios koreliacinės analizės metodo rezultatus, buvo nustatyta penkiolika veikliųjų junginių. Tai yra 8-epilogano rūgštis, salidrozidas, siringalidas A 3'- -l-ramnopiranozidas, cistanosidas A, echinakozidas, cistanosidas F, cistanosidas B, cistanosidas C, osmantusidas B, akteozidas, izoakteozidas, tubulozidas B, 2 '-acetilaktozidas ir du nežinomi junginiai. Šis tyrimas sudaro pagrindą tyrimams in vivoCistancheir jo klinikiniam pritaikymui plėtoti.

Cistanchekanalėlių

Raktiniai žodžiai:Cistanchedeserticola; LC/Q-TOF-MS; estrogeninis aktyvumas; pagrindinių komponentų analizė (PCA); Gimdos augimo testas.

Santrumpos

TCM: tradicinė kinų medicina

HPLC/Q-TOF-MS: didelio efektyvumo skysčių chromatografija/kvadrupolio skrydžio laiko masės spektrometrija

BA: dvimatė analizė

PCA: pagrindinių komponentų analizė

GCAM: pilkosios koreliacinės analizės metodas

MTT: tripsinas, 3-(4, 5-dimetiltiazol-2-il)-2, 5-difeniltetrazoliumbromidas

DMSO: dimetilsulfoksidas

RPMI1640 Roswell Park memorial Institute 1640

1. Įvadas

Pastaruoju metu TCM vis labiau populiarėja Azijos ir Vakarų šalyse dėl stabilaus gydomojo poveikio ir mažo toksiškumo klinikoje. Dėl to būtina sukurti naujus TCM tipus ir suprasti veiksmingas kompozicijas, naudojamas jų klinikinio taikymo metu [1-6].

Pirma, tiriamas spektro ir poveikio ryšys, siekiant nustatyti ryšį tarp chromatografinio pirštų atspaudo ir farmakodinamikos efektyvumo. Tada naudokite santykius ieškant veiksmingų TCM komponentų ir suformuluoti kontrolės standartus, atspindinčius jų vidinę kokybę. Spektro ir poveikio ryšys buvo taikomas daugelyje TCM tyrimų sričių, pvz., pavienio ir sudėtinio TCM materialinis pagrindas, komponentų suderinamumas, apdorojimo mechanizmas, farmakologinio poveikio prognozė ir technologijos optimizavimas [7-12]. Spektro ir poveikio ryšys naudojamas pateikiant naujas idėjas ir metodus, kaip tirti veikliąsias medžiagas, optimizuoti formules, tobulinti paruošimo procesus, sekti ir atskirti tikslines sudedamąsias dalis bei kurti naujus TCM vaistus [13-17].

Cistanchebuvo plačiai naudojamas lytinės funkcijos sutrikimui, vidurių užkietėjimui, prostatitui ir inkstų nepakankamumui gydyti. Jis turi platų biologinio aktyvumo spektrą, įskaitant estrogeninį, senėjimą stabdantį, antioksidacinį ir imuninį poveikį [18-19]. Paprastai feniletanoidiniai glikozidai (pvz., cistanosidas A, tubulozidas A), lignanai ir iridoidiniai glikozidai buvo laikomi farmakologinėmis sudedamosiomis dalimis ir cheminiais žymenimis, skirtais Cistanche ir jo produktų kokybei kontroliuoti [20-21]. Cistanche cheminiai spektrai iš skirtingų sričių buvo užfiksuoti naudojant didelio efektyvumo skysčių chromatografiją (HPLC) [22-23]. Šiame tyrime mes pasirenkame gimdos augimo testą ir MCF7 ląstelių proliferacijos tyrimą, kad įvertintume jų estrogeninį aktyvumą. Estrogeniniam aktyvumui koreliuoti su atskirais komponentais buvo naudojami pagrindinių komponentų analizė, dvimatė analizė ir pilkosios koreliacijos analizės metodai. Šiuo tyrimu buvo siekiama nustatyti biologiškai aktyvius Cistanche junginius, atsakingus už estrogeninį poveikį in vivo. Tyrimas sudaro pagrindą nuodugnioms Cistanche studijoms.

Visas eksperimentines procedūras peržiūrėjo ir patvirtino Harbino komercijos universiteto Gyvūnų etikos komitetas.

Cistanchedeserticola (cd-20120227-005) buvo nupirkta iš vaistų rinkos ir ją nustatė prof. Zhang Delian (Harbino komercijos universitetas). Dietilstilbestrolis buvo įsigytas iš HEFEI JIULIAN PHARMACEUTICAL CO., LTD. RPMI1640 ir RPMI1640 be fenolio raudonojo buvo įsigyti iš HyClone Company (JAV). MTT ir DMSO buvo įsigyti iš Sigma-Aldrich Co. LLC (St Louis, JAV). Žmogaus krūties vėžio MCF7 ląstelių liniją pateikė Gyvybės mokslų ir aplinkos mokslų tyrimų centras (Harbino komercijos universitetas). Naudoti šie standartai: akteozidas (111530- 200505), echinakozidas (111670-200503) ir salidrosidas (110736-200628) buvo gauti iš Nacionalinio farmacijos ir biologinių produktų kontrolės instituto (Pekinas). , Kinija). Acetonitrilas, metanolis ir skruzdžių rūgštis buvo MS klasės, o vanduo buvo ypač grynas. Kiti reagentai buvo analitinės kokybės ir buvo parduodami.

2 Eksperimento procedūra

2.1 Medžiagos

„Agilent 1290 HPLC“ sistema, „Agilent 6530“ serijos keturpolio skrydžio laiko LC/MS (Q-TOF) sistema ir cheminės HPLC{5}}D darbo stotys buvo naudojamos analitiniams chemijos eksperimentams ir duomenų apdorojimui. Mėginiams ir etalonams ruošti buvo naudojamas Milli-Q itin grynas vanduo. Papildomi prietaisai buvo elektroninis analitinis balansas AR1140 (Ohaus International Ltd), 680 mikroplokštelių skaitytuvas (Bio-Rad Corporation) ir 64R didelės spartos centrifuga (Beckman Coulter Allegra).

Nesubrendusios Kunming pelių patelės (apie 21 d. gimimo, nujunkytos), sveriančios (12 ± 2) g, buvo įsigytos iš Čangčuno nacionalinės biologinės pramonės bazės laboratorijos gyvūnų centro (Changchun, Kinija). Pelės buvo laikomos reguliuojamos temperatūros patalpoje (22 ± 2 laipsniai) su neribota prieiga prie maisto ir vandens. Eksperimentai su gyvūnais buvo pradėti po penkių dienų aklimatizacijos. Prieš skiriant bandomuosius tirpalus, pelės buvo nevalgytos per naktį, laisvai prieiga prie vandens. Šis tyrimas buvo atliktas griežtai laikantis Nacionalinių sveikatos institutų laboratorinių gyvūnų priežiūros ir naudojimo vadovo rekomendacijų.

2.2 Mėginio tirpalo paruošimas

CistancheMėginiai buvo paimti iš dešimties skirtingų buveinių, būtent Neimengo, Sindziango, Ningxia, Guidžou, Chaidamu, Xizang, Alashan, Qinghai, Sichuan ir Hubei provincijos.

Tirpalas (1.0 g/mL)Cistanchemėginys buvo paruoštas distiliuotame vandenyje, skirtas vartoti per burną. Dietilstilboestrolio koncentracija buvo 20 ug/mL ir buvo naudojamas kaip teigiamas kontrolinis tirpalas. Cistanche mėginio tirpalas (1.{5}} g/mL) buvo paruoštas 50 procentų acetonitrile. Akteozidas, echinakozidas ir salidrosidas (po 2,0 mg) buvo ištirpinti 10 ml 50 procentų acetonitrilo tirpalo. Ir mėginys, ir standartiniai tirpalai prieš analizę buvo filtruojami naudojant 045-μm filtrą.

2.3 LC-MS sąlygos

Mėginiams analizuoti buvo naudojamas Waters Symmetry Shield RP18 (3,9 mm × 15 0 mm, 5 μm; Waters Corporation, Milford, MA, JAV). Judančioji fazė susideda iš acetonitrilo (A) ir 0,2 procentų (t/v) skruzdžių rūgšties vandeninio tirpalo (B) ir buvo pumpuojama 0,5 ml/min srauto greičiu. Kiekvieno mėginio įpurškimo tūris buvo 10 μL. Gradiento eliuavimo programa buvo tokia: judrioji fazė A buvo pradėta 5 proc., o po 35 min tiesiškai padidinta iki 23 proc. Vėliau tirpalas A buvo padidintas iki 25 procentų (35–65 min.). Tada judrioji fazė A buvo sumažinta iki 5 procentų paskutines 5 minutes (nuo 65 iki 70 min.). Kolonėlės temperatūra buvo palaikoma 30 laipsnių. Chromatogramos buvo stebimos esant 254 nm. Purškimo dujų slėgis buvo 30 psi, o kapiliarų įtampa buvo 3,5 kV. Sausų dujų srautas buvo nustatytas iki 8 L/min, esant 30 laipsnių temperatūrai. Masės spektrai buvo įrašyti skenavimo diapazone 100- 3,000 Da ir buvo neigiamų jonų nuskaitymo režimu.

2.4 Pirštų atspaudų įvertinimas

Mėginių, paimtų iš 10 skirtingų partijų, LC pirštų atspaudai buvo nustatyti ir automatiškai suderinti naudojant TCM chromatografinio pirštų atspaudų panašumo vertinimo sistemą (2012 m. versija; Kinijos farmakopėjos komitetas, Pekinas, Kinija). Be to, etaloninės chromatogramos žemėlapis buvo sukurtas naudojant medianos metodą. Be to, siekiant įvertinti mėginių iš dešimties skirtingų buveinių kokybę, buvo taikoma klasterinė analizė.

2.5 Pagrindinių komponentų analizė (PCA)

PCA yra daugiamatis statistinis metodas. Jis gali išsaugoti pakankamai informacijos iš duomenų gavimo. Šiame tyrime charakteringos LC chromatogramų smailės buvo toliau tikrinamos PCA ir buvo siekiama nustatyti aktyvius junginius, remiantis spektro ir poveikio ryšiu.

2.6 Gimdos augimo testas

Pelės buvo suskirstytos į 12 grupių (po 1 0 grupėje). Mėginių tirpalai, paruošti iš Cistanche, buvo paimti iš dešimties skirtingų buveinių ir buvo vartojami du kartus per dieną (ryte ir vakare) zondu po 30 g/kg kūno svorio keturias dienas. Tuščiosios ir teigiamos kontrolinės grupės sudarė vienodus distiliuoto vandens ir dietilstilboestrolio tirpalo tūrius ir buvo vartojamos du kartus per dieną keturias dienas. Penktą dieną narkotinių medžiagų turintys kraujo mėginiai buvo paimti iš anestezuotų pelių. Mėginiai buvo centrifuguojami (5, 000 aps./min., 10 min.), o supernatantai (serumo mėginiai, kurių sudėtyje yra vaistų) buvo atskirti. Serumo mėginiai, kurių sudėtyje yra vaistų, buvo inaktyvuoti kaitinant 56 laipsnių vandens vonioje 30 minučių ir prieš MTT tyrimą buvo filtruojami per 022- μm filtrą. Tuo pačiu metu pelių gimdos buvo nedelsiant iškirptos ir pasvertos, kad būtų galima apskaičiuoti gimdos svorio indeksus. Eksperimentai su gyvūnais buvo pradėti po penkių dienų aklimatizacijos. Prieš skiriant bandomuosius tirpalus, pelės nevalgė per naktį ir laisvai galėjo gauti vandens. Šis tyrimas buvo atliktas griežtai laikantis Nacionalinių sveikatos institutų laboratorinių gyvūnų priežiūros ir naudojimo vadovo rekomendacijų. Visas eksperimentines procedūras peržiūrėjo ir patvirtino Harbino komercijos universiteto Gyvūnų etikos komitetas. Visos potencialiai įtemptos procedūros buvo atliktos taikant natrio pentobarbitalio anesteziją.

2.7 MTT tyrimas

MCF7 ląstelės buvo kultivuojamos kartu su RPMI 1640 be fenolio raudonojo (turinčioje 5 proc. CDT-FBS) keturias dienas. Ląstelės buvo pasėtos į 96-šulinėlių plokšteles, kurių tankis buvo 2,000 ląstelės/šulinėlyje. Buvo pasiekta prilipusi kultūra ir po 72 valandų kultivavimo ląstelės buvo kartu kultivuojamos RPMI 1640 terpėje, kurioje buvo Cistanche apdorotų pelių serumo mėginiai. Eksperimentai buvo atlikti šešiais pakartojimais. Vėliau į kiekvieną šulinėlį buvo pridėta 20 μL MTT tirpalo (5 mg / ml PBS) ir ląstelės buvo inkubuojamos 4 valandas. Pašalinus terpę, formazano produktui gauti buvo pridėta 150 µL DMSO, o plokštelės buvo sukratytos tamsoje, kad visiškai ištirptų. Sugertis buvo matuojama esant 570 nm, naudojant mikroplokštelių skaitytuvą. Proliferacijos greitis buvo apskaičiuotas kaip vidutinė vaisto turinčios serumo grupės absorbcijos vertė, padalinta iš tuščiosios kontrolinės grupės (ląstelės, kartu kultivuotos RPMI 1640 be serumo) vidutinės absorbcijos vertės.

2.8 Statistinė analizė

Suporuotos imties t testas (dviejų uodegų) buvo naudojamas statistiškai reikšmingiems skirtumams tarp tuščiųjų kontrolinių ir eksperimentinių grupių verčių nustatyti. Skirtumai buvo laikomi reikšmingais esant 95 procentų patikimumo lygiui (p <>

PCA buvo naudojamas siekiant įvertinti būdingas smailių sritis dešimties skirtingų buveinių mėginių chromatogramose. Smailių plotų ir jų estrogeninio aktyvumo koreliacijai įvertinti buvo naudojama dvimatinė analizė ir Gray koreliacinė analizė. Koreliacija buvo apskaičiuota naudojant SPSS statistikos programinės įrangos statistiką (SPSS for Windows 21.0, SPSS Inc., JAV). Skirtumai buvo laikomi reikšmingais esant 95 procentų patikimumo lygiui (dviejų dalių).

Etinis patvirtinimas: atliktas tyrimas nėra susijęs nei su žmonių, nei su gyvūnų naudojimu.

3 Rezultatai ir diskusija

3.1 Klasterių analizė ir panašumo vertinimas

Santykinis standartinis sulaikymo laiko ir būdingų smailių smailių ploto nuokrypis buvo {{0}},58 ir 0,34 proc. tikslumui, 0.52 ir {{8} },31 proc. atkuriamumui ir {{10}},19 ir 0,13 proc. stabilumui. Šios išvados parodė, kad mūsų LC pirštų atspaudų nustatymo metodas buvo pagrįstas ir patikimas. Dešimties mėginių chromatogramų panašumai buvo didesni nei 0,9. Bendros visų mėginių smailės negalėjo visiškai atspindėti būdingų Cistanche sudedamųjų dalių, nes smailė galėjo būti prarasta. Todėl mėginio atitikimo skaičius buvo pakoreguotas nuo 26 iki 20, kad būtų gautas tikslesnis chromatogramos žemėlapis. Iš viso buvo gautos 26 smailės, o jų plotų suma buvo didesnė nei 0, 8, palyginti su visu mėginio smailių plotu. Todėl padarėme išvadą, kad šios chromatografinės smailės gali veiksmingai atspindėti pagrindines chemines Cistanche sudedamąsias dalis. Klasterių analizės rezultatai parodyti 1 paveiksle. Iš viso dešimt įvairių buveinių buvo suskirstytos į tris kategorijas taip: (A) 2, Guizhou; 3, Činghajus; 4, Chaidamu; 10, Neimengas; 7, Sindziangas ir 6, Sičuanas. (B) 1, Xizang; 8, Ningxia ir 5, Alashan. (C) 9, Hubėjus. Klasterinės analizės tendencija parodė, kad vaistažolių buveinės yra panašios, kai yra slenksčio apačioje. Tačiau didėjant slenksčiui, klimatas ir buveinių augimo sąlygos yra artimos. Tai rodo, kad klasterių analizė gali ne tik gerai atskirti įvairias buveines, bet ir atspindėti jų giminingumą.

3.2 Cheminių sudedamųjų dalių identifikavimas

Based on the synergy between components, TCM exerted pharmacological effects. Certain studies have been conducted to identify the chemical compositions of C. deserticola [24-26]. The correlation of inherent constituents with their activities indicated that they could be identified based on the combination of LC with the corresponding indices of pharmacological activity. Q-TOF-MS is suitable for multi-constituent identification of TCM since it can provide the exact molecular mass because of its high resolution. A total of 26 compounds were identified by analyzing the primary and secondary MS data. PCA was used to assess whether these compounds concerning their oestrogenic activity. A contribution of the activity is indicated by an eigenvalue higher than 1 (> 1) and a cumulative contribution rate of variables higher than 0.8 (>0.8). Kuo didesnė Eigeno krūvio absoliuti reikšmė, tuo didesnė junginių įtaka estrogeniniams rodikliams.

Cistanche ir standartinių mėginių chromatogramos buvo palygintos, siekiant identifikuoti atskirus komponentus tomis pačiomis LC-MS sąlygomis. Kaip parodyta 1 lentelėje, iš viso buvo nustatytos 26 sudedamosios dalys, remiantis sulaikymo trukme ir MS duomenimis [24-26]. Veikliosios sudedamosios dalys yra vartojamos per burną mišinių, o ne monomerų pavidalu, nes tradicinė kinų medicina yra mišinio forma, kuri atlieka gydomąjį vaidmenį. Nenustatyta, kad vienas junginys po individualaus atskyrimo vaidintų vaidmenį. Mūsų tikslas yra atskleisti junginius, kurie žinomuose Cistanche [23-30] komponentuose turi estrogeninį aktyvumą, todėl jų tapatybei patvirtinti nepasirinko BMR ir kitų techninių priemonių. 1 smailė nurodė vyraujantį deprotonuotą joną, kurio m/z santykis yra 373 (C16H22O10), kuris buvo identiškas genipozido rūgšties elementinei sudėčiai. Tai patvirtino gliukozės dalies praradimas, kuris davė fragmento joną, kurio m/z santykis yra 211. 2 smailė parodė vyraujantį deprotonuotą joną, kurio m/z santykis yra 461 (C20H30O12), kuris buvo identiškas elementų sudėčiai. dekofeoilakteozido, ir jį patvirtino ramnozilo fragmento praradimas, susidaręs fragmentas, kurio m/z santykis yra 315. 4 smailė parodė vyraujantį deprotonuotą joną, kurio m/z santykis yra 375 (C16H24O10), kuris buvo identiškas elementinė 8-epilogano rūgšties sudėtis. Gliukozės dalies praradimas, susidaręs suskaidymas, kurio m / z santykis yra 213, dar labiau patvirtino išvadą. 6 smailė nurodė vyraujantį deprotonuotą joną, kurio m/z santykis yra 607 (C29H36O14), kuris buvo identiškas siringalido A3'- - l-ramnopiranozido elementinei sudėčiai.

Išvadą dar labiau patvirtino kofeino dalies praradimas, sudarytas fragmento jonas, kurio m / z santykis yra 445. 8 smailė nurodė vyraujantį deprotonuotą joną, kurio m/z santykis yra 799 (C36H48O20), kuris buvo identiškas cistanozido A elementinei sudėčiai. Praradus kofeino fragmentą, susidarė fragmento jonas, kurio m/z santykis yra 637, dar labiau palaikė išvadą. 11 smailė parodė vyraujantį deprotonuotą joną, kurio m/z santykis yra 487 (C21H28O13 ), kuris buvo identiškas cistanozido F elementinei sudėčiai. Tai patvirtino ramnozilo fragmento praradimas, kuris davė fragmento joną, kurio m/z santykis buvo 341, o praradus kitą kofeino fragmentą susidarė fragmento jonas, kurio m/z santykis yra 179, dar labiau patvirtino išvadą. 12 smailė parodė vyraujantį deprotonuotą joną, kurio m/z santykis yra 813 (C37H50O20), kuris buvo identiškas cistanozido B elementinei sudėčiai. Dėl gliukozės dalies praradimo susidarė fragmento jonas, kurio m/z santykis yra 651, dar labiau palaikė išvadą. 13 smailė parodė vyraujantį deprotonuotą joną, kurio m/z santykis yra 827 (C37H48O21), kuris buvo identiškas tubulozido A elementinei sudėčiai. Praradus ramnozilo fragmentą, susidarė fragmentacija, kurios m/z santykis buvo 681. palaikė išvadą. 14 smailė nurodė vyraujantį deprotonuotą joną, kurio m/z santykis yra 637 (C30H38O15), kuris buvo identiškas cistanozido C elementinei sudėčiai. Praradus ramnozilo fragmentą, susidarė fragmento jonas, kurio m/z santykis yra 491, dar labiau palaikė išvadą.

15 smailė nurodė vyraujantį deprotonuotą joną, kurio m/z santykis yra 591 (C29H36O13), kuris buvo identiškas osmantusido B elementinei sudėčiai. Praradus ramnozilo fragmentą, susidarė fragmento jonas, kurio m/z santykis yra 445, dar labiau palaikė išvadą. 16 smailė nurodė vyraujantį deprotonuotą joną, kurio m/z santykis yra 623 (C29H36O15), kuris buvo identiškas elementinei akteozido sudėčiai. Išvadą dar labiau patvirtino kofeino dalies praradimas, sudarytas fragmento jonas, kurio m / z santykis yra 461. 18 smailė nurodė vyraujantį deprotonuotą joną, kurio m/z santykis yra 623 (C29H36O15), kuris buvo identiškas izoakteozido elementinei sudėčiai. Kafo dalies praradimas, priekinė smailė 15, parodė vyraujantį deprotonuotą joną, kurio m/z santykis yra 591 (C29H36O13), kuris buvo identiškas osmantusido B elementinei sudėčiai. Praradus ramnosilo fragmentą, susidarė fragmento jonas su m/z santykis 445, dar labiau patvirtino išvadą. 16 smailė nurodė vyraujantį deprotonuotą joną, kurio m/z santykis yra 623 (C29H36O15), kuris buvo identiškas elementinei akteozido sudėčiai. Išvadą dar labiau patvirtino kofeino dalies praradimas, sudarytas fragmento jonas, kurio m / z santykis yra 461. 17 smailė nurodė vyraujantį deprotonuotą joną, kurio m/z santykis yra 623 (C29H36O15), kuris buvo identiškas cis-akteozido elementinei sudėčiai. Išvadą dar labiau patvirtino kafos dalies praradimas, sudarytas fragmento jodo fragmento jonas, kurio m/z santykis yra 461. 21 smailė nurodė vyraujantį deprotonuotą joną, kurio m/z santykis yra 653 (C30H38O16), kuris buvo identiškas kampneozido Ⅰ elementinei sudėčiai.

Praradus kofeino fragmentą, susidarė fragmento jonas, kurio m/z santykis yra 491, o praradus kitą ramnozilo fragmentą, susidarė fragmento jonas, kurio m/z santykis buvo 345, o tai dar labiau patvirtina išvadą. 22 smailė parodė vyraujantį deprotonuotą joną, kurio m/z santykis yra 665 (C31H38O16), kuris buvo identiškas tubulozido B elementinei sudėčiai. Praradus CH3 CO fragmentą, susidarė fragmento jonas, kurio m/z santykis yra 623, ir praradus kitą caff fragmentą, susidarė fragmento jonas, kurio m/z santykis yra 461, o tai dar labiau patvirtina išvadą. 23 smailė nurodė vyraujantį deprotonuotą joną, kurio m/z santykis yra 639 (C29H36O16), kuris buvo identiškas kampneozido elementinei sudėčiai. Ramnozilo fragmento praradimas, susidaręs fragmento jonas, kurio m/z santykis yra 493, dar labiau patvirtino išvadą. 24 smailė nurodė vyraujantį deprotonuotą joną, kurio m/z santykis yra 665 (C31H38O16), kuris buvo identiškas 2'-acetilaktozido elementinei sudėčiai. Praradus Ac fragmentą, susidarė fragmento jonas, kurio m/z santykis yra 623, o praradus kitą caff dalį, susidarė fragmento jonas, kurio m/z santykis yra 461, o tai dar labiau patvirtina išvadą. 25 smailė nurodė vyraujantį deprotonuotą joną, kurio m/z santykis yra 445 (C20H30O11), kuris buvo identiškas cistanozido G elementinei sudėčiai. Praradus ramnozilo fragmentą, susidarė fragmento jonas, kurio m/z santykis yra 299, dar labiau palaikė išvadą. Junginių struktūros pateiktos 2 pav.

3.3 PCA

As shown in Table 2, the eigenvalues of the first eight principal components were higher than 1(> 1), and the cumulative contribution rate of the first six principal components was 93.417%. Therefore, the first six principal components were evaluated further. Table 2 indicates their eigenvalues and factor loadings. The first principal component exhibited a higher load based on the eigenvalues of the eight peaks (>0.9). Šios smailės buvo šios: 9, 12, 14 ir 15. Todėl echinakozidas, cistanozidas B, osmantuzidas B ir akteozidas, atitinkantys iš viso 4 smailes, buvo pasirinkti kaip tipiniai estrogeninio aktyvumo kintamieji (3 pav.).

.

3.4 Estrogeninio aktyvumo nustatymas

Apskaičiuotas kiekvienos pelės drėgnos gimdos svorio ir kūno svorio santykis (4 pav.). Gyvūnai, paveikti Cistanche iš devynių buveinių, parodė reikšmingą estrogeninį aktyvumą, nes padidėjo jų gimdos svoris, palyginti su pelėmis tuščiosios kontrolinėje grupėje. 4 paveiksle taip pat parodytas MCF7 ląstelių, apdorotų Cistanche gydytų pelių serumu, proliferacijos greitis. Ląstelės, apdorotos pelių serumu, kurioms buvo suteikta Cistanche iš dešimties buveinių, augo žymiai greičiau, palyginti su ląstelėmis, kurioms nebuvo suteiktas gydymas.

3.5 Dvimatė analizė

Šiame tyrime pastebėjome, kad nesubrendusių Kunming pelių patelių gimdos svoris padidėjo ir buvo skatinamas MCF7 žmogaus krūties vėžio ląstelių dauginimasis. Šie radiniai patvirtino Cistanche estrogeninį aktyvumą. 5 paveiksle parodyti šių sudedamųjų dalių gimdos indeksai ir MCF7 ląstelių proliferacijos greitis. Santykiniams smailių plotams apskaičiuoti buvo naudojamas Pearsono koreliacijos koeficientas, kuris atitiko mėginių estrogeninį aktyvumą. Koreliacijos koeficientai, didesni nei 0,3, buvo laikomi reikšmingais (p < 0.05),="" o="" didesni="" nei="" 0,5="" koreliacijos="" koeficientai="" buvo="" laikomi="" labai="" reikšmingais="" (p="">< 0,01).="" remiantis="" rezultatais,="" buvo="" įrodyta,="" kad="" cistanche="" turi="" estrogeninį="">

Iš viso devyni junginiai reikšmingai koreliavo su gimdos svorio padidėjimu (p < {0}},05),="" tuo="" tarpu="" dešimt="" junginių="" reikšmingai="" koreliavo="" su="" mcf7="" ląstelių="" proliferacija="" (p="">< 0,05).="" junginiai,="" kurie="" reikšmingai="" koreliavo="" su="" gimdos="" svoriu="" ir="" ląstelių="" proliferacija,="" buvo="" 8-epilogano="" rūgštis,="" salidrozidas,="" siringalidas="" a3'-="" -="" l-ramnopiranozidas,="" cistanosidas="" a,="" cistanosidas="" b,="" cistanosidas="" c,="" osmantusidas="" b,="" akteozidas,="" izoakteozidas,="" tubulozidas.="" b,="" 2'-acetillakteozidas="" ir="" du="" nežinomi="" junginiai="" (5="" pav.).="" šie="" trylika="" junginių="" veikė="" estrogeninį="">

3.6 Pilkos spalvos koreliacinės analizės metodas

6 paveiksle parodyta santykinė 26 junginių būdingų smailių koreliacija su gimdos indeksais, o 7 paveiksle parodyta santykinė 26 junginių būdingų smailių koreliacija su jų ląstelių proliferacijos greičiu. Iš viso trys junginiai parodė didžiausią koreliaciją su gimdos indeksais, ty 8-epilogano rūgštis, cistanosidas F ir akteozidas (6 pav., mažėjančia tvarka); kadangi šeši junginiai, kurie parodė didžiausią koreliaciją su MCF7 ląstelių proliferacija, buvo echinakozidas, cistanosidas F, cistanosidas B, osmantusidas B, izoakteozidas ir tubulozidas B (7 pav., mažėjančia tvarka). Santykinės echinakozido, osmantusido B, akteozido ir izoakteozido koreliacijos buvo didesnės nei 0.5.

3.7 LC-MS sąlygų optimizavimas

Norint gauti geresnį chromatogramos žemėlapį, buvo lyginamas metanolis ir acetonitrilas. Galiausiai vandeninės skruzdžių rūgšties (0,2 proc., v/v) ir acetonitrilo derinys buvo geriausia juda fazė atskyrimui. 200-400nm viso bangos ilgio skenavimo diapazone 254 nm buvo pasirinktas kaip optimalus. Be to, buvo patobulinti ir MS parametrai. Neigiamų jonų nuskaitymo režimas buvo pasirinktas, nes jis pagerino daugumos Cistanche ingredientų atsako reikšmes.

4. Išvada

LC-Q-TOF-MS technologija buvo naudojama Cistanche estrogeninėms aktyviosioms sudedamosioms dalims nustatyti. Šis tyrimas parodė, kad 8-epilogano rūgštis, salidrozidas, siringalidasA3'- -l-ramnopiranozidas, cistanosidas A, echinakozidas, cistanosidas F, cistanosidas B, cistanosidas C, osmantusidas B, akteozidas, izoakteozidas, tubulozidas B, 2'-acetillakteozidas ir du nežinomi junginiai buvo pagrindinės aktyvios Cistanche sudedamosios dalys. Tačiau dėl šių išvadų reikia atlikti tolesnius tyrimus, siekiant ištirti sudedamųjų dalių poveikį in vivo ir veikimo mechanizmą.

Padėkos:

Šį projektą rėmė Kinijos nacionalinis gamtos mokslų fondas (Nr. 81073015), Heilongdziango provincijos gamtos mokslo fondas (ZD2017014) ir Heilongdziango provincijos koledžo Jaunųjų novatoriškų talentų mokymo planas (UNPYSCT{2}}) . Autoriai pareiškia, kad dėl šio straipsnio publikavimo nėra interesų konflikto.

Nuorodos

[1] Wang Z., Xia Q., Liu X., Liu W., Huang W., Mei X., Luo J., Shan M., Lin R., Zou D., Ma Z., Fitochemija, farmakologija , kokybės kontrolė ir Forsythia suspensa (Thunb.) Vahl: Apžvalga, J. Ethnopharmacol., 2018, 210, 318- 339.

[2] Shu Y., Liu Z., Zhao S., Song Z., He D., Wang M., Zeng H., Lu C., Lu A., Liu Y., Integrated and global pseudotargeted metabolomics strategija Taikyta Citrusinių TCM kokybės kontrolės žymenų atrankai, Anal. Bioanalinis. Chem., 2017, 409 (20), 4849-4865.

[3] Yang B., Wang Y., Shan L., Zou J., Wu Y., Yang F., Zhang Y., Li Y., Zhang Y., A Novel and Practical Chromatographic "Fingerprint-ROC-SVM Tradicinės kinų medicinos injekcijų kokybės analizei taikoma strategija: KuDieZi injekcijos naudojimas kaip atvejo tyrimas, Molekulės., 2017, 22

(7). PII: E1237.[4] Zhuo L., Peng J., Zhao Y., Li D., Xie X., Tong L., Yu Z., QiShenYiQi lašinamųjų tablečių bioaktyvių kokybės kontrolės žymenų atranka, pagrįsta ryšiu tarp itin didelio efektyvumo skysčių chromatografijos pirštų atspaudų. ir kraujagyslių apsauginis aktyvumas, J. Sep. Sci., 2017, 40(20), 4076-4084.

[5] Liu N., Li J., Li BG, Daugiamatės statistinės analizės ir mąstymo taikymas kinų medicinos kokybės kontrolėje, Zhongguo. Zhong. Yao. Za. Ži., 2014, 39

(21), 4268-4271.

[6] Wang DD, Liang J., Yang WZ, Hou JJ, Yang M., Da J., Wang Y., Jiang BH, Liu X., Wu WY, Guo DA, HPLC/qTOF-MS orientuotų charakteristikų komponentų duomenys rinkinys ir chemometrinė analizė kompleksinei TCM preparatų holistinei kokybės kontrolei: Niuhuang Shangqing piliulė kaip pavyzdys, J. Pharm. Biomed. Anal., 2014, 89, 130-141. [7] Hernaez R., Thrift AP, didelė neigiama nuspėjamoji vertė, mažas paplitimas ir spektro efektas: atsargumas interpretuojant, Clin. Gastroenterolis. Hepatol., 2017, 15(9), 1355-1358.

[8] Liang J., Chen Y., Ren G., Dong W., Shi M., Xiong L., Li J., Dong J., Li F., Yuan J., Screening Hepatotoxic Components in Euodia rutaecarpa by UHPLC-QTOF/MS, pagrįsta spektro ir toksiškumo ryšiu, molekulės., 2017, 22(8). PII: E1264.

[9] Li W., Sun X., Liu B., Zhang L., Fan Z., Ji Y., Evodia rutaecarpa hepatotoksinio komponento atranka ir identifikavimas remiantis spektro ir poveikio ryšiu ir UPLC-Q-TOFMS, Biomed . Chromatogr., 2016, 30(12), 1975-1983.

[10] Chopard G., Puyraveau M., Binetruy M., Meyer A., ​​Vandel P., Magnin E., Berger E., Galmiche J., Mauny F., Spektro efektas ir spektro poslinkis atrankos testo atlikime Amnestinis lengvas kognityvinis sutrikimas: kokios yra klinikinės pasekmės?, J. Alzheimers. Dis., 2015, 48(2), 385-393.

[11] Xu GL, Xie M., Yang XY, Song Y., Yan C., Yang Y., Zhang X., Liu ZZ, Tian YX, Wang Y., Jiang R., Liu WR, Wang XH, She GM, Spektro ir efekto santykiai kaip sisteminis požiūris į tradicinės kinų medicinos tyrimus: dabartinė padėtis ir ateities perspektyvos, Molecules., 2014, 19(11), 17897-17925.

[12] Zheng Q., Zhao Y., Wang J., Liu T., Zhang B., Gong M., Li J., Liu H., Han B., Zhang Y., Song X., Li Y. , Xiao X., spektro efekto ryšiai tarp UPLC pirštų atspaudų ir neapdorotų antrinių Aconitum carmichaelii Debeaux (Fuzi) šaknų ir trijų perdirbtų produktų, susijusių su mitochondrijų augimu, biologinio aktyvumo, kartu su kanonine koreliacijos analize, J. Ethnopharmacol., 2014, 153 (3) , 615-623.

[13] Shi Z., Liu Z., Liu C., Wu M., Su H., Ma X., Zang Y., Wang J., Zhao Y., Xiao X., Spektro ir poveikio ryšiai tarp cheminių pirštų atspaudų ir antibakterinis Lonicerae Japonicae Flos ir Lonicerae Flos bazės poveikis UPLC ir mikrokalorimetrijai, priekyje. Pharmacol., 2016, 7, 12.

[14] Usher-Smith JA, Sharp SJ, Griffin SJ, Spektro efektas rizikos prognozavimo, atrankos ir diagnostikos testuose, BMJ, 2016, 353, i3139.

[15] Chen Y., Yu H., Wu H., Pan Y., Wang K., Liu L., Jin Y., Zhang C., Naujų hemostatinių junginių iš šildymo produktų iš visų flavonoidų Flos Sophorae atsekimas pagal spektrą -efekto ryšiai ir kolonėlės chromatografija, J. Sep. Sci., 2015, 38(10), 1691-1699.

[16] Liu X., Wang XL, Wu L., Li H., Qin KM, Cai H., Pei K., Liu T., Cai BC, Da-Huang-Fu spektro ir efekto santykių tyrimas. Zi-Tang žiurkėms UHPLC-ESI-Q-TOF-MS metodu, J. Ethnopharmacol., 2014, 154(3), 606-612.

[17] Xie RF, Zhou X., Shi ZN, Li YM, Li ZC, Rhizoma Rhei, cortex Magnoliae Officinalis, Fructus Aurantii Immaturus ir jų formulės spektro efekto ryšio tyrimas, J. Chromatogr. Sci., 2013, 51(6), 524-532. [18] Li F., Yang X., Yang Y., Guo C., Zhang C., Yang Z., Li P., Antiosteoporozinis echinakozido aktyvumas žiurkėms, kurių kiaušialąstės pašalintos, Phytomedicine., 2013, 20(6), { {9}}.

[19] Xiong WT, Gu L., Wang C., Sun HX, Liu X., Cistanche tubulosa antihiperglikeminis ir hipolipideminis poveikis 2 tipo diabetu sergančioms DB/DB pelėms, J. Ethnopharmacol., 2013, 150(3) , 935- 945.

[20] Morikawa T., Ninomiya K., Imamura M., Akaki J., Fujikura S., Pan Y., Yuan D., Yoshikawa M., Jia X., Li Z., Muraoka O., Acilinti feniletanoidiniai glikozidai , echinakozidas ir akteozidas iš Cistanche tubulosa, pagerina pelių gliukozės toleranciją, J. Nat. Med., 2014, 68(3), 561-566.

[21] Nan ZD, Zeng KW, Shi SP, Zhao MB, Jiang Y., Tu PF, priešuždegiminiai feniletanoidiniai glikozidai iš Cistanche deserticola stiebų, auginamų Tarimo dykumoje, Fitoterapia., 2013, 89, {{4 }}.

[22] Lu D., Zhang J., Yang Z., Liu H., Li S., Wu B., Ma Z., Cistanches Herba kiekybinė analizė naudojant aukštos kokybės skysčių chromatografiją kartu su diodų matricos aptikimu ir aukšto lygio raiškos masės spektrometrija kartu su chemometriniais metodais, J. Sep. Sci., 2013, 36(12), 1945-1952.

[23] Han L., Boakye-Yiadom M., Liu E., Zhang Y., Li W., Song X., Fu F., Gao X., Cistanches deserticola YC Ma feniletanoidinių glikozidų struktūros apibūdinimas ir identifikavimas. UHPLC/ESI-QTOF-MS/MS, Phytochem. Anal., 2012, 23(6), 668-676.

[24] Xiang Y., Jing Z., Haixia W., Ruitao Y., Huaixiu W., Zenggen L., Lijuan M., Yiping W., Yanduo T., Antiproliferative Activity of Phenylpropanoids Isolated from Lagotis brevituba Maxim, Phytother . Rez., 2017, 31(10), 1509-1520.

[25] Yan Y., Song Q., Chen X., Li J., Li P., Wang Y., Liu T., Song Y., Tu P., Vienalaikis komponentų, turinčių platų poliškumą ir turinio diapazoną, nustatymas Cistanche tubulosa, naudojant nuosekliai susietą atvirkštinės fazės ir hidrofilinės sąveikos chromatografijos ir tandeminės masės spektrometriją, J. Chromatogr. A., 2017, 1501, 39-50.

[26] Zou P., Song Y., Lei W., Li J., Tu P., Jiang Y., 1H BMR pagrįstos metabolomikos taikymas siekiant atskirti skirtingas dalis ir sukurti naują Cistanche deserticola apdorojimo eigą, Acta. Pharm. Nuodėmė. B., 2017, 7 (6), 647-656.

[27] Pan YN, Šviežių Cistanche tubulosa sudedamųjų dalių ir biologinio aktyvumo tyrimai, daktaro laipsnis. disertacija, Shenyang Pharmaceutical University, Shenyang, Kinija, 2011 m.

[28] Cui Q., ​​Pan Y., Xu X., Zhang W., Wu X., Qu S., Liu X. Žmogaus ar žiurkės žarnyno bakterijų arba žarnyno fermentų gaminamo akteozido metabolinis profilis in vitro taikytas UPLC Q-TOF–MS, Fitoterapija., 2016, 109, 67-74.

[29] Cui Q., ​​Pan Y., Bai X., Zhang W., Chen L., Liu X., Cistanche tubulosa echinakozido ir akteozido metabolitų sisteminis apibūdinimas žiurkės plazmoje, tulžyje, šlapime ir išmatose. UPLC-ESI-Q-TOF-MS, Biomed. Chromatogr., 2016(9), 1406-1415.

[30] Cui Q., ​​Pan Y., Yan X., Qu B., Liu X., Xiao W., Metabolinis būdas ištirti susijusias kliūtis, sukeliančias prastą biologinį prieinamumą skiriant izoakteozidą per burną žiurkėms, naudojančioms itin efektyvią skysčių chromatografiją/ kvadrupolio skrydžio laiko tandeminė masės spektrometrija, Rapid. Komun. Masinis spektras, 2017 (4), 371-380.