Tetrandrinas palengvina podocitų sužalojimą per nuo kalcio priklausomą kalpainą-1 signalinę blokadą

Kontaktai: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 El. paštas:audrey.hu@wecistanche.com

Yin Ding, Xuanli Tang, Yuhui Wang, Dongrong Yu, Caifeng Zhu ir Jin Yu*

Abstraktus

Fonas:Podocitai tapo esminiu intervencijų į proteinuriją tiksluinkstasligų. Daugelis tyrimų pranešė, kad per didelė trumpalaikio receptorių potencialo katijonų kanalo baltymo 6 (TRPC6) ekspresija podocitų pažeidimo metu padidina intracelulinį Ca2 ir antplūdį bei stimuliuoja nuo Ca2 plius priklausomą proteazės kalpaino -1 signalizaciją. Tradicinis kinų vaistas tetrandrinas, neselektyvus Ca2 ir kanalų blokatorius, jau seniai naudojamas lėtinėms ligoms gydyti.inkstasliga. Šiuo tyrimu buvo siekiama ištirti galimus mechanizmus, kuriais grindžiamos tetrandrino antiproteinurinės savybės.

Metodai:Ištyrėme tetrandrino dalyvavimą Ca2 ir priklausomo kalpaino -1 signalizacijoje pelių podocitų ir adriamicino sukeltos nefropatijos žiurkėms. Ciklosporinas A (CsA) ir U73122 buvo naudojami kaip teigiami kontroliniai mėginiai. Buvo ištirtas ląstelių gyvybingumas, citotoksiškumas, Ca2 plius koncentracija, kalpaino aktyvumas ir kalpaino -1 signalizacijos kelių mRNR ir baltymų ekspresijos lygiai. Išmatuoti klinikiniai ir patologiniai pokyčiai.

Rezultatai:Tetrandrinas sumažino tarpląstelinį Ca2 ir antplūdį auginamuose TRPC{1}}per daug ekspresuojančiuose podocituose. Tiek in vitro, tiek in vivo tyrimų metu tetrandrino vartojimas sumažino kalpaino aktyvumą ir kalpaino -1 ekspresiją bei atkūrė pasroviui esančio Talino-1 ir nefrino ekspresiją. Palyginti su CsA, gydymas tetrandrinu turėjo didesnį slopinamąjį poveikį kalpaino aktyvumui ir kalpaino -1 ekspresijai.

Išvados:Tetrandrinas turi gydomąjį potencialą podocitų pažeidimui blokuodamas nuo Ca2 plius priklausomą kalpaino -1 signalizacijos kelio aktyvavimą. Tetrandrinas sumažino proteinuriją, pagerino inkstų funkciją ir palengvina patologinį inkstų pažeidimą.

Raktiniai žodžiai:Tetrandrinas, podocitų pažeidimas, trumpalaikis receptorių potencialo katijonų kanalo baltymas 6, kalpainas-1

Cistanche tubulosa apsaugo nuo inkstų ligos, spustelėkite čia, kad gautumėte mėginį

Fonas

Podocitai yra būtina sąlyga norint išlaikyti selektyvų glomerulų filtracijos barjero pralaidumą ir glomerulų struktūros vientisumą. Podocitų pažeidimas paprastai yra susijęs su proteinurinėmis inkstų ligomis, įskaitant židininę segmentinę glomerulosklerozę (FSGS), membraninę nefropatiją, minimalių pokyčių ligą ir diabetą.inkstasliga [1–4]. Podocitų apsauga ir atkūrimas nuo žalingų veiksnių yra pagrindinis sėkmingo inkstų ligos gydymo iššūkis.

Podocitai yra labai specializuotos, galutinai diferencijuotos ląstelės, esančios už glomerulų bazinės membranos ir pasižyminčios pėdos procesais. Kalcio signalizacijos reguliavimo podocituose disfunkcija sukelia podocitų aktino citoskeleto dezorganizaciją, pėdos proceso pažeidimą, plyšio diafragmos sutrikimą ir proteinuriją. Laikinasis receptorių potencialo katijonų kanalo baltymas 6 (TRPC6), naujas su plyšine diafragma susijęs baltymas podocituose, buvo nustatytas kaip nespecifinis Ca2 plius laidus jonų kanalas [5–8]. Glomerulinė TRPC6 ekspresija padidėja sergant daugeliu paveldimų ir įgytų proteinurinių ligų. Ankstesni tyrimai pranešė, kad per didelis TRPC6 ekspresija podocituose padidina intracelulinį Ca2 ir antplūdį, kuris, kaip manoma, yra atsakingas už podocitų ląstelių pažeidimą. Padidėjęs kalcio kiekis podocituose suaktyvina signalizacijos kelius pasroviui, įskaitant kalpainą{10}}, taliną-1, nefriną ir kalcineuriną, kad moduliuotų tikslinių genų aktyvumą arba ekspresiją [9–12]. Fangji Huangqi Tang yra klasikinė tradicinė kinų medicina (TCM), skirta nefroziniam sindromui gydyti [13]. Jį sudaro šešios žolės: Radix Stephania Tetrandra (Stephania tetrandra šaknys), Radix Astragali (Astragalus membranaceus šaknys), Rhizoma Atractylodis Macrocephalae (Atractylodes macrocephaly šaknys), Radix Glycyrrhizae (Zomaniencyrrhiisinga Ghiiszlyencyrrhiisza). (Zingiber Officinale šaknys) ir Fructus Ziziphi Jujubae (Fructus of Ziziphus jujuba) [1]. Tetrandrinas, vienas iš pagrindinių aktyviųjų Radix Stephania Tetrandra komponentų, neselektyvaus Ca2 ir kanalų blokatoriaus, buvo išbandytas klinikiniuose tyrimuose ir buvo skirtas palengvinti proteinuriją ir pagerinti inkstų funkciją [14, 15]. Ankstesnis tyrimas parodė, kad tetrandrinas blokuoja Ca2 ir priklausomą RhoA signalizaciją podocituose [16], tačiau pagrindiniai mechanizmai nebuvo išaiškinti. Čia buvo sukurti TRPC{22}}per daug ekspresuojantys modeliai in vitro ir in vivo. Po tetrandrino skyrimo buvo įvertinti TRPC6-priklausomo Ca2 plius signalizacijos pokyčiai, įskaitant taikinius pasroviui, kalpainą-1, taliną-1, nefriną ir kalcineuriną. Ciklosporinas A (CsA), kalcineurino inhibitorius, plačiai naudojamas proteinurijos ligoms gydyti) [17] ir U73122, TRPC6 kanalo atidarymo inhibitorius [18], buvo naudojami kaip teigiami kontroliniai mėginiai.

Metodai

Ląstelių kultūra ir plazmidės konstravimas

Sąlygiškai įamžintos pelių podocitų ląstelių linijos (MPC5) ląstelės, gautos iš profesoriaus Peterio Mundelio (Mount Sinai medicinos mokykla, JAV), buvo palaikomos 33 laipsnio proliferacijai, o paskui perkeltos į 37 laipsnius diferenciacijai. TRPC6 ekspresijos plazmidė buvo sukurta klonuojant visą TRPC6 geno koduojančios DNR sekos ilgį į pCDH-GFP-PURO vektoriaus EcoRI/BamHI vietas ir supakuota į lentivirusą. Kai jie buvo diferencijuoti ir išauginti iki maždaug 80 procentų susiliejimo, podocitai buvo pasėti, kai ląstelių tankis buvo 4 × 104 cm2, ir inkubuojami kartu su TRPC{11}}per daug ekspresuojančiu lentivirusu. Tolimesniems eksperimentams buvo naudojama stabili TRPC6 ląstelių linija, patikrinta naudojant TRPC6 baltymą ir mRNR ekspresiją. Tus, MPC5 podocitai buvo suskirstyti į tris grupes: normalios kontrolės (NC) grupę, tuščią lentiviruso (Lv-NC) grupę ir TRPC{16}}per daug ekspresuojančią (OverTRP) grupę.

In vitro ląstelių gydymas vaistais ir citotoksiškumo tyrimas

Ląstelių gyvybingumas buvo nustatytas naudojant ląstelių skaičiavimo rinkinio{{0}} (CCK-8) tyrimą pagal gamintojo instrukcijas. Iš viso 5000 MPC5 podocitų vienoje duobutėje buvo auginami trimis egzemplioriais 96-šulinėlių plokštelėse. Ląstelės buvo apdorotos CsA (0–2 μmol/L; Sigma-Aldrich, Sent Luisas, MO, JAV) ir tetrandrino (0–40 μmol/L; Sigma Aldrich) serija 37 laipsnių temperatūroje 48 valandas. Tada CCK-8 buvo pridėta į plokšteles (10 μL/šulinėlis), kurios po to buvo inkubuojamos tamsoje 2 valandas. Absorbcija ties 450 nm buvo išmatuota naudojant mikroplokštelių skaitytuvą (BioTek Instruments, JAV). Citotoksiškumas buvo ištirtas kiekybiškai nustatant laktato dehidrogenazės (LDH) išsiskyrimą, naudojant citotoksiškumo LDH tyrimo rinkinį-WST (Dojindo Laboratories, Japonija). Kaip teigiama kontrolė, ląstelės buvo apdorotos 10 μmol / LU73122 (Cal biochem, JAV) 37 laipsnių temperatūroje 10 minučių.

RNR ekstrahavimas ir kiekybinė atvirkštinės transkriptazės-polimerazės grandininė reakcija (qRT-PCR)

Bendra RNR buvo paruošta iš kultivuotų ląstelių irinkstasaudiniai naudojant RNAiso Plus reagentą (Takara, Japonija) ir atvirkštiniu būdu perrašyti į cDNA PrimeScript™ RT Master Mix rinkinį (Takara) pagal gamintojo protokolą. qRT-PGR buvo atlikta naudojant Power SYBR Green PCR Master Mix (Thermo Fisher Scientific, Vokietija). Tikslinių ir etaloninių genų pradmenų sekos yra išvardytos papildomoje S1 lentelėje. Duomenys buvo renkami naudojant ABI Prism 7900HT FAST Real-Time PGR sistemą. Santykinis tikslinio geno ekspresijos kiekybinis įvertinimas buvo normalizuotas naudojant lyginamąjį 2-ΔΔCt metodą. Kaip vidinė kontrolė buvo naudojama gliceraldehido 3-fosfato dehidrogenazė (GAPDH).

Western blotingas

iš kultivuotų ląstelių buvo paimti bendri baltymų mėginiai irinkstasaudinių. Baltymų koncentracija buvo nustatyta naudojant BCA baltymų tyrimo rinkinį (Thermo Fisher Scientific). Mėginiai buvo atskirti ant 10 procentų natrio dodecilsulfato-poliakrilamido gelio ir perkelti ant polivinilideno difluorido membranos. Tada membrana per naktį buvo užblokuota 4 laipsnių kampu pirminiais antikūnais, būtent anti-TRPC6 (Santa Cruz, JAV), anti-cal pain-1 (Abcam, JK), anti-Talin-1 (Abcam) , anti-nefrinas (Santa Cruz) ir antikalcineurinas (Abcam). Po plovimo membrana buvo inkubuojama su ožkų antitriušių IgG (H plius L; Jackson ImmunoResearch Laboratories, JAV). Membrana taip pat buvo apdorota, kad būtų galima aptikti GAPDH (Abcam), kad būtų vienoda apkrova. Pirminio antikūno atpažintos juostos buvo vizualizuotos, o baltymų juostų optinis tankis buvo analizuojamas naudojant TanonImage programinę įrangą (Tanon, Kinija).

Citozolinio Ca2 plius nustatymas auginamuose podocituose.MPC5 podocitai buvo pasėti ir apdoroti tetrandrinu, CsA ir U73122 atitinkamai 48 val., 48 val. ir 10 min. Tada podocitai buvo inkubuojami su RPMI-1640, papildytu 10 μM Fluo-3AM (Dojindo Laboratories) 30 minučių tamsoje. Po to jie buvo nedelsiant plaunami fosfatiniu buferiniu tirpalu, kuriame jie buvo palaikomi ir sužadinami 488 nm. Santykinė citozolinio Ca2 plius jonų koncentracija buvo įvertinta išmatuojant fluorescencijos intensyvumą naudojant Zeiss lazerinę konfokalinę vaizdo sistemą (Zeiss, JAV).

Kalpaino aktyvumo matavimas

Kalpaino aktyvumas buvo nustatytas naudojant Calpain Activity Assay Kit iš Abcam Inc., pagal gamintojo protokolą. Supernatantas (150 uL) podocitų arbainkstasaudiniai buvo paimti atitinkamu buferiniu tirpalu (145 mmol/l Nacl, 100 mmol/l Tris-HCL, pH 7,3) ir 0,15 ml-Succinyl-Leu-Tyr-AMC (500 umol/L). Po 1-h inkubacijos 37 laipsnių temperatūroje tamsoje, mėginiai buvo nuskaityti naudojant fluorometrą su 360 nm sužadinimo filtru ir 440 nm emisijos filtru.

Adriamicino sukeltos nefropatijos (ADRN) žiurkės modelis Remiantis Fermi aproksimuotu mėginio dydžiu [19] ir proteinurijos skirtumu tarp kontrolinės ir modelio grupių mūsų preliminariuose eksperimentuose, buvo nustatytas bendras mūsų tyrime reikalingas žiurkių skaičius. Iš viso 56 sveiki Sprague-Dawley žiurkių patinai, sveriantys maždaug 200 g ir maždaug 8 savaičių amžiaus (Zhejiang Institute of TCM), buvo atsitiktinai suskirstyti į septynias grupes (n =8 žiurkių grupėje), būtent ADR grupę, ADR plius. tetrandrino mažos dozės grupė (4 mg/kg per dieną), ADR ir vidutinės tetrandrino dozės grupė (8 mg/kg per dieną), ADR ir didelės tetrandrino dozės grupė (16 mg/kg per dieną), ADR ir CsA gydoma grupė (30 mg) /kg/d.), ADR ir vidutinė tetrandrino dozė (8mg/kg/d) kartu su CsA (30mg/kg/d) grupė ir NC grupė. Modelinės grupės ir vaistų gydymo grupių žiurkės buvo anestezuotos intraperitonine ketamino hidrochlorido injekcija (50 mg / kg), o dvi ADR dozės (4 mg / kg) buvo sušvirkštos į uodegos veną, kad būtų sukurtas FSGS žiurkės modelis. Po 12 savaičių žiurkių šlapimo mėginiai buvo renkami 24 valandas naudojant metabolinius narvus, po to buvo paimtas kraujas ir paimtas žiurkių derlius.inkstus. Klinikinis veiksmingumas buvo stebimas, o 24-h šlapimo baltymų, plazmos albumino, kreatinino (Scr) ir kraujo šlapimo azoto (BUN) koncentracijų pokyčiai buvo išmatuoti naudojant komercinius diagnostikos rinkinius su automatizuotu chemijos analizatoriumi (HITACHI 7180). ).

Visos eksperimentinės procedūros, susijusios su gyvūnų naudojimu, buvo patvirtintos TCM Džedziango instituto (Tianmushan Road Nr. 132) Eksperimentų su gyvūnais etikos komiteto ir buvo griežtai atliekamos pagal principus, išdėstytus NIH laboratorinių gyvūnų priežiūros ir naudojimo vadove. .

Histologinis dažymas, elektroninė mikroskopija ir analizė

Žiurkėinkstusbuvo fiksuoti paraformaldehidu, dehidratuoti naudojant rūšiuotą etanolio seriją ir įterpti į parafiną. Pjūviai (5- μm storio) buvo nudažyti hematoksilinu ir eozinu (H&E) bei Massono trichromu ir tiriami optiniu mikroskopu. Inkstai buvo perfuzuoti ir fiksuoti glutaraldehidu, o tada supjaustyti į 1-mm3 audinio blokus, kad būtų galima įterpti epoksidinę dervą. Elektroninė mikroskopija buvo atlikta naudojant standartines procedūras. Iš kiekvieno mėginio atsitiktinai buvo paimti penki ultramikrografai. Podocitų pėdos procesų susiliejimo greitis (PFR) buvo apskaičiuotas pagal šią formulę: PFR (procentais )=∑LFP / ∑LBM × 100 procentų , kur ∑LFP yra bendras susiliejusios pėdos proceso ilgis, o ∑LBM yra bendras periferinių kapiliarų bazinės membranos ilgis (BM).

Statistinė analizė

Duomenys išreiškiami kaip vidutinė ± standartinė matavimo paklaida ir analizuojami naudojant SPSS 20.0 (IBM Statistics SPSS, JAV) ir GraphPad Prism 6, skirtą Windows (GraphPad Software Inc., JAV). Normalus pasiskirstymas buvo įvertintas qq diagramomis ir SW testu. Duomenys parodė normalų pasiskirstymą. Palyginus dvi duomenų grupes, taikytas nepriklausomų imčių t testas. Trijų ar daugiau nepriklausomų grupių skirtumai buvo lyginami naudojant vienpusę dispersijos analizę, po kurios buvo atliktas Tukey post hoc testas. Statistinis reikšmingumas nustatytas p<>

Rezultatai

Optimalios tetrandrino, CsA ir U73122 koncentracijos ir citotoksiškumo pasirinkimas

CCK{{0}} tyrimas buvo naudojamas ląstelių gyvybingumui nustatyti. Kaip parodyta 1a ir b pav., didžiausia 10 μmol/L tetrandrino ir 0,1 μmol/L CsA koncentracija neturėjo įtakos MPC5 podocitų gyvybingumui. LDH išsiskyrimo tyrimas taip pat patvirtino, kad 10 μmol/L tetrandrino ir 0,1 μmol/L CsA 48 valandas neparodė toksiškumo, o 10 μmol/LU73122 10 minučių parodė numatomą toksiškumą (1c pav.). Todėl vėlesniuose ląstelių eksperimentuose buvo naudojamas tetrandrinas ir CsA atitinkamai 10 μmol / L ir 0, 1 μmol / L.

Tetrandrinas sumažino intracelulinį Ca2 ir infuziją kultivuojamose MPC5 ląstelėse, kurios per daug ekspresuoja TRPC6

Naudojant plazmidės transfekciją, buvo sėkmingai sukurtas TRPC6 per didelės ekspresijos ląstelių modelis MPC5 podocituose. qRT-PCR ir Western blot analizė parodė, kad TRPC6 ekspresijos lygiai Over-TRP grupėje žymiai padidėjo, palyginti su NC ir Lv-NC grupėse (p<0.05; fig.="" 2a="" and="" b).="" and="" full-length="" gel="" and="" blot="" of="" trpc6="" were="" included="" in="" supplementary="" fig.="">

Fluorescencinis vaizdas (2c pav.) ir pusiau kiekybinė analizė (2d pav.) parodė, kad per didelė TRPC6 ekspresija padidino intracelulinį Ca2 ir antplūdį, o tarp NC ir Lv-NC grupių akivaizdžių skirtumų nebuvo. Tada dešimt OverTRP grupės ląstelių buvo apdorotos eksperimentiniais vaistais. Išankstinio gydymo vaistais grupės (tetrandrinas, CsA ir U73122) turėjo slopinamąjį poveikį intraceluliniam Ca2 ir antplūdžiui (P<0.05), while="" there="" was="" no="" statistically="" significant="" difference="" among="" the="" three="" groups="" of="">

Tetrandrino poveikis kalpaino-1, kalcineurino, talin-1 ir nefrino aktyvumui ir ekspresijai MPC5 ląstelėse

Įrodyta, kad intracelulinis Ca2 plius aktyvuoja kalpainą, nuo Ca2 plius priklausomą cisteino proteazę, ir kalcineuriną, nuo Ca2 plius / kalmodulino priklausomą baltymų fosfatazę. Remiantis ankstesniais stebėjimais, kalpaino ir kalcineurino aktyvumas ir ekspresijos lygiai Over TRP grupėje buvo didesni nei NC ir Lv-NC grupėse (p.<0.05; fig.="" 3a-e,="" h="" and="" i).="" drop="" intervention="" in="" cultured="" trpc6-overexpressing="" podocytes="" established="" that="" tetrandrine="" inhibited="" calpain="" activity="" and="" calpain-1="" expression.="" te="" calpain="" activity="" and="" calpain-1="" mrna="" levels="" were="" significantly="" reduced="" in="" the="" tetrandrine-exposed="" group="" than="" in="" the="" csa="" intervention="" group=""><0.05; fig.="" 3a="" and="" d).="" western="" blotting="" results="" demonstrated="" a="" considerable="" decrease="" in="" calpain-1="" protein="" levels="" because="" of="" tetrandrine=""><0.05; fig.="" 3c="" and="" h).="" in="" addition,="" calcineurin="" activity="" was="" significantly="" reduced=""><0.05; fig.="" 3b)="" after="" tetrandrine="" exposure,="" but="" the="" mrna="" and="" protein="" expression="" levels="" of="" calcineurin="" remain="" unchanged="" (fig.="" 3e="" and="" i).="" treatment="" with="" csa="" did="" not="" block="" calpain="" activation="" (fig.="" 3a),="" and="" the="" effect="" was="" not="" as="" robust="" as="" that="" of="" tetrandrine="" in="" calpain-1="" mrna="" expression=""><0.05; fig.="" 3d).="" in="" addition,="" the="" inhibiting="" effect="" on="" the="" activity="" and="" expression="" of="" calcineurin="" was="" more="" obvious="" in="" the="" csa-treated="" group="" than="" in="" the="" tetrandrine-treated="" group=""><0.05; fig.="" 3b,="" e="" and="">

The podocyte cytoskeleton-associated anchoring protein Talin-1 and the slit diaphragm protein nephrin are two specific targets of calpain-1. When treated with tetrandrine, there was an increasing trend in mRNA and protein expression of Talin-1 (p >0.05) ir nefrinas (p<0.05), compared="" with="" that="" in="" the="" overtrp="" group,="" but="" this="" finding="" was="" not="" statistically="" significant="" among="" the="" three="" treatment="" groups="" (p="">0.05; 3f, g, j ir k pav.).

Viso ilgio geliai ir blotai buvo įtraukti į papildomą S1 pav.

Eksperimentai in vivo naudojant ADRN žiurkės modelį Siekiant apibūdinti atsaką į tetrandrino sukeltą TRPC6/kalpaino -1 signalizacijos slopinimą in vivo, buvo sukurtas ADRN modelis su žiurkėmis. TRPC6 mRNR ir baltymų ekspresijos profiliai buvo reikšmingai padidėję ADRN grupėje, palyginti su normaliai šeriamų žiurkių (NC grupė; p.<0.05; fig.="" 4a="" and="" b).="" consistent="" with="" the="" above="" studies="" in="" cell-based="" models,="" the="" activity="" and="" expression="" levels="" of="" calpain="" and="" calcineurin="" increased="" remarkably="" in="" the="" adrn="" group=""><0.05; fig.="" 4c-g,="" j,="" and="" k)="" than="" in="" the="" nc="">

Gydymas CsA neužblokavo kalpaino aktyvacijos, kurią sukelia TRPC6 perteklinė ekspresija (4c pav.), o poveikis buvo ne toks stiprus kaip tetrandrino poveikis cal skausmo-1 baltymų ekspresijai (p.<0.05; fig.="" 4j).="" in="" addition,="" the="" inhibiting="" effect="" on="" the="" activity="" and="" expression="" of="" calcineurin="" was="" more="" obvious="" in="" the="" csa-treated="" group="" than="" in="" the="" tetrandrine-treated="" group=""><0.05; fig.="" 4d,="" g,="" and="" k).="" the="" tetrandrine="" group="" was="" down="" compared="" to="" the="" adr="" group="" (fig.="">

Gydymas CsA neužblokavo kalpaino aktyvacijos, kurią sukelia TRPC6 per didelė ekspresija (4c pav.), o poveikis kalpaino -1 baltymo ekspresijai nebuvo toks stiprus kaip tetrandrino (p.<0.05; fig.="" 4j).="" in="" addition,="" the="" inhibiting="" effect="" on="" the="" activity="" and="" expression="" of="" calcineurin="" was="" more="" obvious="" in="" the="" csa-treated="" group="" than="" in="" the="" tetrandrine-treated="" group=""><0.05; fig.="" 4d,="" g,="" and="">

Be to, buvo įvertinta Talino -1 ir nefrino ekspresija (4h, i, l ir m pav.). Tiek Talino-1, tiek nefrino kiekis ADRN žiurkėms buvo sumažėjęs, palyginti su NC grupe (p.<0.05). upon="" treatment="" with="" tetrandrine,="" the="" mrna="" levels="" and="" protein="" expression="" of="" talin-1="" and="" nephrin="" were="" visibly="" increased.="" the="" high-dose="" group="" of="" tetrandrine="" recovered="" the="" expression="" of="" the="" two="" structural="" components,="" similar="" to="" the="" adr+csa="" group="" (p="">0.05).

Viso ilgio geliai ir blotai buvo įtraukti į papildomą S2 pav.

Tetrandrinas slopino ADRN progresavimą ir išgelbėjo histopatologiją. Tetrandrino poveikisinkstasVėliau buvo įvertinta ADRN gydytų Sprague-Dawley žiurkių funkcija (5a-d pav.). Iš pradžių reikšmingų 24-h proteinurijos, Scr ir BUN lygių skirtumų grupėse nebuvo. Po dvylikos savaičių 24 valandų proteinurijos, Scr ir BUN lygiai ADRN grupėje statistiškai padidėjo, o plazmos albumino kiekis buvo žymiai sumažintas, palyginti su NC grupėje (P<0.05). after="" treatment="" with="" tetrandrine,="" the="" levels="" of="" proteinuria,="" scr,="" and="" bun="" were="" markedly="" decreased,="" whereas="" the="" level="" of="" albumin="" was="" significantly="" improved="" compared="" to="" those="" in="" the="" adr="" group=""><0.05). among="" the="" three="" dose-response="" subgroups="" of="" tetrandrine,="" a="" significant="" difference="" was="" observed:="" the="" middle="" dose="" demonstrated="" considerably="" better="" efficacy="" than="" the="" other="" two="" doses=""><0.05). there="" was="" no="" significant="" difference="" in="" the="" levels="" of="" serum="" alanine="" aminotransferase,="" before="" and="" after="" treatment="" among="" groups="" (p="">0.05; duomenys nerodomi).

Histomorfologijos pokyčiai parodyti 6 pav. ADRN žiurkėms H&E ir Masson dažymas parodė FSGS, tubulointersticinę fibrozę ir inkstų intersticinių uždegiminių ląstelių infiltraciją. Be to, glomerulų elektroninės mikroskopijos vaizdavimas atskleidė labai ištrintus, nutukusius ir susiliejusius podocitų pėdų procesus su 80–100 procentų podocitų PFR. Tetrandrino pogrupių žiurkėms (vidutinės dozės ir didelės dozės grupės) buvo pastebėta mažiau pažeidimų nei ADR grupėje įvairiais mastais, o pagerėjimas didelės dozės grupėje buvo geresnis nei vidutinės dozės grupėje. Mažos, vidutinės ir didelės tetrandrino dozės grupėse podocitų PFR buvo atitinkamai 70–80 procentų, 50–60 procentų ir 30–40 procentų. Šie duomenys rodo, kad tetrandrinas apsaugojo nuo struktūrinių inkstų glomerulų pažeidimo, kurį sukelia ADR vartojimas. Šviesos mikroskopu tarp grupių (didelių dozių tetrandrino, CsA ir tetrandrino kartu su CsA) reikšmingų patologinių pokyčių skirtumų nebuvo. Be to, podocitų PFR CsA gydytoje ADRN grupėje buvo toks pat, kaip ir didelėmis tetrandrinu gydytų grupių dozėmis.

Diskusija

Podocitai tampa vis svarbesni kaip intervencijos į FSGS ir susijusių nefrozinių ligų tikslas [20, 21]. Čia, remiantis in vitro ir in vivo duomenimis, taip buvo

parodė, kad tetrandrino, neselektyvaus Ca2 ir kanalų blokatoriaus, apsauga nuo podocitų ir antiproteinurinis poveikis buvo susijęs su intracelulinio Ca2 plius antplūdžio ir nuo Ca2 plius priklausomo kalpaino{5}} signalų perdavimo kaskados, įskaitant Talin-1 slopinimą. , nefrinas ir kalcineurinas. Tetrandrinas buvo veiksmingesnis nei slopino kalpaino{7}} slopinimą.

Remiantis ankstesniais duomenimis, podocitas TRPC6 yra kanalas, kuris daugiausia prisideda prie Ca2 ir antplūdžio pokyčių normaliomis ir patologinėmis sąlygomis [7, 22]. Plačiai žinoma, kad kalpaino aktyvumas priklauso nuo kalcio kiekio ir yra susijęs suinkstassužalojimas, ypač inkstų antiglomerulinis BM pažeidimas [10, 23]. Tarp 15 nustatytų kalpaino izoformų neseniai buvo įrodyta, kad kalpainas -1 sieja TRPC6 aktyvumą su podocitų pažeidimu [24]. Pranešama, kad kalpainas-1 skaldo su podocitų citoskeletu susijusį inkarinį baltymą Talin-1 ir plyšinį diafragmos baltymą nefriną, kuris sutrikdo podocitų vientisumą ir sukelia sunkią proteinuriją [8–12, 16]. Kalcineurinas yra nuo Ca2 plius priklausoma fosfatazė, kuri anksčiau buvo įrodyta, kad ji vaidina vaidmenį podocituose irinkstasfunkcija. Vis daugiau įrodymų rodo, kad kalpainas gali skaidyti ir aktyvuoti kalcineuriną proteolitiniu būdu [25, 26]. Šiame tyrime buvo sukurti TRPC6 per didelės ekspresijos modeliai, naudojant virusinę infekciją auginamuose podocituose ir adriamicino injekciją SD žiurkėms. Atitinkamai parodėme, kad TRPC6-tarpininkaujantis Ca2 plius antplūdis suaktyvino kalpaino aktyvumą ir kalpaino šeimos nario kalpaino-1 išraišką. Padidėjęs kalpainas-1 vėliau suskaldė pasroviui Taliną-1 ir nefriną.

Tetrandrinas yra alkaloidas, išgautas iš tradicinio Kinijos vaistinio augalo ir yra neselektyvus Ca2 ir kanalų blokatorius. Čia buvo dar kartą patvirtinta, kad tetrandrinas slopino TRPC6 per didelę ekspresiją ir sumažino Ca2 plius antplūdį tiek ląstelėse, tiek žiurkėse, per daug ekspresuojančiose TRPC6, kaip buvo dokumentuota anksčiau [16]. Dar svarbiau, kad šiame tyrime pagrindinis dėmesys skiriamas tarpiniam tetrandrino poveikiui nuo kalcio priklausomam signalizacijos keliui. Pastebėta, kad, skirtingai nei CsA, tetrandrinas sumažino kalcio aktyvintos neutralios proteazės (kalpaino) aktyvumą. Be to, tetrandrinas sumažino kalcio aktyvintų proteazių šeimos kalpaino -1 ekspresiją ir atkūrė sumažintą Talino-1 ir nefrino ekspresiją. Palyginti su CsA, tetrandrino vartojimas turėjo puikų poveikį kalpaino inaktyvacijai ir sumažino kalpaino ekspresiją-1. Šie rezultatai parodė, kad tetrandrinas turi terapinį podocitų pažeidimo potencialą, nes blokuoja nuo TRPC{12}}priklausomą kalpaino-1 signalizacijos kelio aktyvavimą.

Nustatyta, kad fosfolipazė C (PLC) yra TRPC{0}}surišimo partnerė [27]. U73122 slopina PLC, todėl susidaro mažiau diacilglicerolio ir sumažėja TRPC6 kanalo anga [18, 24]. Taigi U73122 buvo naudojamas lygiagrečiai kaip teigiama kontrolė, ir jis parodė pastebimą poveikį mažinant intracelulinį Ca2 ir antplūdį, slopinant kalpaino aktyvumą ir kalpaino -1 ekspresiją podocituose, kurie per daug ekspresuoja TRPC6. Tačiau in vitro citotoksiškumo tyrimai parodė akivaizdų toksiškumą podocitams.

Šiame tyrime po 12 savaičių ADR injekcijos, ADR{1}}gydytoms žiurkėms pasireiškė rimta proteinurija, hipoalbuminemija ir padidėjęs BUN bei Scr kiekis. Šviesos mikroskopija atskleidė ADRN žiurkėms FSGS, tubulointersticinę fibrozę ir inkstų intersticinių uždegiminių ląstelių infiltraciją. Elektroninė mikroskopija parodė plačiai paplitusią pėdos procesų išnykimą. In vivo duomenys taip pat parodė, kad gydymas tetrandrinu gali sumažinti proteinuriją, pagerinti inkstų funkciją ir susilpninti glomerulosklerozės progresavimą. Po gydymo tetrandrinu, patologiniai pokyčiai šviesos mikroskopu ir elektroniniu mikroskopu, 24-h proteinurija, plazmos albuminas, Scr ir BUN ADRN žiurkėms buvo žymiai pagerėję, palyginti su NC grupe.

Kalcineurino inhibitorius CsA jau seniai buvo naudojamas proteinurijos gydymuiinkstasligos [28]. Kalcineurinas yra kliniškai svarbus kaip tiesioginis imunosupresinio vaisto CsA taikinys [17, 29]. CSA sumažina kalcineurino ekspresiją ir sumažina kalcineurino sukeltą aktyvuotų T ląstelių branduolinį faktorių [30–32]. Naujausi įrodymai patvirtina stabilizuojantį CsA poveikį podocitų aktino citoskeletui, pavyzdžiui, sinaptopodinui, blokuojant kalcineurino sukeltą sinaptopodino defosforilinimą [17]. Taip pat buvo įrodyta, kad kalpainas gali skaidyti ir aktyvuoti kalcineuriną proteolitiniu būdu [25, 26]. Šio tyrimo duomenys dar kartą patvirtino, kad CsA slopina kalcineurino aktyvumą ir ekspresiją stipriau nei tetrandrinas. Kaip buvo pranešta anksčiau, neatrodo, kad CsA tiesiogiai veikia kalpaino aktyvumą.

Pagrindinis tyrimo apribojimas buvo tai, kad nepavyko įrodyti nuo dozės priklausomo poveikio tarp tetrandrino pogrupių (mažos dozės, vidutinės dozės ir didelės dozės grupės). Vienas iš galimų paaiškinimų galėtų būti tas, kad žiurkėms naudotas dozių diapazonas buvo per didelis. Be to, individualūs skirtumai atliekant eksperimentą su gyvūnais gali būti daug didesni už dozių skirtumus. Palyginti mažas imties dydis gali sumažinti statistinę galią. Todėl reikia atlikti tolesnius tyrimus, įskaitant žymiai mažesnes dozes ir atitinkamą mėginio dydį, kad būtų galima nustatyti tikslią tetrandrino dozių diapazoną ir poveikį ARDN žiurkėms.

Apibendrinant galima pasakyti, kad reguliuojant kalcio signalizacijos kelius, tetrandrinas akivaizdžiai slopino kalpainą-1, o CsA tiesiogiai paveikė kalcineurino slopinimą. Šie rezultatai rodo, kad kombinuotas gydymas tetrandrinu ir CsA gali paveikti kelis kalcio signalizacijos tinklo taikinius, kad pagerintų klinikinius rezultatus. Norint patvirtinti šiuos stebėjimus ir išsiaiškinti sinergetinio poveikio mechanizmus, reikia atlikti patvirtinamuosius tyrimus.

Santrumpos

FSGS: židininė segmentinė glomerulinė sklerozė; MCD: minimalių pokyčių liga; MN: membraninė nefropatija; DKD: Diabetasinkstasliga; TRPC6: trumpalaikio receptorių potencialo katijonų kanalo baltymas 6; Ca2 plius: kalcis; TCM: klasikinė tradicinė kinų medicina; Tet: Tetrandrinas; CsA: ciklosporinas A; Scr: serumo kreatininas; BUN: Kraujo šlapimo azotas; PFR: apdoroja sintezės greitį; BM: rūsio membrana; ADRN: Adriamicino sukelta nefropatija; PLC: fosfolipazė C.

Nurodykitences

1. Garg P. Podocitų biologijos apžvalga. Am J Nephrol. 2018;47 (1 priedas): 3–13.

2. Khalilpourfarshbaf M, Hajiaghaalipour F, Selvarajan KK ir kt. Mezenchiminių kamieninių ląstelių terapija nuo podocitų pažeidimo sergant diabetine nefropatija. Audinių Eng Regen Med. 2017;14:201–10.

3. Nagata M. Podocitų pažeidimas ir jo pasekmės. Kidney Int. 2016;89:1221–30.

4. Pavenstädt H, Kriz W, Kretzler M. Cell biology of the glomerulus podocyte. Physiol Rev. 2003;83:253–307.

5. Riehle M, Büscher AK, Gohlke BO ir kt. TRPC6 G757D funkcijos praradimo mutacija yra susijusi su FSGS. J Am Soc Nephrol. 2016;27:2771–83.

6. Ilatovskaya DV, Blass G, Palygin O ir kt. NOX4 / TRPC6 kelias podocitų kalcio reguliavime ir inkstų pažeidimas sergant diabetine inkstų liga. J Am Soc Nephrol. 2018;29:1917–27.

7. Reiser J, Polu KR, Möller CC ir kt. TRPC6 yra su glomerulų plyšiu susijęs su diafragma susijęs kanalas, reikalingas normaliai inkstų funkcijai. Natas Genetas. 2005;37:739–44.

8. Huang H, You Y, Lin X ir kt. TRPC6 signalo kelio slopinimas palengvina podocitų sužalojimą, kurį sukelia TGF- 1. Cell Physiol Biochem. 2017;41:163–72.

9. Verheijden KAT, Sonneveld R, Bakker-van Bebber M ir kt. Nuo kalcio priklausoma proteazė Calpain-1 susieja TRPC6 aktyvumą su podocitų pažeidimu. J Am Soc Nephrol. 2018;29:2099–109.

10. Peltier J, Bellocq A, Perez J ir kt. Kalpaino aktyvinimas ir sekrecija skatina glomerulų pažeidimą eksperimentinio glomerulonefrito metu: kalpastatino transgeninių pelių įrodymai. J Am Soc Nephrol. 2006;17:3415–23.

11. Tian X, Kim JJ, Monkley SM ir kt. Su podocitais susijęs talinas1 yra labai svarbus palaikant glomerulų filtracijos barjerą. J Clin tyrimas. 2014;124:1098–113.

12. Jiang L, Ding J, Tsai H ir kt. Pernelyg didelis laikinojo receptorių potencialo katijono kanalo 6 podocituose ekspresija sukelia citoskeleto persitvarkymą padidindamas intracelulinį Ca2 plius ir RhoA aktyvavimą. Exp Biol Med (Maywood). 2011;236:184–93.

13. Liu X, Zhou QG, Zhu XC ir kt. Atranka dėl galimų aktyvių Fangji Huangqi tang komponentų gydant nefrozinį sindromą naudojant integruotą metabolomiką, pagrįstą „cheminių ir metabolinių profilių koreliacijomis“. Front Pharmacol. 2019; 10:1261.

14. Liu KC, Lin YJ, Hsiao YT ir kt. Tetrandrinas sukelia apoptozę žmogaus nosiaryklės karcinomos NPC-TW 039 ląstelėse dėl endoplazminio tinklo streso ir Ca2 plius / Calpain keliai. Anticancer Res. 2017;37:6107–18.

15. Wang YJ, He LQ, Sun W ir kt. Optimizuotas tradicinės kinų medicinos projektas gydant lėtinę inkstų ligą 3 stadijoje: daugiacentris dvigubai aklas atsitiktinių imčių kontroliuojamas tyrimas. J Etnopharmacol. 2012;139:757–64.

16. Yu J, Zhu C, Yin J ir kt. Tetrandrinas slopina trumpalaikį receptorių potencialą Katijono kanalo baltymo 6 per didelės ekspresijos sukeltą podocitų pažeidimą blokuodamas RhoA / ROCK1 signalizaciją. Vaistas Des Devel Ther. 2020;14:361–70.