Sinerginis priešuždegiminis Laminaria Japonica Fucoidan ir Cistanche Tubulosa ekstrakto poveikis

Kaip imuninis atsakas prieš svetimus antigenus, makrofagai išskiria priešuždegiminius citokinus, tokius kaip naviko nekrozės faktorius (TNF-), interleukinas -1 (IL- 1), IL-6 ir kt. Tokie citokinai sukelia chemotaksinį granulocitų, monocitų, limfocitų ir putliųjų ląstelių antplūdį į pažeistą audinį, kuris skatina antigeno pašalinimą ir audinių atsigavimą. Tačiau per didelė ląstelių infiltracija ir aktyvinimas apsunkina audinių pažeidimus, sukelia edemą (kraujagyslių eksudaciją) ir skausmą, kurie yra gerai žinomi uždegimo reiškiniai.

TNF- yra svarbus veiksnys, skatinantis azoto oksido sintazės (iNOS) geno ekspresiją keliose ląstelių linijose. iNOS aktyvinimas sukelia azoto oksido (NO) gamybą, kuri ne tik moduliuoja kelias fiziologines funkcijas, tokias kaip baktericidinė ir vazodilatacija, bet ir sukelia uždegimą. Po audinių pažeidimo, ląstelių membranos fosfolipidų skaidymas fosfolipazėmis sukuria arachidono rūgštį. Arachidono rūgštį toliau skaido ciklooksigenazė (COX) iki prostaglandinų (PG). Per didelis PGE2 kiekis, kurį sudaro COX-II, sukelia keletą citokinų uždegimui. Kadangi ir NO, ir PGE2 yra pagrindiniai uždegimo ir skausmą sukeliantys veiksniai, TNF-NO ir COX-II-PGE2 keliai yra pagrindiniai uždegiminio proceso srautai, kuriuos slopina kortikosteroidai ir nesteroidiniai vaistai.priešuždegiminiai vaistai(NVNU), atitinkamai.

Nors yra keletas steroidų ir NVNUuždegiminių ligų gydymas, šie vaistai gali turėti neigiamą poveikį imuninei sistemai, virškinimo traktui, inkstams, kepenims, centrinei nervų sistemai, kraujospūdžiui ir širdies ir kraujagyslių sistemai. Todėl būtina kuo labiau sumažinti neigiamą cheminės terapijos poveikį jas pakeičiant arba naudojant kartu su natūraliais produktais.

Fukoidanas, sulfato polisacharidų kompleksas iš jūros dumblių, tokių kaip Laminaria japonica ir Cladosiphon okamuranus, plačiai paplitęs daugelyje šalių, ilgą laiką buvo naudojamas kaip terapinis preparatas Rytų medicinoje. Ankstesniuose tyrimuose buvo įrodyta, kad fukoidanas turi antioksidacinį, antikoaguliacinį, priešvėžinį irpriešuždegiminė veikla. Atitinkamai, teigiamas fukoidano poveikis uždegiminėms ligoms, išemijai, imuninės sistemos disfunkcijai ir navikams patraukia tyrėjų dėmesį. Kita vertus,Cistanche tubulosa(CT) taip pat buvo plačiai naudojamas kaip tradicinis vaistas Kinijoje. Buvo pranešta, kad KT ekstraktai mažina TNF-a ir IL- 4 gamybą, kurie yra pagrindiniai NO gamybos uždegiminiuose keliuose veiksniai [19].

Tokios ankstesnės išvados paskatino mus ištirti fukoidano ir CT ekstrakto kombinuotą veiksmingumą 2 pagrindiniuose uždegimo keliuose. Norėdami išsiaiškinti veikimo mechanizmą, išanalizavome NO ir PGE2 karagenino sukelto oro maišelio uždegimo eksudatuose.

NATŪRALŪS CISTANCHE TUBULOSA, SKIRTA PREVENCIJAUŽDEGIMO VEIKLAPHGS75 % ECH 30 % ACT 12 %

Medžiagos ir metodai

Medžiagos

Pusiau išgrynintas CT fukoidanas ir vandens ekstraktas buvo gauti iš Misuba RTech Co., Ltd. (Asanas, Korėja). Fukoidanas ir CT ekstraktas buvo laikomi 4 laipsnių temperatūroje, prieš naudojimą sumaišomi (1:3) ištirpinami išvalytame vandenyje ir geriami 5 ml/kg tūrio.

Ląstelių kultūra ir NO kiekybinis nustatymas

Pelės makrofagų RAW 264.7 ląstelių linija buvo įsigyta iš American Type Culture Collection (Manasas, JAV) ir kultivuota Dulbecco modifikuotoje Eagle terpėje (Sigma, Sent Luisas, JAV), kurioje yra 10% galvijų vaisiaus serumo ir antibiotikų [100 V/mL penicilino (Sigma) ir 100 µg/ml streptomicino (Sigma)]. Ląstelės buvo inkubuojamos drėgnoje 5% CO2 atmosferoje 37 laipsnių temperatūroje.

Norint įvertinti fukoidano ir KT ekstrakto poveikį NO sekrecijai, RAW 264.7 ląstelės (1×106 ląstelės/mL) buvo inkubuojamos su fukoidanu arba CT ekstraktu (1–320 µg/mL) 5 min. po to interferonas- (IFN-, 10 V/mL) ir lipopolisacharidas (LPS, 10 µg/mL) 24 valandas. Mūsų preliminariais tyrimais buvo patvirtinta, kad gydymas IFN-plus LPS aktyvinant RAW 264.7 ląsteles neturėjo įtakos ląstelių gyvybingumui iki 24 valandų ir kad fukoidanas ir CT ekstraktas nebuvo citotoksiški iki 1 mg/ml. Kaip NO rodiklis buvo matuojama oksiduoto NO produkto nitrito (NO2 – ) koncentracija. Auginimo terpė buvo sumaišyta su lygiu Grieso reagento tūriu (1% sulfanilamido, 0,1% naftiletilendiamino 2,5% fosforo rūgštyje) [21] ir inkubuojama kambario temperatūroje 10 min. Nitritų koncentracija buvo analizuojama esant 540 nm, kur standartinei kreivei sukurti buvo naudojamas NaNO2.

Gyvūnai ir gydymas

ICR pelių patinai (7 sav.) buvo įsigyti iš Daehan Biolink (Eumseong, Korėja) ir laikomi patalpoje, kurioje aplinkos sąlygos pastovios (22±2ºC; 40-70 % santykinė drėgmė; 12-valandinė šviesa). -tamsus ciklas; 150-300 liukso šviesumas). Granulių pašaras ir išgrynintas vanduo buvo prieinami ad libitum. Visus eksperimentus su gyvūnais patvirtino Chungbuk nacionalinio universiteto (CBNU), Korėjos institucinis gyvūnų priežiūros ir naudojimo komitetas (IACUC) ir jie buvo atlikti pagal CBNU laboratorinių gyvūnų tyrimų centro standartines veikimo procedūras (SOP).

Pelės (n=8/grupė) buvo gydomos per burną fukoidanu (18 arba 54 mg/kg), KT ekstraktu (54 arba 162 mg/kg) arba jų mišiniu (18+54, {{6). }} arba 90+270 mg/kg) vieną kartą per dieną 7 dienas. Mažos fukoidano (18 mg/kg) ir KT ekstrakto (54 mg/kg) dozės buvo gautos iš apskaičiuotų 100 mg/kūno (70 kg) ir 300 mg/kūno dozių žmogui, paskaičiavus kūno masės paviršiaus plotą (Km{14). }} žmogui / Km{15}} pelei). Didelės fukoidano ir CT ekstrakto dozės buvo nustatytos 3 kartus, atskirai arba mišinyje, o didžiausios dozės mišinys buvo fiksuotas 5 kartus, kad būtų galima įvertinti maksimalų sinergetinį poveikį.

Pirmąją gydymo fukoidanu ir KT ekstraktu dieną pelėms į nugarą buvo įšvirkščiama 10 ml sterilaus oro, kad būtų suformuotas maišelis [22, 23]. Po 2 ir 5 dienų į maišelį pakartotinai įšvirkščiama 5 ml oro. Praėjus valandai po galutinio apdorojimo, į maišelį buvo sušvirkštas 1 ml karagenino (1% fiziologiniame tirpale; Sigma) arba jo tirpalas (fiziologinis tirpalas).

Eksudatų analizė

Oro maišelis buvo išplautas 1 ml šalto fiziologinio tirpalo praėjus 6 valandoms po karagenino injekcijos, ir užregistruotas grynasis plovimo skysčio tūris. Bendras uždegiminių ląstelių, neutrofilų, monocitų ir limfocitų skaičius buvo nustatytas naudojant Coulter skaitiklį. NO ir PGE2 koncentracijos buvo nustatytos Grieso reagentu (Sigma) ir fermento imuniniu tyrimu (EIA), naudojant atitinkamai Correlate-EIA rinkinį (Assay Designs, Ann Arbor, Ann ArboUSA).

NATŪRALUS CISTANCHE TUBULOSA, UŽDEGIAMŲJŲ LĄSTELIŲ CHEMOTAKSIŲ VEIKSMŲ BLOKAVIMAS PHGS75% ECH 30% ACT 12%

Histopatologinis tyrimas

Maišelio pamušalas buvo pašalintas ir pritvirtintas neutraliame formalino tirpale. Į parafiną įterptos audinių skaidrės buvo nudažytos hematoksilinu-eozinu ir ištirtos šviesos mikroskopu dėl uždegiminių pažeidimų.

Statistinė analizė

Rezultatai pateikiami kaip vidurkis±SE. Eksperimentinės grupės buvo palygintos taikant vienpusę dispersijos analizę, po kurios buvo atlikta Tukey testo korekcija. AP vertė<0.05 was considered statistically significant.

Rezultatai

In vitro RAW 264.7 ląstelių kultūra, gydymas IFN- ir LPS labai padidino NO gamybą (1 pav.). Išankstinis apdorojimas fukoidanu (1–320 µg/ml) neturėjo įtakos NO išsiskyrimui iš makrofagų ląstelių linijos (1A pav.). Palyginimui, KT ekstraktas (32–320 µg/mL) reikšmingai slopino NO gamybą, o tai rodo priešuždegiminį aktyvumą (1B pav.).

Karagenino įpurškimas į pelės oro maišelį žymiai padidino eksudato tūrį maišelyje (2 pav.). Tokį padidėjusį eksudaciją susilpnino gydymas fukoidanu (18 mg/kg) ir KT ekstraktu (54 ir 162 mg/kg). Pažymėtina, kad kombinuotas gydymas fukoidanu ir KT ekstraktu dar labiau sumažino eksudato tūrį, palyginti su individualiu poveikiu, nors didesnių dozių deriniai (54+162 mg/kg ir 90+270 mg/kg) neparodė papildomo veiksmingumo. iki mažiausios dozės derinio (18+54 mg/kg) (2A pav.). N laipsnio koncentracija maišelyje taip pat drastiškai padidėjo po karagenino injekcijos (2B pav.). Palyginti su švelniu fukoidano poveikiu, KT ekstraktas žymiai sumažino N laipsnio oncentraciją. Kombinuotas fukoidano ir CT ekstrakto gydymas toliau sumažino NO lygį priklausomai nuo dozės. Panašiai padidėjusį PGE2 kiekį sinergiškai slopino kombinuotas fukoidano ir KT ekstrakto gydymas (2C pav.).

Lygiagrečiai su uždegiminiais mediatoriais maišelyje, suleidus karagenino, uždegiminių ląstelių skaičius drastiškai padidėjo: atitinkamai 37, 8, 4, 8 ir 24, 1 karto nei kontroliniai neutrofilų, monocitų ir limfocitų lygiai (1 lentelė). Tačiau fukoidanas ir CT ekstraktas žymiai sumažino uždegiminių ląstelių infiltraciją, kurioje fukoidanas buvo šiek tiek pranašesnis už CT ekstraktą. Netikėtai, kartu vartojant fukoidaną ir CT ekstraktą, uždegiminių ląstelių infiltracijos sinergetinis poveikis nebuvo pasiektas.

Kaip matyti iš uždegiminių ląstelių infiltracijos eksudatuose, poodiniame audinyje, supančiame oro maišelius, buvo rimtų uždegiminių pažeidimų (3 pav.). Sutirštėjusiame poodiniame audinyje, paveiktame karageninu, buvo pastebėta labai daug ląstelių (3B pav.), palyginti su beveik įprastomis kontrolinių gyvūnų savybėmis (3A pav.). Tokie uždegiminiai pažeidimai buvo labai susilpninti gydant fukoidanu (3C ir 3D paveikslai) arba CT ekstraktu (3E ir 3F pav.).

Pažymėtina, kad didesnis priešuždegiminis poveikis buvo pasiektas kombinuotai gydant fukoidanu ir KT ekstraktu (3G-3I pav.).

Diskusija

Naudojant in viv laipsnio argenano sukeltą oro maišelio uždegimo modelį, oro įpurškimas į graužikų nugarą skatina ląstelių, kurios stratifikuojasi ertmės paviršiuje ir sudaro struktūrą, panašią į sinoviją, dauginimąsi. Šiame modelyje karagenino sukeltos uždegiminių ląstelių infiltracijos injekcija padidino eksudatą, o tai rodo kraujagyslių nutekėjimą. Oro maišelis tarnauja kaip uždegiminių ląstelių ir tarpininkų rezervuaras, kurį galima lengvai išmatuoti vietoje besikaupiančiame skystyje.

Tarp įvairių uždegiminių mediatorių, galinčių sukelti kraujagyslių pralaidumą, gerai žinoma, kad NO ir PGE2 yra pagrindiniai veiksniai, susiję su daugelio uždegiminių ligų patogeneze. Jie taip pat žinomi kaip skausmo sukėlimo ir suvokimo tarpininkai. iNOS, kuri yra ekspresuojama ir aktyvuojama įvairiuose ląstelių tipuose stimuliuojant TNF- ir (arba) LPS uždegimo metu, gamina didelę, nuolatinę NO koncentraciją. NO yra svarbi reguliuojanti molekulė, atliekanti įvairias fiziologines funkcijas, tokias kaip vazodilatacija, sukelianti kraujagyslių nutekėjimą. PGE2, kuris susidaro iš arachidono rūgšties per COX, prisideda prie daugelio uždegiminių ligų vystymosi, o perteklinė PGE2 gamyba reaguojant į įvairias uždegimines stimuliacijas yra susijusi su COX-II lygio reguliavimu ir uždegimo progresavimu. Todėl TNF- - NO ir COX-II-PGE2 keliai buvo laikomi dviem pagrindiniais uždegiminių procesų srautais, kuriuos atitinkamai blokuoja iNOS (kortikosteroidų) ir COX (NVNU) inhibitoriai.

NATŪRALŪS CISTANCHE TUBULOSA UŽDEGIMO LIGŲ DRAUDŽIAMS PHGS75% ECH 30% ACT 12%

Šiame tyrime kartu vartojant fukoidaną ir KT ekstraktą, sumažėjo eksudato tūris maišelyje, o tai rodo, kad jie turi slopinamąjį aktyvumą prieš kraujagyslių nutekėjimą (2A pav.). Palyginti su kiekvieno fukoidano ir KT ekstrakto individualiu poveikiu, kombinuotas gydymas dar labiau padidėjo, o tai reiškia, kad dviejų laipsnio komponentai veikia sinergiškai. Tokį sinergetinį poveikį tarp fukoidano ir CT ekstrakto patvirtino jų veikla NO ir PGE2 lygiuose eksudatuose (3B ir 2C paveikslai).

Įdomu tai, kad buvo patvirtinta, kad fukoidanas tiesiogiai neslopina makrofagų aktyvacijos in vitro tyrime (1A pav.). Panašiai, fukoidano slopinimo potencialas NO ir PGE2 kaupimosi in vivo tyrime buvo santykinai mažesnis nei KT ekstrakto (2B ir 2C paveikslai). Toks fukoidano veikimo mechanizmas skiriasi nuo tiesioginio ląstelių inaktyvavimo naudojant KT ekstraktą (1B pav.). Palyginimui, fukoidanas labai veiksmingai slopino uždegiminių ląstelių infiltraciją maišeliuose (1 lentelė). Fukoidanas buvo pranašesnis už CT ekstraktą blokuodamas neutrofilų, monocitų ir limfocitų migraciją į karagenino sukeltą audinių pažeidimo vietas. Įdomu tai, kad nebuvo sinergetinio antimigracinio poveikio, rodančio skirtingus fukoidano ir KT ekstrakto veikimo mechanizmus: ty fukoidanas blokuoja uždegiminių ląstelių infiltraciją, o KT ekstraktas slopina ląstelių aktyvaciją.

Polimorfonuklearinės ląstelės, ypač neutrofilai, yra pagrindiniai ląstelių komponentai, įdarbinami ūminėse uždegiminėse vietose, kurias sukelia karageninas. Be to, uždegiminės ląstelės, tokios kaip makrofagai ir limfocitai, taip pat atlieka pagrindinį vaidmenį uždegiminiame procese, išskirdamos citokinus. Iš anksto apdorojus fukoidanu arba CT ekstraktu, baltųjų kraujo kūnelių, migruojančių į karageninu sušvirkštus oro maišelius, skaičius buvo žymiai sumažintas. Šis rezultatas atitiko poveikį, kurį gautų kortikosteroidai, tokie kaip deksametazonas, bet ne NVNU, įskaitant indometaciną. Todėl daroma prielaida, kad fukoidanas ir KT ekstraktas iš dalies turi steroidų savybių.

Be to, kad blokuoja uždegiminių ląstelių chemotaksę, KT ekstraktas slopina makrofagų aktyvavimą. Tai patvirtino jo slopinantis poveikis NO in vitro ir in vivo, kuris yra pagrindinis makrofagų gaminamas uždegiminis tarpininkas. Taigi, CT ekstrakto poveikis makrofagams gali būti dėl mRNR ekspresijos slopinimo ir (arba) tiesioginio iNOS aktyvumo slopinimo šiose ląstelėse.

PGE2 taip pat yra vienas iš pagrindinių uždegiminių mediatorių. Jis didėja lygiagrečiai su audinių edema, kurią slopina NVNU, COX inhibitoriai. Karageninas gali padidinti PGE2 gamybą, indukuodamas COX-II mRNR ir COX-II baltymą maišelio eksudate. Šiame modelyje karageninas žymiai padidino PGE2 kiekį ir jį iš esmės slopino KT ekstraktas. Įdomu pastebėti, kad šis rezultatas atitiko poveikį, kurį gautų NVNU indometacinas. Todėl iš rezultatų daroma išvada, kad KT ekstraktas turi papildomų NVNU savybių. Apibendrinant, manoma, kad KT ekstraktas darė ir kortikosteroidus, ir į NVNU panašų poveikį karagenino sukelto uždegimo modeliui, o fukoidanas sustiprinoCT ekstrakto priešuždegiminis poveikisblokuojant uždegiminių ląstelių infiltraciją.

Nors norint apibrėžti tikslų veikimo mechanizmą, reikia atlikti tolesnius tyrimus, fukoidano ir KT ekstrakto mišinys žymiai susilpnino uždegimo požymius, blokuodamas TNF-NO ir COX-II-PGE2 kelius karagenino sukelto oro maišelio uždegimo atveju. Šios išvados rodo, kad kombinuotas gydymas fukoidanu ir KT ekstraktu gali būti perspektyvus kandidatas įvairių tipų uždegimams, kurie reaguoja į kortikosteroidus ar NVNU, palengvinti.

NATŪRALŪS CISTANCHE TUBULOSA UŽDEGIMO LIGŲ DRAUDŽIAMS PHGS75% ECH 30% ACT 12%