Abstraktus

Pagrindiniai faktai: Inkstai yra labai sudėtingas organas, turintis daug funkcijų, kurios yra būtinos sveikatai. Inkstų liga atsiranda, kai pažeidžiami inkstai ir jie netinkamai funkcionuoja. Vienos ląstelės analizė yra galingas metodas, suteikiantis precedento neturintį vaizdą apie normalius ir nenormalius inkstų ląstelių tipus ir pakeisiantis mūsų supratimą apie įprastų inkstų ligų mechanizmus.

Santrauka: Mūsų supratimą apie inkstų ligos patogenezę riboja neišsamus ląstelių tipų, atsakingų už inkstų funkciją, molekulinis apibūdinimas. Vienaląstės technologijos taikymas inkstų tyrimuose atskleidė ląstelių heterogeniškumą, genų ekspresijos profilius ir molekulinę dinamiką inkstų ligos vystymuisi ir progresavimui. Inkstų organoidinių ir alotransplantuotų audinių vienos ląstelės analizė suteikė naujų įžvalgų apie inkstų organogenezę, ligos mechanizmus ir terapinius rezultatus. Apskritai, geresnis inkstų ląstelių heterogeniškumo ir inkstų ligos molekulinės dinamikos supratimas pagerins diagnostikos tikslumą ir padės nustatyti naujas terapines nefrologijos strategijas.

Pagrindinis pranešimas: Šiame apžvalginiame straipsnyje apibendriname naujausius vienaląsčių inkstų ligų tyrimus ir aptariame vienos ląstelės technologijos poveikį pagrindiniams ir klinikiniams inkstų tyrimams.

Raktažodžiai

Vienos ląstelės technologija; Inkstų liga; Imuninė ląstelė; Inkstų organoidas; Allografas;Cistanche nauda.

Įvadas

Inkstai yra du pupelės formos organai, atsakingi už atliekų, vandens pertekliaus ir kitų priemaišų filtravimą kraujyje bei šlapimo gamybą. Inkstai taip pat reguliuoja pH, druskos ir kalio kiekį bei kraujospūdį; kontroliuoti raudonųjų kraujo kūnelių gamybą; ir suaktyvinti vitamino D formą, kuri padeda organizmui pasisavinti kalcį. iki šiol apytiksliai 850 milijonų žmonių visame pasaulyje kenčia nuo inkstų ligų, įskaitant lėtinę inkstų ligą (LIL), ūminį inkstų pažeidimą, inkstų nepakankamumą ir daugelį kitų būklių. Inkstų liga pasireiškia tada, kai pažeidžiami inkstai ir jie negali atlikti savo funkcijų. Žalą gali sukelti diabetas, aukštas kraujospūdis ir įvairios kitos lėtinės (ilgalaikės) ligos. Inkstų liga gali sukelti kitų sveikatos problemų, įskaitant osteoporozę, nervų pažeidimus, netinkamą mitybą ir širdies ligas. Dabartinės pacientų gydymo strategijos išlieka inkstų persodinimu arba dializėmis, kurios yra brangios.

Įvairios inkstų ląstelės, įskaitant epitelio, tilakoido, endotelio ir neuronų ląsteles, taip pat imuninių ląstelių tinklus, sąveikauja, kad palaikytų normalią inkstų funkciją. Gilesnis sveikų inkstų nevienalytiškumo ir inkstų ligos procesų supratimas patobulins molekulinį ir histopatologinį fenotipinį inkstų apibrėžimą ir padės kurti naujas ligų klasifikacijas. Vienos ląstelės technologija gali būti naudinga nustatant ląstelių potipius, būsenas ir dažnio pokyčius inkstų ligos pradžioje ir progresavimo metu. Pastaraisiais metais sparčiai tobulėjant didelio našumo vienaląsčių RNR sekos nustatymo (scRNA-seq) technologijai, buvo sukurtas išsamus normalaus inksto ląstelių atlasas, skirtas inkstų tikslios medicinos tyrimams. Inkstų tikslios medicinos projektas (KPMP) buvo sukurtas visame pasaulyje, siekiant gauti žmogaus inkstų biopsijas, sukurti inkstų audinių atlasus, apibrėžti ligų subpopuliacijas ir galiausiai nustatyti pagrindines ląsteles, kelius ir naujų gydymo būdų taikinius. Remdamiesi su inkstais susijusiu vienos ląstelės transkripcijos duomenų rinkiniu, mokslininkai taip pat išanalizavo ACE2, TMPRSS2 ir SLC6A19 genų ekspresijos profilius inkstų ląstelių potipiuose, o tai labai svarbu norint suprasti sunkaus ūminio kvėpavimo sindromo koronaviruso 2 patogenezę. Šioje apžvalgoje daugiausia dėmesio skirsime (1) vienaląsčių technologijų kūrimui ir taikymui, (2) scRNA-seq naudojimui inkstų ligų vystymuisi ir progresavimui tirti, (3) imuninių ląstelių, sergančių inkstų ligomis, molekuliniam kartografavimui, ( 4) scRNA-seq taikymas į inkstus panašiems organams ir (5) scRNA-seq panaudojimas inkstų allograftų nuodugniam tyrimui (1 pav.).

Spustelėkite čia, kad gautumėteCistanche poveikis inkstams

Vienaląstės transkriptominės technologijos kūrimas ir taikymas

Viena ląstelė yra pagrindinis gyvybės vienetas. Vienos ląstelės analizės metodai pakeitė mūsų gebėjimą nustatyti ląstelių sudėtį, sekti molekulinę dinamiką ir atskleisti patologinius mechanizmus. Ankstyvoji pasaulinė vienos ląstelės genų ekspresijos analizė buvo atlikta naudojant microarray ir qPCR metodus. Tietjen ir kt. naudojo vienos ląstelės mikrogardelius, kad stebėtų atskirų neuronų ir progenitorinių ląstelių molekulinės ekspresijos profilius ir apibrėžtų signalizacijos kelius skirtinguose vystymosi etapuose. Be to, vienos ląstelės ekspresijos analizė nustatė keletą besivystančių ląstelių potipių, turinčių naujus kasos genus, suteikiančius naujų įžvalgų apie kasos vystymąsi. Ši klasė sukūrė vienos ląstelės qPCR metodus ir pritaikė juos pagrindiniams reguliavimo genams tiriant pelių blastocistų vystymąsi ir kraujodaros linijų diferenciaciją.

Atsiradus naujos kartos sekos nustatymo technologijoms, scRNA-seq parodė aiškius pranašumus atskiriant skirtingas izoformas, alelinę ekspresiją ir naujus transkriptus atskirose ląstelėse už mažesnę kainą. 2009 m. Tang ir kt. pranešė apie pirmąjį vienos ląstelės mRNR visos transkripto sekos nustatymą, parodantį vienos pelės oocitų ar oocitų transkripcijos variantų sudėtingumą. Smart-seq was 2012 buvo sukurta siekiant aptikti viso ilgio nuorašus atskirose ląstelėse, o taikydami jį retoms ląstelėms, mokslininkai nustatė kandidatus į melanomos cirkuliuojančių naviko ląstelių biomarkerius. Po metų buvo pristatytas „Smart-seq2“ su patobulinta atvirkštine transkripcija, skaitymo apimtimi, šališkumu ir tikslumu. naujausi „Smart-seq3“ pokyčiai labai pagerino jo jautrumą aptinkant tūkstančius vienos ląstelės transkriptų alelinės ir izoforminės skiriamosios gebos. Skirtingai nuo PGR pagrįstų amplifikacijos metodų, CEL-seq užfiksuoja efektyvius vienos ląstelės transkriptus daugialypiu tiesiniu amplifikavimu. Tyrimas, naudojant CEL-seq ankstyvam Cryptobacterium hidradenoma embriono vystymuisi tirti, atskleidė jo atkuriamus ir jautrius vienos ląstelės skiriamosios gebos rezultatus. Pirmoji „scRNA-seq“ automatizuota platforma yra „Fluidigm C1“, kuri naudoja mikrofluidinę sistemą atskiroms ląstelėms užfiksuoti 96 arba 384 kamerose, po to seka ląstelių lizė, atvirkštinė transkripcija ir PGR amplifikacija.

Nuo 2015 m. vienaląsčių tyrimai visiškai įžengė į didelio našumo, pigių sąnaudų ir automatizavimo erą, nes toliau buvo prieinamos Drop-seq, inDrop, 10× Genomics, Seq-well, Microwell-seq ir SPLiTseq. Drop-seq ir inDrop atskiras ląsteles atskiria į nanolitro dydžio lašelius ir sumaišykite jas su unikaliu brūkšniniu kodu, kad kiekviena ląstelė būtų pažymėta. Kita vertus, „Cyto-seq“, „Seq-well“ ir „Microwell-seq“ įgalina didelio našumo vienos ląstelės mRNR seką, užfiksuojant ląstelę ir brūkšninio kodo karoliuką mikrošulinėlyje. Mūsų grupė sukonstravo pirmąjį pelės ląstelių atlasą ir žmogaus ląstelių kraštovaizdį vienos ląstelės lygyje, naudodama Microwell-seq. Visai neseniai didesnis pralaidumas ir paprastesni metodai vadinami SPLiT-seq ir sci-RNA-seq scRNA-seq. Šie metodai naudoja pačią ląstelę arba branduolį kaip reakcijos kamerą, kad brūkšniniu kodu paženklintos ląstelės per kelis telkinio padalijimo raundus. Tada visoms ląstelėms taikomas cDNR PCR amplifikavimas ir sekvenavimas. Cao ir kt. naudojo sci-RNA-seq3, kad ištirtų maždaug 2 milijonų pelių organogeninių ląstelių ir 4 milijonų žmogaus vaisiaus ląstelių transkriptus, pateikdamas pasaulinį žinduolių vystymosi procesų vaizdą. Taip pat klestėjo kitos vienaląstės technologijos, apimančios genomines, proteomines ir epigenomines analizes; tačiau jie nepatenka į šio dokumento taikymo sritį.

Inkstų ligos atsiradimas ir progresavimas

Inkstus gali paveikti daugelis įprastų ir sunkių ligų, įskaitant ūminį inkstų pažeidimą, glomerulonefritą, kylančias infekcijas (pielonefritą) ir vėžį. Apskritai, mūsų supratimą apie inkstų ligos patogenezę riboja neišsamus ląstelių tipų, atsakingų už specifines organų funkcijas, molekulinis apibūdinimas. Norėdami užpildyti šią žinių spragą, mūsų grupė ir Park ir kt. sukūrė sveikos pelės inksto transkripcijos atlasą, naudodamas scRNA-seq. Pagrindiniai inkstų vieneto epitelio ląstelių potipiai buvo žiedkočio ląstelės, proksimalinės kanalėlių epitelio ląstelės, Henlės žiedas, distaliniai kanalėliai ir surinkimo latakų ląstelės. Tyrimas nustatė naują migruojančių ląstelių tipą, skirtą latakų ląstelių populiacijoms rinkti, patvirtindamas ankstesnius scRNA-seq tyrimuose tarp įsiterpusių ląstelių ir pagrindinių ląstelių tarpusavio konversijos rezultatus. Be to, Ransick ir kt. išanalizavo suaugusių vyrų ir moterų inkstus ir sukūrė anatominį pelių inkstų elementų atlasą vienos ląstelės lygiu. Mūsų grupė taip pat atliko žmogaus vaisiaus ir suaugusiojo inkstų audinio Microwell-seq analizę. Be epitelio ląstelių, endotelio ląstelių, stromos ląstelių ir imuninių ląstelių audiniuose, mes nustatėme anksčiau neaprašytus s tipo somatinių ląstelių tipus vaisiaus inkstuose ir naują migruojančių ląstelių tipą suaugusiųjų inkstuose. Inkstų kraujagyslių sistemos vienos ląstelės molekulinis profiliavimas atskleidė specializuotus statybinių nefronų ekspresijos profilius ir atskleidė inkstų ligos patogenezę. Be to, visų tipų glomerulų ląstelės buvo nustatytos iš sveikų pelių ir skirtingų ligų modelių, atlikus vienos ląstelės transkripto klasterizacijos analizę, o ligų modeliuose buvo aptikti nauji su liga susiję genai ir reguliavimo keliai, pvz., Hippo kelias, aktyvuotas podocituose po nefrotoksinio imuniteto. sužalojimas.

Inkstų fibrozė yra CKD požymis ir ja serga daugiau nei 10 procentų pasaulio gyventojų. Heterogeniškame inkstų fibrozės sambūvio modelyje Kramann ir kt. naudojo scRNA-seq, kad patvirtintų, kad monocitai sudaro nedidelę miofibroblastų dalį, tačiau dauguma miofibroblastų buvo gauti iš mezenchiminių ląstelių. Vėliau Kuppe ir kt. [37] išanalizavo maždaug 135, 000 ląstelių iš proksimalinių ir neproksimalinių kanalėlių transkriptą ir toliau patvirtino, kad skirtingos MSC izoformos yra pagrindinės žmogaus inkstų fibrozės priežastys. Be to, lyginamojoje sveikų ir fibrozinių inkstų monocitų analizėje nustatyta, kad miofibroblastams būdingas genas, nuogas keratinocitų homologas 2 (NKD2), buvo nustatytas kaip galimas terapinis žmogaus inkstų fibrozės taikinys. Remiantis 402 inkstų biopsijomis, buvo prognozuojama, kad šlapimo fibrinogenas yra neinvazinis biomarkeris pacientams, sergantiems LIL.

Standartizuota Cistanche

Diabetinė nefropatija (DN) būdinga tuo pačiu metu pažeisti glomerulus ir kanalėlių intersticumą. Tačiau palyginti mažai žinoma apie tai, kaip ląstelių būklė ir dažnis keičiasi prasidėjus ligai ir progresuojant genų ekspresijai. Norėdami išsiaiškinti glomerulų ląstelių genų ekspresijos pokyčius pelių DN, Fu ir kt. atliko scRNA-seq analizę ir nustatė keletą naujų galimų glomerulų ląstelių žymenų, įskaitant Magi2, Robo2, Ramp3 ir Fabp4. Diabetinės nefropatijos (DKD) atveju endotelio ląstelėse pakinta angiogeninių ir migracijos takų reguliavimas, o transliacijos ir baltymų stabilumo reguliavimo keliai yra labai praturtinti tilakoidinėse ląstelėse. Apskritai endotelio ir tilakoidinių ląstelių molekulinės dinamikos pokyčiai padės nustatyti svarbius patofiziologinius veiksnius, prisidedančius prie DN progresavimo. Chung ir kt. pavaizdavo vienos ląstelės glomerulų transkriptą pelės cukrinio diabeto modelyje. Genų ekspresija buvo pakeista ob / ob pelių tilakoiduose ir podocituose, palyginti su kontrolinėmis grupėmis. Proliferaciniai keliai buvo sukelti tilakoidinėse ląstelėse, o su ląstelių mirtimi susiję keliai buvo indukuoti podocituose, atsižvelgiant į ląstelių skaičiaus santykio pokyčius. Išsami paskelbtų DKD scRNA-seq duomenų rinkinių analizė nustatė 17 pagrindinių genų, praturtinančių mūsų supratimą apie molekulinius mechanizmus, kuriais grindžiama DKD patogenezė. Be to, nešališkas vieno branduolio RNR sekos nustatymas (snRNR-seq) iš šaldymo konservuotų žmogaus diabeto inkstų mėginių davė 23 980 transkriptų iš trijų kontrolinių ir trijų ankstyvųjų DN mėginių. Rezultatai parodė specifinius ląstelių tipui genų ekspresijos pokyčius, rodančius padidėjusį kalio sekreciją žmogaus DN. Ankstesnis tyrimas, kuriame lyginamas scRNA-seq ir snRNA-seq suaugusių pelių inkstuose, parodė, kad pastarieji turėjo efektyvesnį surinkimo pajėgumą. Pavyzdžiui, glomerulų podocitai, tilakoidinės ląstelės ir endotelio ląstelės buvo užfiksuotos snRNR-seq, o ne scRNA-seq. SnRNA-seq taikymas sumažina fermentinio virškinimo pseudo poveikį ir gali būti atliekamas su užšaldytais mėginiais, todėl tikimasi, kad tai bus platesnė, siekiant pagreitinti patologinių mechanizmų tyrimą įvairiose inkstų ligose.

Tikslus ląstelių transkriptas gali atskleisti inkstų naviko ląstelių kilmę ir transkripcijos trajektorijas, palaikančias piktybinę transformaciją. Young ir kt. apibrėžė normalius ir vėžinius žmogaus inkstų ląstelių tipus iš 72 501 vienos ląstelės transkripto katalogo. Nustačius specifines normalias inkstų vėžio ląstelių (RCC) koreliacijas, tyrimas parodė hipotezę, kad Wilmso naviko ląstelės yra nenormalios vaisiaus ląstelės ir kad RCC gali atsirasti iš mažai žinomo proksimalinių kanalėlių ląstelių potipio. Taigi, scRNA-seq suteikia keičiamo dydžio eksperimentinę strategiją, skirtą žmogaus inkstų vėžio ląstelėms apibūdinti su tikslia kiekybine ląstelių molekuline skiriamąja geba.

Inkstų ligų imuninių ląstelių molekulinis atlasas

Imuninės ląstelės yra pagrindinė žmogaus audinių sudedamoji dalis ir atlieka svarbų vaidmenį fiziologiniame ir patologiniame metabolizme. Iš tiesų, imuninės sistemos gebėjimas atpažinti patogeninius ar pavojaus signalus arba piktybines ląsteles yra labai svarbus. Vienaląstės technologijos taikymas tiriant inkstų imunines ląsteles gali padėti geriau suprasti imuninės sistemos vaidmenį sveikų inkstų ir ligų patogenezėje, taip pat nustatyti naujas gydymo strategijas. Šios pastangos pradeda brėžti sudėtingą imuninį kraštovaizdį inkstuose ir atskleidžia ryšį tarp audiniuose gyvenančių imuninių ląstelių ir jų abipusiai aktyvuotų kaimynų.

2018 m. scRNA-seq pritaikymas pelių inkstų audinyje suteikė visapusišką imuninių ląstelių kraštovaizdį, įskaitant makrofagus, neutrofilus, B ir T limfocitus ir NK ląsteles. Po metų buvo atliktas precedento neturintis vienos ląstelės žmogaus inkstų imuninių ląstelių erdvės ir laiko organizavimo tyrimas. Vaisiaus ir suaugusiųjų inkstuose buvo nustatyti audinių rezidentų mieloidinių ir limfoidinių imuninių ląstelių tinklai, o tyrimais buvo nustatytos po gimdymo įgytos transkripcijos programos, skatinančios apsaugą nuo infekcijos. Be to, buvo prognozuojama, kad subrendusių inkstų epitelio ląstelių ir imuninių ląstelių kryžminis pokalbis pritrauks antibakterinius makrofagus ir neutrofilus į jautriausius inkstų regionus. Apskritai, visapusiškas inkstų imuninis kraštovaizdis prisideda prie patogeninių mechanizmų tyrimo ir terapinių taikinių nustatymo imuninėse ir infekcinėse inkstų ligose.

Vilkligės nefritas (LN) yra potencialiai mirtina autoimuninė liga, kuriai dabartiniai gydymo būdai yra neveiksmingi ir dažnai toksiški. Molekuliniai ir ląsteliniai procesai, sukeliantys inkstų pažeidimą, ir LN heterogeniškumas lieka neaiškūs. scRNA-seq naudojo Arazi ir kt. nustatyti 21 ligai būdingą mieloidinių, T, natūralių žudikų ir B ląstelių pogrupius LN pacientams. Panašiai Der ir kt. taikė scRNA-seq inkstų ir odos biopsijos audiniams iš LN pacientų. Buvo pranešta, kad LN pacientų I tipo interferono atsako balai kanalėlių epitelio ląstelėse buvo didesni nei sveikų kontrolinių asmenų. Be to, uždegiminės ir fibrozinės kanalėlių ląstelių savybės buvo susijusios su gydymo neveiksmingumu. Sergant DKD, scRNA-seq analizė parodė žymiai didesnį imuninių ląstelių skaičių diabeto glomeruluose nei kontrolinėse grupėse. Šie tyrimai rodo, kad imuninių ląstelių genų ekspresijos profiliai šlapime, odoje ir inkstuose labai koreliuoja, o tai rodo, kad šlapimo ir odos biopsijos gali būti galimas inkstų ligos diagnostinių ir prognostinių žymenų šaltinis.

Naujausi tyrimai parodė imuninių ląstelių vaidmenį inkstų ligų modeliuose su vienos ląstelės skiriamąja geba. Vienašaliai šlapimtakio obstrukcijos modeliai yra plačiai naudojami inkstų intersticinei fibrozei, kai makrofagai ir uždegiminės ląstelės įsiskverbia į inkstų intersticį, todėl ryškūs inkstų hemodinamikos ir metabolizmo pokyčiai. scRNA-seq buvo naudojamas grįžtamuose vienašaliuose šlapimtakių obstrukcijos modeliuose, siekiant išardyti mieloidinių ląstelių kraštovaizdį fibrozės progresavimo ir regresijos metu. Conway ir kt. atskleidė mieloidinių ląstelių heterogeniškumą, dinamiškai keičiantis santykinėms subpopuliacijų proporcijoms, monocitai įdarbinami ankstyvoje traumos stadijoje, Ccr2 plius makrofagai kaupiasi vėlyvoje traumos stadijoje, o nauja Mmp12 ir makrofagų grupė vaidina svarbų vaidmenį atkūrimo procese. Inkstų ligos ir transplantacijos atveju išemijos-reperfuzijos pažeidimas (IRI) yra susijęs su uždegimu ir leukocitų prisitraukimu. eksperimentiniai IRI modeliai buvo naudojami siekiant įvertinti 2 įgimtų limfoidinių ląstelių grupių funkcinį vaidmenį inkstuose, o duomenys rodo, kad šios ląstelės turi nereikalingų inkstų pažeidimo funkcijų. Taikydami scRNA-seq inkstų transplantacijos IRI modeliui, Kremann ir kt. nustatė, kad vėlesnė CXCR5 ir leukocitų infiltracija padidino sisteminį CXCL13 lygį. knRNA-seq taip pat buvo pritaikytas IRI pelės modeliui Kirita ir kt. apibūdinti išsamius ląstelių atsakus po sužalojimo ir nustatyti atskirą priešuždegiminę ir profibrozinę proksimalinių kanalėlių ląstelių būseną. Šlapimo rūgštis, galutinis purino metabolizmo oksidacijos produktas, yra glaudžiai susijusi su inkstų uždegimu keliuose ligos modeliuose. Pavyzdžiui, NLRP3 (NOD-, LRR- ir pirino turintis struktūrinis domenas 3) jaučia šlapimo rūgšties pertekliaus signalus, o uždegiminės pūslelės suaktyvėja sergant hiperurikemine nefropatija. Tačiau specifiniai imuniniai mechanizmai, kuriais grindžiamas hiperurikemijos sukeltas inkstų pažeidimas, nėra žinomi. Tikimasi, kad artimiausiu metu bus sukurtas uždegiminis kūno kraštovaizdis vienos ląstelės lygiu hiperurikemijos sukelto inkstų pažeidimo modelyje.

Imuninė infiltracija egzistuoja inkstų navikuose ir jai įtakos turi naviko mikroaplinka. Ankstesnis tyrimas parodė, kad naviką infiltruojančios makrofagų populiacijos išreiškia kraujagyslių endotelio augimo faktorių A ir dalyvauja sudėtingame VEGF signalizacijos kelyje RCC audinyje. Šis tyrimas rodo, kad scRNA-seq gali spręsti navikogenezę ir nustatyti galimus patofiziologinius mechanizmus ir ląstelių signalizacijos tinklus, kurie gali būti naudojami kaip vaistų terapijos tikslai. Apskritai tyrime pabrėžiama scRNAseq pažanga, kuri suteikia įžvalgų apie imuninę sistemą ir ląstelių tinklus, veikiančius sveikuose ir sergančiuose inkstuose.

Žolelių Cistanche

ScRNA-seq taikymas inkstų organoidams

Be sergančių inkstų audinių tyrimo, inkstų organoidai tapo pagrindine organogenezės ir ligos mechanizmų tyrimo priemone ir gali paspartinti gydymo būdų, kaip alternatyvių audinių šaltinio, kūrimą. Tuo pačiu metu scRNA-seq pažanga leido atlikti išsamesnę įvairių ląstelių subpopuliacijų ir genų ekspresijos pokyčių į inkstus panašiuose organuose analizę.

Apskritai reikia geriau suprasti inkstų embriono vystymąsi vienos ląstelės lygiu, kad būtų galima vadovautis į inkstus panašių organų brendimu. Žmogaus vaisiaus inksto vienos ląstelės transkriptomikos tyrimai nustatė 22 ląstelių tipus ir atitinkamus žymenų genus.

Skirtingų vystymosi stadijų palyginimas rodo pėdų ląstelių molekulinės dinamikos tęstinumą. Dar viena vienos ląstelės analizė buvo atlikta su žmogaus vaisiaus inkstu ir embriono kamieninėmis ląstelėmis išvestais į inkstus panašiais organais. Lyginamoji vienos ląstelės vystymosi trajektorijų inkstuose analizė atskleidė panašius genų ekspresijos profilius in vivo ir in vitro, išskyrus vėlyvosios stadijos podocitus, o tai rodo neišsamų podocitų tipo organų brendimo procesą. Transplantacijos eksperimentai taip pat rodo, kad tilakoidą ir kraujagyslių spindį galima optimizuoti naudojant organoidinius modelius. Neseniai atliktas tyrimas, naudojant užpakalines inkstų mezenchimines ir į šlapimtakio pumpurus panašias ląsteles inkstų organoidams generuoti, parodė, kad scRNA-seq pagerino proksimalinių kanalėlių brendimą ir sumažino tikslinių ląstelių populiacijas. Iš žmogaus pluripotentinių kamieninių ląstelių (PSC) gautų inkstų organoidų scRNA-seq analizę atliko Subramanian ir kt. ir Wu ir kt. Palyginti su žmogaus vaisiaus ir suaugusiųjų inkstų vienaląsčių duomenų rinkiniais, skirtingi į inkstus panašūs organai parodė iš esmės atkuriamus ląstelių tipus, tačiau su skirtingomis ląstelių proporcijomis dėl netikslinių ląstelių. Be to, transkripcijos faktoriaus tinklo analizė atskleidė inkstų organoidų diferenciacijos kelius, pabrėždama vienos ląstelės technologijos galią apibūdinant ir vadovaujant organoidų diferenciacijai.

Apibendrinant galima pasakyti, kad į žmogaus inkstus panašūs organai yra naudingas šaltinis kuriant ligų modelius, galimus reguliavimo mechanizmus, didelio našumo vaistų patikrą ir galiausiai regeneracinę terapiją. Šiuose tyrimuose pabrėžiamas galimas scRNA-seq naudojimas inkstų modelių sistemose, siekiant išaiškinti in vivo fiziologinius ir patologinius procesus ir pateikti rekomendacijas būsimiems inkstų ligų diagnozavimo ir gydymo tyrimams.

Įžvalga apie inkstų transplantatus pagal scRNA-seq

Alogeninė inksto transplantacija yra vienas veiksmingiausių klinikinių paskutinės stadijos inkstų ligos gydymo būdų. Vienos ląstelės technologija suteikia galimybę tiksliai ir tiksliai apibūdinti inkstų ląstelių tipus ir būklę, naudojant žmogaus biopsijos mėginius po alogeninės transplantacijos. Pirmojoje paskelbtoje ataskaitoje apie inkstų transplantacijos biopsijos mėginius buvo išanalizuoti 8746 vienos ląstelės transkriptai ir apibrėžti skirtingi uždegiminiai atsakai. Monocitai sudarė neklasikinę CD16 plius grupę ir klasikinę CD16- grupę; endotelio ląstelės turėjo ramybės būseną ir 2 antikūnų sukeltą atmetimo būsenas. Šios išvados padeda geriau suprasti imuninį atmetimą persodinant inkstus. Atliekant lyginamąjį inkstų monocitų iš recipiento ir donoro šaltinių tyrimą, inkstų biopsijos mėginiai parodė žymiai skirtingą transkripcijos genų ekspresiją. Recipientuose buvo pastebėti uždegimo suaktyvinti makrofagai ir citotoksiškai ekspresuotos T ląstelės. Panašiai Liu ir kt. išanalizavo ląsteles iš lėtinio inkstų persodinimo atmetimo ir suderino sveikus suaugusiųjų inkstus vienos ląstelės lygmeniu. Neprižiūrėta klasterizacijos analizė parodė, kad padidėjęs imuninių ląstelių ir miofibroblastų skaičius lėtinio inkstų persodinimo atmetimo grupėje gali prisidėti prie inkstų atmetimo ir fibrozės. Pažymėtina, kad neseniai atliktas tyrimas pavaizdavo pirmąjį suaugusiųjų šlapimo vienos ląstelės atlasą ir nustatė SOX9 ir inkstų kamieninių / pirmtakų ląstelių populiacijas šlapime. Progenitorinės ląstelės sėkmingai proliferavo ir diferencijavosi in vivo, įgydamos kai kurias kanalėlių ląstelių savybes ir suteikdamos potencialiai naudingą šaltinį būsimai inkstų transplantacijos terapijai. Apskritai scRNA-seq technologija suteikia naujų ir įžvalgių įžvalgų apie žmogaus inksto transplantacijos atmetimą, galiausiai pagerindama diagnostikos tikslumą ir paspartindama molekulinės biopsijos interpretacijos pritaikymą.

Cistanche papildai

Išvada

Per pastarąjį dešimtmetį scRNA-seq tapo nepakeičiama transkripto diferencinės genų ekspresijos analizės priemone, siekiant ištirti fiziologinę biologiją ir nustatyti ligos molekulinius reguliavimo sutrikimus. Priešingai nei tradiciniai atskiri fenotipai, molekulinis apibūdinimas vienos ląstelės lygiu gali būti sistemingas inkstų ligų fenotipų apibūdinimo standartas. Vienaląstės technologijos taikymas sveikiems inkstų audiniams arba klinikiniams inkstų biopsijos mėginiams suteikia išsamų molekulinį inkstų atlasą ir praplečia mūsų supratimą apie nefrologiją. Inkstų pavienių ląstelių atlasas bus neatsiejama tarptautinio žmogaus ląstelių atlaso, kurio tikslas yra sukurti išsamų ir sistemingą žmogaus kūno atskaitos žemėlapį, dalis. Tikimasi, kad būsimuose tyrimuose vienos ląstelės itin didelio našumo ir erdvinės transkripto analizės praplės mūsų supratimą apie inkstus. Daugiafunkcinių duomenų integravimas dar labiau pagerins individualizuotą inkstų ligų diagnostiką ir gydymą.

NUORODOS

1. Kriz W, Bankir L. Standartinė inkstų struktūrų nomenklatūra. Tarptautinės fiziologijos mokslų sąjungos (IUPS) inkstų komisija. Kidney Int. 1988 sausis; 33(1):1–7.

2. Kurts C, Panzer U, Anders HJ, Rees AJ. Imuninė sistema ir inkstų liga: pagrindinės sąvokos ir klinikinės pasekmės. Nat Rev Immunol. 2013 m. spalis;13(10):738–53.

3. Luyckx VA, Al-Aly Z, Bello AK, Bellorin Font E, Carlini RG, Fabian J ir kt. Tvaraus vystymosi tikslai yra svarbūs inkstų sveikatai: pažangos atnaujinimas. Nat Rev Nephrol. 2021 m. sausis;17(1):15–32.

4. Clark AR, Greka A. Vieno galia: pažanga vienaląsčių genomikos inkstuose. Nat Rev Nephrol. 2020 m. vasario mėn.;16(2):73–4.

5. Han X, Wang R, Zhou Y, Fei L, Sun H, Lai S ir kt. Pelės ląstelių atlaso kartografavimas mikrošulinėlių seka. Ląstelė. 2018 m. vasario mėn.;172(5):1091–107.e17.

6. Park J, Shrestha R, Qiu C, Kondo A, Huang S, Werth M ir kt. Pelės inkstų vienos ląstelės transkriptomika atskleidžia galimus inkstų ligos ląstelių taikinius. Mokslas. 2018 gegužė; 360(6390):758–63.

7. Hochane M, van den Berg PR, Fan X, Bérenger-Currias N, Adegeest E, Bialecka M ir kt. Vienos ląstelės transkriptomika atskleidžia žmogaus vaisiaus inkstų vystymosi genų ekspresijos dinamiką. PLoS Biol. 2019 m. vasario 17 d. (2): e3000152.

8. Han X, Zhou Z, Fei L, Sun H, Wang R, Chen Y ir kt. Žmogaus ląstelės kraštovaizdžio kūrimas vienos ląstelės lygmeniu. Gamta. 2020 m. gegužės mėn.; 581(7808):303–9.

9. Liao J, Yu Z, Chen Y, Bao M, Zou C, Zhang H ir kt. Žmogaus inksto vienos ląstelės RNR sekos nustatymas. Sci duomenys. 2020 m. sausis;7(1):4.

10. Tikslioji medicina nefrologijoje. Nat Rev Nephrol. 2020 m. lapkritis;16(11):615.

11. Chen QL, Li JQ, Xiang ZD, Lang Y, Guo GJ, Liu ZH. Su ląstelių receptoriais susijusių SARS-CoV-2 genų lokalizavimas inkstuose atliekant vienos ląstelės transkripto analizę. Inkstų Dis. 2020 liepa;6(4):258–70.

12. Tietjen I, Rihel JM, Cao Y, Koentges G, Zakhary L, Dulac C. Single-cell transcriptional analysis of neuronal progenitors. Neuronas. 2003 balandis;38(2):161–75.

13. Chiang MK, Melton DA. Kasos vystymosi vienos ląstelės transkripto analizė. Dev Cell. 2003 kovas;4(3):383–93.

14. Guo G, Huss M, Tong GQ, Wang C, Li Sun L, Clarke ND ir kt. Ląstelių likimo sprendimų, atskleistų vienos ląstelės genų ekspresijos analize nuo zigotos iki blastocistos, sprendimas. Dev Cell. 2010 balandis;18(4):675–85.

15. Guo G, Luc S, Marco E, Lin TW, Peng C, Kerenyi MA ir kt. Ląstelių hierarchijos atvaizdavimas atliekant vienos ląstelės paviršiaus repertuaro analizę. Ląstelių kamieninė ląstelė. 2013 m. spalis;13(4):492–505.

16. Wang Z, Gerstein M, Snyder M. RNA-Seq: revoliucinis transkriptomikos įrankis. Nat Rev Genet. 2009 sausis;10(1):57–63.

17. Tang F, Barbacioru C, Wang Y, Nordman E, Lee C, Xu N ir kt. mRNR-Seq visos vienos ląstelės transkripto analizė. Nat metodai. 2009 m. gegužės mėn.;6(5):377–82.

18. Ramsköld D, Luo S, Wang YC, Li R, Deng Q, Faridani OR ir kt. Viso ilgio mRNR seka iš vienos ląstelės RNR lygių ir atskirų cirkuliuojančių naviko ląstelių. Nat Biotechnol. 2012 rugpjūtis;30(8):777–82.

19. Picelli S, Björklund ÅK, Faridani OR, Sagasser S, Winberg G, Sandberg R. Smart-seq2 jautriam viso ilgio transkripto profiliavimui atskirose ląstelėse. Nat metodai. 2013 lapkritis;10(11): 1096–8.

20. Hagemann-Jensen M, Ziegenhain C, Chen P, Ramsköld D, Hendriks GJ, Larsson AJM ir kt. Vienos ląstelės RNR skaičiavimas alelio ir izoformos skyra naudojant Smart-seq3. Nat Biotechnol. 2020 m. birželis;38(6):708–14.

21. Hashimshony T, Wagner F, Sher N, Yanai I. CEL-seq:single-cell RNA-seq multiplexed linear amplification. Cell Rep. 2012 Rugs;2(3): 666–73.

22. Yanai I, Hashimshony T. CEL-seq2-vienaląstės RNR sekos nustatymas multipleksiniu tiesiniu amplifikavimu. Metodai Mol Biol. 2019;1979: 45–56.

23. AM, Zhang X, Cao C, Pang Y, Wu X, Xiong L ir kt. Mikrofluidinis vienos ląstelės visos transkripto sekos nustatymas. Proc Natl Acad Sci US A. 2014 m. gegužės mėn.; 111(19):7048–53.

24. Klein AM, Mazutis L, Akartuna I, Tallapragada N, Veres A, Li V ir kt. Lašelių brūkšninis kodavimas, skirtas vienos ląstelės transkriptomikai, taikomas embrioninėms kamieninėms ląstelėms. Ląstelė. 2015 m. gegužės mėn.;161(5): 1187–201.

25. Macosko EZ, Basu A, Satija R, Nemesh J, Shekhar K, Goldman M ir kt. Labai lygiagretus atskirų ląstelių genomo masto ekspresijos profiliavimas naudojant nanolitrų lašelius. Ląstelė. 2015 m. gegužės mėn.;161(5):1202–14.

26. Ventiliatorius HC, Fu GK, Fodor SP. Išraiškos profiliavimas. Kombinatorinis atskirų ląstelių žymėjimas genų ekspresijos citometrijai. Mokslas. 2015 m. vasario mėn.; 347(6222):1258367.

27. Gierahn TM, Wadsworth MH, Hughes TK, Bryson BD, Butler A, Satija R ir kt. Seq-well: nešiojamas, nebrangus pavienių ląstelių RNR sekos nustatymas dideliu pralaidumu. Nat metodai. 2017 balandis;14(4):395–8.

28. Cao J, Packer JS, Ramani V, Cusanovich DA, Huynh C, Daza R ir kt. Išsamus daugialąsčio organizmo vienos ląstelės transkripcijos profiliavimas. Mokslas. 2017 rugpjūčio mėn.;357(6352): 661–7.

29. Rosenberg AB, Roco CM, Muscat RA, Kuchina A, Sample P, Yao Z ir kt. Besivystančios pelės smegenų ir nugaros smegenų vienos ląstelės profiliavimas su padalinto baseino brūkšniniu kodu. Mokslas. 2018 m. balandis; 360 (6385): 176–82.

30. Cao J, Spielmann M, Qiu X, Huang X, Ibrahim DM, Hill AJ ir kt. Žinduolių organogenezės vienos ląstelės transkripcijos kraštovaizdis. Gamta. 2019 m. vasario mėn.;566(7745):496–502.

31. Cao J, O'Day DR, Pliner HA, Kingsley PD, Deng M, Daza RM ir kt. Žmogaus ląstelių vaisiaus genų ekspresijos atlasas. Mokslas. 2020 m.; 370(6518):370.

32. Chen L, Lee JW, Chou CL, Nair AV, Battistone MA, Păunescu TG ir kt. Pagrindinių inkstų surinkimo latakų ląstelių tipų transkriptai pelėse, identifikuoti pagal vienos ląstelės RNR sek. Proc Natl Acad Sci US A. 2017 Nov;114(46): E9989–98.

33. Ransick A, Lindström NO, Liu J, Zhu Q, Guo JJ, Alvarado GF ir kt. Vienos ląstelės profiliavimas atskleidžia lytį, kilmę ir regioninę įvairovę pelės inkstuose. Dev Cell. 2019 lapkritis;51(3):399– 413.e7.

34. Barry DM, McMillan EA, Kunar B, Lis R, Zhang T, Lu T ir kt. Nefrono kraujagyslių specializacijos inkstuose molekuliniai veiksniai. Nat Commun. 2019 m. gruodis;10(1):5705.

35. Chung JJ, Goldstein L, Chen YJ, Lee J, Webster JD, Roose-Girma M ir kt. Inksto glomerulų vienos ląstelės transkripto profiliavimas nustato pagrindinius ląstelių tipus ir reakcijas į sužalojimą. J Am Soc Nephrol. 2020 m. spalis; 31 (10): 2341–54.

36. Kramann R, Machado F, Wu H, Kusaba T, Hoeft K, Schneider RK ir kt. Parabiozė ir vienos ląstelės RNR sekos nustatymas atskleidžia ribotą monocitų indėlį į miofibroblastus inkstų fibrozėje. JCI įžvalga. 2018 m. gegužės mėn.;3(9): e99561.

37. Kuppe C, Ibrahim MM, Kranz J, Zhang X, Ziegler S, Perales-Patón J ir kt. Žmogaus inkstų fibrozės miofibroblastų kilmės dekodavimas. Gamta. 2021 m. sausis;589(7841):281–6.

38. Wang H, Zheng C, Lu Y, Jiang Q, Yin R, Zhu P ir kt. Šlapimo fibrinogenas kaip CKD progresavimo prognozė. Clin J Am Soc Nephrol. 2017 m. gruodis;12(12):1922–9.

39. Fu J, Akat KM, Sun Z, Zhang W, Schlondorff D, Liu Z ir kt. Glomerulų ląstelių vienos ląstelės RNR profiliavimas rodo dinamiškus eksperimentinės diabetinės inkstų ligos pokyčius. J Am Soc Nephrol. 2019 m. balandis;30(4):533–45.

40. Zhang Y, Li W, Zhou Y. Hub genų identifikavimas sergant diabetine inkstų liga, naudojant daugybinę mikrogardelių analizę. Ann Transl Med. 2020 m. rugpjūčio mėn.;8(16):997.

41. Wilson PC, Wu H, Kirita Y, Uchimura K, Ledru N, Rennke HG ir kt. Ankstyvosios žmogaus diabetinės nefropatijos vienos ląstelės transkriptominis kraštovaizdis. Proc Natl Acad Sci US A. 2019 Sep;116(39):19619–25.

42. Wu H, Kirita Y, Donnelly EL, Humphreys BD. Vieno branduolio pranašumai, palyginti su suaugusiųjų inksto vienos ląstelės RNR sekos nustatymu: reti ląstelių tipai ir naujos ląstelių būsenos, atskleistos fibroze. J Am Soc Nephrol. 2019 m. sausis;30(1):23–32.

43. Young MD, Mitchell TJ, Vieira Braga FA, Tran MGB, Stewart BJ, Ferdinand JR ir kt. Vienos ląstelės transkriptai iš žmogaus inkstų atskleidžia inkstų navikų ląstelių tapatumą. Mokslas. 2018 m. rugpjūčio mėn.;361(6402):594–9.

44. Stewart BJ, Ferdinand JR, Young MD, Mitchell TJ, Loudon KW, Riding AM ir kt. Žmogaus inksto erdvėlaikinė imuninė zona. Mokslas. 2019 m. rugsėjis;365(6460):1461–6.

45. Arazi A, Rao DA, Berthier CC, Davidson A, Liu Y, Hoover PJ ir kt. Imuninių ląstelių kraštovaizdis pacientų, sergančių vilklige nefritu, inkstuose. Nat Immunol. 2019 liepa;20(7):902–14.

46. ​​Der E, Ranabothu S, Suryawanshi H, Akat KM, Clancy R, Morozov P ir kt. Vienos ląstelės RNR sekos nustatymas vilkligės nefrito molekuliniam heterogeniškumui išskaidyti. JCI įžvalga. 2017 m. gegužės mėn.;2(9):e93009.

47. Der E, Suryawanshi H, Morozov P, Kustagi M, Goilav B, Ranabothu S ir kt. Vamzdinių ląstelių ir keratinocitų vienos ląstelės transkriptomika, taikoma vilkligės nefritui, atskleidžia I tipo IFN ir su fibroze susijusius kelius. Nat Immunol. 2019 liepa;20(7):915–27.

48. Conway BR, O'Sullivan ED, Cairns C, O'Sullivan J, Simpson DJ, Salzano A ir kt. Inkstų vienaląsčių atlasas atskleidžia mieloidinį nevienalytiškumą inkstų ligos progresavime ir regresijoje. J Am Soc Nephrol. 2020 m. gruodis; 31(12):2833–54.

49. Cameron GJM, Cautivo KM, Loering S, Jiang SH, Deshpande AV, Foster PS ir kt. 2 grupės įgimtos limfoidinės ląstelės yra nereikalingos eksperimentiniam inkstų išemijos ir reperfuzijos pažeidimui. Priekinis imunolis. 2019;10:826.

50. Kreimann K, Jang MS, Rong S, Greite R, von Vietinghoff S, Schmitt R ir kt. Išemijos-reperfuzijos pažeidimas sukelia CXCL13 išsiskyrimą ir B ląstelių įdarbinimą po alogeninės inksto transplantacijos. Priekinis imunolis. 2020; 11:1204.

51. Kirita Y, Wu H, Uchimura K, Wilson PC, Humphreys BD. Pelės ūminio inkstų pažeidimo ląstelių profiliavimas atskleidžia konservuotą ląstelių atsaką į sužalojimą. Proc Natl Acad Sci US A. 2020 liepa;117(27):15874–83.

52. Wen L, Yang H, Ma L, Fu P. The roles of NLRP3 inflammasome-mediated signaling pathways in hyperuricemic nephropathy. Mol Cell Biochem. 2021 m. kovas; 476 (3): 1377–86.

53. Nishinakamura R. Žmogaus inkstų organoidai: pažanga ir likę iššūkiai. Nat Rev Nephrol. 2019 m. spalio mėn.;15(10):613–24.

54. Tran T, Lindström NO, Ransick A, De Sena Brandine G, Guo Q, Kim AD ir kt. Žmogaus podocitų vystymosi trajektorijos in vivo informuoja apie pluripotentinių kamieninių ląstelių kilmės podocitų in vitro diferenciaciją. Dev Cell. 2019 m. liepa;50(1):102–e6.

55. Uchimura K, Wu H, Yoshimura Y, Humphreys BD. Žmogaus pluripotentinės kamieninių ląstelių kilmės inkstų organoidai su patobulintu surinkimo kanalo brendimu ir traumų modeliavimu. Cell Rep. 2020 Dec;33(11):108514.

56. Subramanian A, Sidhom EH, Emani M, Vernon K, Sahakian N, Zhou Y ir kt. Žmogaus inkstų organoidų vienos ląstelės surašymas rodo atkuriamumą ir sumažino netikslinių ląstelių skaičių po transplantacijos. Nat Commun. 2019 m. lapkritis;10(1):5462.

57. Wu H, Uchimura K, Donnelly EL, Kirita Y, Morris SA, Humphreys BD. Žmogaus PSC gauto inkstų organoidų diferenciacijos lyginamoji analizė ir tobulinimas naudojant vienos ląstelės transkriptomiką. Ląstelių kamieninė ląstelė. 2018 m. gruodis;23(6):869–e8.

58. Czerniecki SM, Cruz NM, Harder JL, Menon R, Annis J, Otto EA ir kt. Didelio našumo atranka pagerina inkstų organoidų diferenciaciją nuo žmogaus pluripotentinių kamieninių ląstelių ir įgalina automatinį daugiamatį fenotipų nustatymą. Ląstelių kamieninė ląstelė. 2018 m. birželis;22(6): 929–e4.

59. Dvela-Levitt M, Kost-Alimova M, Emani M, Kohnert E, Thompson R, Sidhom EH ir kt. Maža molekulė nukreipta į TMED9 ir skatina lizosomų skaidymą, kad būtų pakeista proteinopatija. Ląstelė. 2019 m. liepa;178(3):521–e23.

60. Wu H, Malone AF, Donnelly EL, Kirita Y, Uchimura K, Ramakrishnan SM ir kt. Žmogaus inksto transplantato biopsijos mėginio vienos ląstelės transkriptomika apibrėžia įvairų uždegiminį atsaką. J Am Soc Nephrol. 2018 rugpjūtis;29(8):2069–80.

61. Malone AF, Wu H, Fronick C, Fulton R, Gaut JP, Humphreys BD. Išreikštos vieno nukleotido variacijos ir vienos ląstelės RNR sekos panaudojimas, siekiant apibrėžti imuninių ląstelių chimerizmą atmetančio inksto transplantacijos metu. J Am Soc Nephrol. 2020 m. rugsėjis;31(9):1977–86.

62. Liu Y, Hu J, Liu D, Zhou S, Liao J, Liao G ir kt. Vienos ląstelės analizė atskleidžia imuninį kraštovaizdį pacientų, sergančių lėtiniu transplantato atmetimu, inkstuose. Teranostika. 2020 m.; 10(19):8851–62.

63. Wang Y, Zhao Y, Zhao Z, Li D, Nie H, Sun Y ir kt. Vienos ląstelės RNR-Seq analizė nustatė inkstų progenitorines ląsteles iš žmogaus šlapimo. Baltymų ląstelė. 2021 m. balandis;12(4):305–12.

64. Stark R, Grzelak M, Hadfield J. RNR sekos nustatymas: paauglystės metai. Nat Rev Genet. 2019 m. lapkritis;20(11):631–56. 65 Regev A, Teichmann SA, Lander ES, Amit I, Benoist C, Birney E ir kt. Žmogaus ląstelių atlasas. Elife. 2017;12:6.

Mengmeng Jiang^a,b; Haide Chen^{b, c}; Guoji Guo^{a, b, c, d, e}

a: Liangzhu laboratorija, Džedziango universiteto medicinos centras, Hangdžou, Kinija;

b: Kamieninių ląstelių ir regeneracinės medicinos centras, Džedziango universiteto medicinos mokykla, Hangdžou, Kinija;

c: Zhejiang provincijos pagrindinė audinių inžinerijos ir regeneracinės medicinos laboratorija, Dr. Li Dak Sum & Yip Yio Chin, Kamieninių ląstelių ir regeneracinės medicinos centras, Hangdžou, Kinija;

d: Kaulų čiulpų transplantacijos centras, pirmoji susijusi ligoninė, Džedziango universiteto medicinos mokykla, Hangdžou, Kinija;

e: Hematologijos institutas, Džedziango universitetas, Hangdžou, Kinija