Stx2 sukelia diferencinę genų ekspresiją ir sutrikdo cirkadinio ritmo genus proksimaliniame kanalėlyje

Santrauka: Šiga toksinus gaminanti Escherichia coli(STEC) sukelia proksimalinius inkstų kanalėlių defektus. Tačiau veiksniai, kuriuos proksimaliniuose kanalėliuose pakeitė Shiga toksinas (Stx), dar turi būti parodyti. Mes nustatėme Stx receptorių Gb3 pelių ir žmogaus inkstuose ir patvirtinome receptorių ekspresiją proksimaliniuose kanalėliuose. Stx2-suleisti pelės inkstų audinių irStx{0}}gydytos žmogaus pirminės inkstų proksimalinės kanalėlių epitelio ląstelės(RPTEC) buvo surinkti ir atlikta mikrogardelių analizė. Palyginome pelių inkstų ir RPTEC matricas ir atrinkome bendrus 58 genus, kurie yra skirtingai išreikšti, palyginti su kontroliniu (0 val., neapdoroti toksinu). Mes nustatėme, kad labiausiai išreikštas genas buvo GDF15, kuris gali būti susijęs su Stx2-sukeltame svorio kritimu. Genai, susiję su anksčiau pranešta Stx2 veikla, pvz., src kinazės Yes fosforilinimo kelio aktyvavimo išsiskleidusio baltymo atsako (UPR) ir ribotoksinio streso atsako (RSR), išraiškos skiriasi. Be to, cirkadinio laikrodžio genai buvo išreikšti skirtingai, o tai rodo, kad Stx2-sukeltas inkstų cirkadinio ritmo sutrikimas. Cirkadinio ritmo reguliuojamas proksimalinis kanalėlių Na+ - gliukozės transporteris SGLT1 (SLC5A1) buvo sumažintas, o tai rodo proksimalinio kanalėlių funkcijos pablogėjimą, o pelėms išsivystė gliukozurija, patvirtinanti proksimalinę kanalėlių disfunkciją. Stx2 keičia genų ekspresiją pelių ir žmogaus proksimaliniuose kanalėliuose dėl žinomos veiklos ir naujai ištirto cirkadinio ritmo sutrikimo, dėl kurio gali atsirasti proksimalinių kanalėlių disfunkcijos.

Raktiniai žodžiai:2 tipo Shiga toksinas (Stx2);proksimalinis inkstų kanalėlis; pelė; žmogaus inkstų proksimalinė kanalėlių epitelio ląstelė (RPTEC); mikromasyvas; cirkadinis ritmas

Pagrindinis indėlis:Buvo analizuojami skirtingai išreikšti genai iš Stx{0}}gydytų pelių inkstų ir žmogaus pirminių proksimalinių kanalėlių ląstelių. Be anksčiau žinomų Stx2-paveiktų genų, buvo įrodyta, kad su cirkadiniu ritmu susiję genai keičia savo ekspresiją ir turėjo įtakos proksimalinei kanalėlių funkcijai.

1. Įvadas

Šiga toksinus gaminanti Escherichia coli(STEC) infekcija sukelia sunkius hemolizinio ureminio sindromo (HUS) simptomus, kuriuos apibūdina ūminio inkstų nepakankamumo, trombocitopenijos ir hemolizinės anemijos triada [1]. Manoma, kad šiga toksinai (Stxs) vaidina svarbų vaidmenį pažeidžiant šios infekcinės ligos ląsteles. Būdinga HUS inkstų histopatologija apima glomerulų ir kanalėlių pažeidimus, tokius kaip kapiliarų fibrino nusėdimas glomeruluose ir kanalėlių nekrozė [1, 2]. Analizuojant šlapimą, buvo pranešta apie ankstesnius STEC infekuotų pacientų proksimalinių kanalėlių disfunkciją. Proksimaliniai vamzdiniai funkciniai šlapimo žymenysN-acetilgliukozaminidazė(NAG) ir 2 mikroglobulino (2MG) iš ūminės stadijos šlapimo su STEC O157- arba O111- susijusių HUS pacientų buvo labai padidėjęs, o tai rodo ankstyvą proksimalinę kanalėlių disfunkciją [3].

Stxs, įskaitant Stx2, susideda iš vieno A subvieneto ir penkių B subvienetų (A1B5 toksino), kuriuose A subvienetas pasižymi fermentiniu aktyvumu, pašalindamas adeniną 4324 iš 60S ribosomų subvieneto 28S rRNR, o B subvienetai reikalingi, kad surištų šeimininko ląsteles-šeimininką per globotrija. (Gb3). Yra keletas žinomų poveikių, kuriuos Stxs daro ląstelėms. (I) Prisijungdamas prie savo receptoriaus Gb3, toksinas sukelia signalo perdavimą per Src šeimos kinazę Taip [4,5]. Prisijungę prie receptoriaus, Stxs internalizuojasi į ląstelę endocitozės būdu ir retrogradiškai pernešamos į ER. Stxs praeina per endosomą ir Golgi aparatą, kur furinas suskaido A subvienetą tarp katalizinių A1 ir C-galinių A2 fragmentų [6], nors A1 ir A2 fragmentai vis dar yra sujungti disulfidine jungtimi. Toksinas pasiekia ER ir disulfidinė jungtis gali būti sumažinta; tada iš holotoksino išsiskiria A1 fragmentas [7,8]. Tai yra tada, kai (II) ER streso įtaka atsitinka su išsiskleidusiais baltymus imituojančiais toksino fragmentais, kurie sukelia nesulenktą baltymo atsaką (UPR). Tiek A, tiek B subvienetai gali surišti Bip, o tai rodo ER streso sukėlimą [9, 10]. Suskaldytas A1 fragmentas perkeliamas į citoplazmą ir pašalina adeniną iš 28S rRNR į (III) slopina baltymų sintezę. Modifikacija, kurią sukelia Stxs į 28S rRNR, sukelia (IV) ribotoksinį streso atsaką (RSR), kuris suaktyvina signalizacijos kaskadą pasroviui [11]. Yra žinoma, kad įtaka (II) ir (arba) (IV) sukelia (V) tam tikrą genų transkripciją, dėl kurios atsiranda citokinų sekrecija [12]. Be to, (II) ir (IV) yra susiję su (VI) Stxs sukelta apoptoze [13–15].

In vitro eksperimentai, naudojant žmogaus proksimalinius kanalėlius ir in vivo pelių modelius, stipriai susieja proksimalinius kanalėlių pažeidimus su Stxs. Tiek pirminės kultūros, tiek žmogaus proksimalinių kanalėlių ląstelių linijos yra labai jautrios Stxs ir pasižymi citokinų išsiskyrimu bei ląstelių mirtimi, įskaitant apoptozę [16–20]. Žmogaus pirminės proksimalinės inkstų kanalėlių epitelio ląstelės (RPTEC) ekspresuoja receptorių Gb3, yra labai jautrios Shiga toksinams ir buvo naudojamos daugelyje straipsnių analizuojant biologines reakcijas, tokias kaip baltymų sintezės slopinimas, citokinų gamyba ir apoptozės indukcija [17,20] . 1 tipo Shiga toksino (Stx1) sušvirkštoms pelėms pasireiškė gliukozurija, o tai rodo sumažėjusią gliukozės reabsorbciją proksimaliniuose kanalėliuose [21]. Tai rodo Stxs toksiškumą proksimaliniams kanalėliams tiek in vitro, tiek in vivo. STEC užkrėstų pelių modeliuose dažni histopatologijos radiniai yra kanalėlių epitelio ląstelių nekrozė ir nuslinkusios ląstelės proksimalinių kanalėlių spindyje [22–24]. Išgrynintos Stx (Stx1 arba Stx2) sušvirkštoms pelėms taip pat pastebimas proksimalinių kanalėlių išslinkimas su santykinai nepažeistais branduoliais [25–27].

Nors proksimalinių kanalėlių pažeidimai, susiję su Stx injekcija arba STEC infekcija, buvo aprašyti funkciniu ir histologiniu požiūriu, genų taikiniai, susiję su proksimalinių kanalėlių pažeidimu, dar turi būti parodyti.

Čia mes išanalizavome genų ekspresiją Stx{0}}suleistiems pelės inkstuose ir Stx2-gydytoje žmogaus pirminėje inkstų proksimalinių kanalėlių epitelio ląstelių (RPTEC) kultūroje, kad parodytume Stx2 sukeltus su proksimaliniais kanalėliais susijusius genų pokyčius.

2. Rezultatai

2.1. Stx2-Sušvirkštos pelės inkstų patologija

Norint nustatyti su Stx{0}}susijusią pelių inkstų patologiją, Stx2- sušvirkštų pelių inkstų audinių pjūviai buvo nudažyti periodine rūgštimi-Schiff (PAS). Skaidri stipri rausva dėmė kanalėlių epitelio ląstelių luminalinėje pusėje rodo šepetėlio kraštinės glikokaliksą, būdingą proksimalinėms kanalėlių ląstelėms. Mes nustatėme ląsteles / branduolius, esančius už glikokalikso ribų (šviesos erdvėje), kaip atskirtus nuo gretimų ląstelių ir bazinių membranų (ty nuskustų ląstelių). 1B paveiksle (8 val. po Stx2), C ir D (48 val. po Stx2) sulenktos ląstelės su santykinai nepažeistais branduoliais pavaizduotos rodyklėmis. Mes taip pat stebėjome ląstelių liekanas proksimaliniame vamzdiniame liumene (1 paveikslo rodyklės). Po Stx2 vartojimo šie pažeidimai pasirodė gana aiškiai, o 0 val. (1A pav., Be Stx2) jie buvo nereikšmingi.

1 pav. Stx2 sukelia proksimalinių kanalėlių ląstelių slinkimą pelių inkstuose. Rodomos Stx2-sušvirkštų pelių inkstų pjūvių periodinės rūgšties Schiff (PAS) dėmės. (A) 0 h (naivus), (B) 8 val. ir (C) 48 val. po Stx2 injekcijos. Rodyklės rodo slystančias proksimalines kanalėlių ląsteles. Rodyklės rodo ląstelių šiukšles. Padidintas laukas (C) rodomas (D) su slegiančiais langeliais, nukreiptais rodyklėmis. Stulpeliai (A–C) rodo 50 µm. Mastelio juosta (D) rodo 10 µ

2.2. Gb3 ekspresija pelės ir žmogaus inkstuose

2.2.1. Pelės inkstų žievės Gb3 ekspresija

Kadangi proksimalinėse kanalėlių ląstelėse buvo histologinių pažeidimų dėl Stx2 įžeidimo, mes išbandėme Stx2 receptorių globotriaozilceramido (Gb3) ekspresiją pelių inkstų žievėje kartu su proksimaliniu kanalėlių žymekliu akvaporinu -1 (AQP1). Kaip parodyta 2 paveiksle, AQP1-teigiamos ląstelės Gb3 pozityvumą daugiausia rodė luminalinėje ląstelių pusėje (ląstelės pažymėtos uždaromis rodyklėmis, o šviesa pažymėta žvaigždutėmis). Taip pat pastebėjome, kad AQP1 neigiamos vamzdinės Gb3 dėmės greičiausiai surenka latakų ląsteles (2 pav. atvira rodyklė), kaip pranešta [28]. Gb3 dėmės intensyvumas buvo stipresnis AQP1 (-) ląstelėse, tačiau šio tipo kanalėlių skaičius buvo mažesnis, palyginti su Gb3/AQP1 dvigubai teigiamais proksimaliniais kanalėliais žievėje. CD31-teigiamos endotelio ląstelės pelės inkstuose yra neigiamos Gb3. Kaip neigiama kontrolė buvo naudojama Gb3 (žiurkės IgM) antikūnų, atitinkančių izotipus, kontrolė. Žiurkės IgM nereagavo su pelės inkstų audiniu (S1 pav.)

2.2.2. Žmogaus inkstų žievės Gb3 ekspresija

Žmogaus inkstų audinyje Gb3 taip pat buvo teigiamas AQP1-teigiamuose proksimaliniuose kanalėliuose (3 pav., uždaros rodyklės galvutės). Gb3 lokalizacija proksimalinėse kanalėlių ląstelėse buvo stipresnė luminalinėje pusėje. Taip pat stebėjome AQP1 (-) Gb3 (+) ląsteles (3 pav., atviros rodyklės), kaip ir pelių audinyje. Žmogaus endotelio ląstelės ekspresuoja Gb3 (CD31/Gb3 dvigubai teigiamas, 3 pav., žvaigždutė). Izotipo kontrolinės sekcijos su žiurkės IgM neparodė teigiamos reakcijos žmogaus inkstų audinyje (S2 pav.).

2.3. Mikrogardelių analizė

Kadangi tiek pelės, tiek žmogaus proksimalinės kanalėlių epitelio ląstelės yra Gb3 teigiamos, tai rodo, kad šį ląstelių tipą tiesiogiai veikia Stx2. Siekdami nustatyti Stx2-paveiktus genus tiek pelių, tiek žmogaus proksimalinėse kanalėlių ląstelėse, išskyrėme visą RNR iš Stx2-pelių, kurioms buvo sušvirkšta Stx2-ir Stx2-gydytų žmogaus pirminių RPTEC, inkstų ir išanalizavome. genų ekspresija mikrogardeliu

2.3.1. Skirtingai išreikšti genai tiek pelės inkstuose, tiek RPTEC

Buvo pasirinkti skirtingai išreikšti genai (DEG), kurie yra bendri tiek pelių inkstams, tiek RPTEC. Įprastų DEG atrankos pagrindas yra tas, kad (1) genai, kurių log2-karto pokytis (prieš 0 h) yra didesnis nei 1 arba mažesnis nei –1 tiek pelės inkstuose, tiek RPTEC mikrogardelyje bent vienoje laiko taškas ir (2) geno log2-kartų pokyčio pasiskirstymas atitinka kubines kreives, o ne kvadratines kreives, kad geriau atitiktų genų ekspresijos smailes inkstų mikrogardelės laiko eigos viduryje. Remdamiesi dviem aukščiau pateiktais kriterijais, atrinkome 58 bendrus genus tarp Stx2-gydytų pelės inkstų ir žmogaus RPTEC (4A pav.). Šių 58 genų ekspresijos modeliai pelės inkstuose parodyti šilumos žemėlapyje (4B pav.). Dauguma genų buvo sureguliuoti vėlesnėmis valandomis po Stx2 injekcijos; tačiau kai kurie genai turėjo ankstesnius raiškos modelius. Genai, kurių log{15}}kartų pokytis buvo daugiau nei 1, buvo išvardyti kiekvienam laiko taškui (1 lentelė).

4 pav. Mikrogardelių analizė. (A) Tarp genų, išanalizuotų naudojant mikromatricą, 147 genai (žaliu apskritimu) ir 4013 genų (raudonu apskritimu) atitinkamai iš Stx2-gydytų pelės inkstų ir RPTEC buvo aptikti kaip turintys log{ {4}}karto pokytis mažesnis nei –1 arba daugiau nei 1. Genų, kurie buvo pakeisti naudojant Stx2 prieš 0 h abiejose mikrogardelėse (bendrieji skirtingai išreikšti genai / DEG), iš viso buvo 58 (raudona ir žalia persidengimo sritis). (B) Įprastų 58 genų šilumos žemėlapis parodytas pelės inkstų mėginių ėmimo laiko juostoje. Z lygus 0 reiškia geno log2-kartų pokyčio verčių vidurkį ir atspindi genų ekspresijos tendenciją. Taigi žalsva spalva reiškia mažesnę vertę nei konkretaus geno iš eilės vidurkis, o rausva spalva reiškia didesnį nei vidutinį pokytį. 58 genų log2-kartų duomenys iš PBS sušvirkšto 72 val. duomenų rinkinio, palyginti su 0 val., pateikti kaip S3 lentelė. (C) Rodoma Metascape GO sodrinimo juostinė diagrama. X ašyje rodomos praturtintų GO terminų −log10 p reikšmės per 58 įprastus laipsnius, kad sistemai labiau tikėtinas didesnis praturtinto GO termino skaičius. Rodoma 20 geriausių praturtintų GO terminų. (D) 58 bendrų DEG STRING analizė parodyta šešiose labiausiai susietose grupėse. Sferinės spalvos žymi genus, priklausančius tai pačiai klasteriui. Veiksmų ryšiai tarp genų rodomi spalvomis ir pabaigos formomis. ENSG00000279576 dabar buvo užkoduotas kaip ENSP00000485396, kuris žymi MALAT1 geno žmogaus ID.

Norėdami išanalizuoti įprastų DEG funkcionalumą, naudojome „Metascape“ platformą. Jis priskiria genų ontologijos (GO) terminus, kuriuos sudaro molekulinė funkcija, ląstelių komponentas ir biologinis procesas, pasirinktiems genams. Į „Metascape“ įtraukėme įprastus 58 DEG ir gavome 20 geriausių GO terminų, kuriems priklauso šie DEG (4C pav.). GO terminai yra išvardyti su atitinkamais genais S1 lentelėje. Norėdami pamatyti genų sąrašą kiekviename GO termine, parodytame 4C paveiksle, žr. S2 lentelę „Metascape“ sodrinimas. GO terminai, susiję su ląstelių mirtimi, uždegimu ir signalizacijos kaskadomis, buvo įtraukti į 20 geriausių, kaip ir tikėtasi; tačiau cirkadinis ritmas atkreipė dėmesį kaip naujas GO terminas. Žinomos bendrų genų jungtys buvo parodytos naudojant STRING analizę (4D pav.). Šioje analizėje genai buvo suskirstyti į šešias skirtingas grupes, kurios buvo susijusios su stipriu surišimo, įtakos (katalizė, aktyvinimas ar slopinimas), taip pat genų ekspresija.

2.3.2. Genų ekspresijos tendencija

Kelių genų išraiškų pėdsakai rodomi diagramose su x ašimi (h) po Stx2 injekcijos, o y ašimi – log2-kartų pokyčiui, palyginti su 0 h (5 pav.). Taigi y ašies reikšmė lygi 1 reiškia 2-karto pokytį, palyginti su 0 h išraiška.

5 pav. Skirtingai išreikšti genai su pelės mėginių ėmimo laiko juosta. (A) Rodomi PDK4 ir CEBPB mRNR ekspresijos modeliai. (B) tiesioginiai ankstyvieji genai. (C) Matricaląstelinių baltymų CYR61 (CCN1) ir CTGF (CCN2) ekspresijos. (D) Rodomi su UPR susiję genai DDIT3 (CHOP, GADD153), DDIT3 surišimo partneris CEBPB ir neigiamo grįžtamojo ryšio faktorius PPP1R15A (GADD34). (E) Rodomi transkripcijos faktoriai DDIT3 (CHOP, GADD153) ir ATF3 bei GDF15, kuriuos transkripcija reguliuoja šie veiksniai. (F) Rodomi su UPR ir RSR susiję genai. (G) EDN1, palyginti su UPR genais, pavaizduotas. (H) Ankstyvieji EDN1 ir EGR1 smailės ir kitas PER1 smailės rodomos vėliau laipsniškai didėjant visiems trims genams. (I) Genai iš 4D paveikslo purpurinio klasterio yra su cirkadiniu ritmu susiję genai. (J) Rodomi cirkadiniai šerdies genai PER1, Arntl (BMAL1), Cry1 ir Clock. (K) Rodomi PER1 ir cirkadinio laikrodžio reguliuojami inkstų genai. (L) Rodomi uždegiminiai genai su NF-kB keliu susijusiais genais. Norėdami pamatyti atskirus log2 duomenų taškus, žr. papildomą S4 paveikslą. S5 paveikslas, kuriame parodytas vidutinis log2 su standartinio nuokrypio juostomis, pateikiamas kaip nuoroda.

„Wecistanche“ – didžiausio cistansų eksportuotojo Kinijoje – pagalbinė tarnyba:

El. paštas:wallence.suen@wecistanche.com

Whatsapp / Tel:+86 15292862950

Įsigykite daugiau specifikacijų:

https://www.xjcistanche.com/cistanche-shop

GAUKITE NATŪRALIŲ EKOLOGIŠKŲ CISTANČŲ EKSTRAKTO SU 25% ECHINAKOZIDU IR 9% AKTEOZIDU NAUDOJANT INKŠTŲ INFEKCIJĄ