Veiklioji Cistanche sudedamoji dalis: echinakozidas dėl priešuždegiminio slopinimo ir neuroprotekcinio poveikio

Kontaktas:joanna.jia@wecistanche.com

echinakozidas, an Aktyvus Sudedamosios dalys apie Cistanche Herba, Pratimai a Neuroprotekcinis Efektas in a Kainic Rūgštis Žiurkė Modelis pateikė SlopinantisUždegiminis Procesai ir Aktyvinama į Akt/GSK3 Kelias

Cheng Wei Lu,a,b Hsi Lung Hsieh,c,d Tzu Yu Lin,a,b Ting Yang Hsieh,e Shu Kuei Huang,a ir Su Jane Wang^*,f,g

Echinakozidasyra pagrindinis Cistanche Herb junginys ir turi glutamato išsiskyrimą slopinantį aktyvumą smegenyse. Atsižvelgdami į eksitotoksiškumo, kurį sukelia masinis glutamatas, dalyvavimą epilepsijos patofiziologijoje, ištyrėme echinakozido antiepilepsinį poveikį žiurkių kaino rūgšties sukeltiems priepuoliams. Žiurkės buvo švirkščiamos į pilvaplėvės ertmęechinakozidas30 minučių prieš intraperitoninę kaino rūgšties injekciją. Rezultatai parodė, kad kaino rūgšties sukeltas į traukulius panašus elgesio modeliai, padidino glutamato koncentraciją, sukėlė neuronų praradimą ir mikroglijų aktyvaciją bei stimuliavo priešuždegiminį citokinų genų ekspresiją hipokampe. Nustatyta, kad šiuos kaino rūgšties sukeltus pakitimus susilpninoechinakozidasišankstinis apdorojimas. Be to, sumažėjęs Akt ir glikogeno sintazės kinazės 3 (GSK3) fosforilinimas, taip pat Bcl-2 ekspresija hipokampe, buvo pakeista pirminiu apdorojimu echinakozidu. Šie rezultatai rodo, kad echinakozidas daro priešepilepsinį ir neuroprotekcinį poveikį kaino rūgšties žiurkės modelyje slopindamas uždegiminį atsaką ir aktyvuodamas Akt / GSK3 signalizaciją. Todėl šis tyrimas rodo, kad echinakozidas gali būti naudingas epilepsijos profilaktikai.

Raktiniai žodžiai:echinakozidas; kaino rūgštis; epilepsija; neuroprotekcinis poveikis; hipokampas

Echinakozidas cistanche

Epilepsija yra visame pasaulyje paplitęs smegenų sutrikimas. Ja serga daugiau nei 65 milijonai žmonių, beveik 1 procentas pasaulio gyventojų.1) Sintetiniai vaistai nuo epilepsijos yra plačiai prieinami farmacijos rinkoje; tačiau šie vaistai yra veiksmingi tik 60–70 procentų pacientų ir turi neigiamą šalutinį poveikį.2–4) Taigi yra nepatenkintas poreikis ieškoti veiksmingesnio ir saugesnio vaisto. Vaistiniai augalai yra galimas tokių junginių šaltinis.^5,6)

Tradicinėje kinų vaistažolių medicinoje Cistanche Herba nuo seno buvo naudojama epilepsijai gydyti.7,8)Echinakozidasyra pagrindinis Cistanche Herba9 komponentas ir turi daug farmakologinių savybių, tokių kaip antioksidacinis, priešuždegiminis, antineoplastinis, hepatoprotekcinis ir imuninę sistemą moduliuojantis aktyvumas.10,11) Be to, buvo pranešta, kadechinakozidasgali patekti į smegenis ir sukelti neuroprotekciją.12–16) Anksčiau įrodėme, kad echinakozidas sumažina glutamato išsiskyrimą žiurkių smegenų žievės nervų galuose.17) Kadangi glutamatas yra pagrindinis sužadinantis neurotransmiteris žinduolių smegenyse ir atlieka lemiamą vaidmenį epilepsijos patofiziologijoje, 18, 19) pasiūlėme, kad echinakozidas turi antiepilepsinį poveikį. Norint išsiaiškinti šią hipotezę, šiame tyrime buvo naudojamas kaino rūgšties žiurkės modelis.

Kaino rūgštis yra glutamato darinys ir vienkartinė sisteminė jos injekcija graužikams sukelia traukulius, neuronų uždegimą ir neuronų degeneraciją arba žūtį selektyvioje smegenų neuronų populiacijoje.20–22) Šie patologiniai pokyčiai yra panašūs į žmogaus smilkininės skilties epilepsiją.23 ,24) Paprastai manoma, kad kaino rūgšties skyrimas graužikams sukelia tinkamą epilepsijos modelį. Iki šiol jokiame tyrime nebuvo ištirtos antiepilepsinės ir neuroprotekcinės savybėsechinakozidaskaino rūgšties sušvirkštame gyvūnų modelyje. Todėl mūsų tyrimo tikslas yra įvertinti poveikį ir galimą jo mechanizmąechinakozidasKaino rūgštimi gydytoms žiurkėms.

MEDŽIAGOS IR METODAI

Gyvūnai ir priepuolių veikla

Viso tyrimo metu buvo naudojami Sprague-Dawley žiurkių patinai (BioLASCO, Taipėjus, Taivanas), sveriantys 150–200 g. Žiurkės buvo atsitiktinai suskirstytos į keturias grupes taip: i) 1 grupė: dimetilsulfoksidu apdorota grupė (kontrolė); ii) 2 grupė: kaino rūgštimi apdorota grupė; iii) 3 grupė:echinakozidas10 mg/kg plius kaino rūgšties grupė; iv) 4 grupė:echinakozidas50 mg/kg plius kaino rūgšties grupė. Echinakozidas (ChemFaces, Uhanas, KLR) buvo švirkščiamas (intraperitoniniu būdu) 30 minučių prieš kaino rūgšties (15 mg / kg) intraperitoninę injekciją. Priepuolių aktyvumas buvo įvertintas per 4 valandas po kaino rūgšties injekcijos pagal Racine skalę.25) Dozė ir vartojimo grafikas buvo parinkti remiantis ankstesniais tyrimais.22,26,27) Eksperimentus su gyvūnais patvirtino Institucija. Gyvūnų priežiūros ir naudojimo komitetas Fu Jen katalikų universitete ir buvo atliktas pagal išduotus protokolus, kurie vadovaujasi Nacionalinio sveikatos instituto laboratorijos priežiūros ir naudojimo vadovu (NAC 2011).

Glutamato lygio nustatymas

Praėjus keturioms valandoms po gydymo kaino rūgštimi, žiurkės buvo nužudytos nukirtus galvą. Visos smegenys buvo išpjaustytos ir kiekvienos žiurkės hipokampas buvo surinktas analizei. Glutamato koncentracija smegenų hipokampo audinyje buvo nustatyta ankstesniuose tyrimuose aprašytais metodais.28,29)

Neutrali raudona ir fluoro-Jade B dažymas

Praėjus trims dienoms po kaino rūgšties injekcijos, žiurkės buvo anestezuojamos naudojant chloro hidratą (65{2}} mg/kg) ir perfuzuojamos transkardialiniu būdu fiksuojančiu tirpalu, kuriame yra 4 procentai paraformaldehido 0,1 M fosfato buferiniame tirpale (PBS, pH 7,4). Smegenys buvo pašalintos iš karto po perfuzijos ir laikomos 4 procentų paraformaldehido tirpale per naktį 4 laipsnių temperatūroje. Po fiksacijos smegenys buvo panardintos į 30 procentų sacharozės 4 laipsnių temperatūroje 24 valandas. Mėginiai buvo greitai užšaldyti, o 30-µm storio pjūviai nupjauti naudojant šaldytą mikrotomą. Laisvai plūduriuojančios sekcijos buvo nudažytos neutralia raudona spalva (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, JAV) ir Fluoro-Jade B (Millipore, CA, JAV). Fluoro-Jade B teigiamos ląstelės hipokampo CA3 srityje buvo nustatytos, kaip aprašyta anksčiau.^30,31)

Imunohistochemija

Pjūviai buvo plaunami {{0}},1 M PBS ir blokuojami 0,5 procento normaliu ožkos serumu {{20}},1 M PBS 1 val. kambario temperatūroje. Pirminis antikūnas (pelės monokloninis anti-OX-42 antikūnas, 1:1000; AbD Serotec, Oksfordas, JK) buvo inkubuojamas dvi per naktį 4 laipsnių temperatūroje. Po pakartotinio plovimo PBS, pjūviai buvo inkubuojami su biotiniluotu anti-pelės imunoglobulinu G (IgG) (1: 200) 90 min., 1 valandą buvo apdoroti avidino-biotino komplekso (ABC) tirpalu (1: 1000) kambaryje. temperatūroje ir reagavo su 0,025 procento 3,3′-diaminobenzidino ir 0,0025 procento H2O2, kol buvo pasiektas norimas dėmės intensyvumas. Skyriai buvo montuojami ant skaidrių naudojant standartinius protokolus. Nudažytos skaidrės buvo ištirtos ir vaizduojamos mikroskopu (Olympus, Tokijas, Japonija).31) Mikroglijos ląstelės kūno ir proceso trukmės analizė atlikta naudojant ImageJ.³²)

Perdavimo elektronų mikroskopija Perdavimo elektronų mikroskopija

buvo atliktas kaip aprašyta anksčiau.33) Trumpai tariant, hipokampo CA3 sritis buvo pašalinta ir fiksuota buferyje, kuriame yra 4 procentai paraformaldehido ir 2,5 procento glutaraldehido 4 laipsnių temperatūroje 24–36 val. Po plovimo PBS, CA3 sritys 2 valandas buvo fiksuotos 1 procento osmio tetroksidu, dehidratuotos etanoliu ir įterptos į epoksidinę dervą. Itin plonos sekcijos (70 nm) buvo paruoštos naudojant ultramikrotomą (EM UC7, Leica Microsystems, Wetzlar, Vokietija). Pjūviai buvo nudažyti uranilo acetatu ir švino citratu ir stebimi transmisijos elektronų mikroskopu (modelis JEM-1400, JEOL Ltd., Tokijas, Japonija).

Kiekybinė realaus laiko PGR

RNR ekstrahavimas ir kiekybinė PGR realiuoju laiku buvo atlikti, kaip aprašyta anksčiau.34,35) Visa RNR buvo išskirta iš hipokampo naudojant mirVana™ miRNA izoliacijos rinkinį (Life Technologies, Grand Island, NY, JAV) pagal gamintojo protokolą. Genominė DNR buvo pašalinta inkubuojant su dezoksiribonukleaze (DNaze) I. cDNR buvo susintetinta (NoScript atvirkštinės transkripcijos sistemos rinkiniu; Promega, Madison, WI, JAV) ir panaudota SYBR Green (Roche Diagnostics, Manheimas, Vokietija) kiekybinei realiai. laiko PGR amplifikacija su specifiniais pradmenimis naudojant LightCycler 480 sistemą (Roche Diagnostics). Protokolą sudarė pradinis denatūravimo etapas 95 laipsnių temperatūroje 3 minutes, po to 45 denatūravimo ciklai 95 laipsnių temperatūroje 10 s, atkaitinimas 56 laipsnių temperatūroje 30 sekundžių. Kiekvieno tikslinio geno mRNR lygis buvo normalizuotas iki gliceraldehido -3-fosfatdehidrogenazės (GAPDH) mRNR. Sulenkimo indukcija buvo apskaičiuota naudojant 2-ΔΔCT metodą, kaip aprašyta ankstesniame tyrime.³⁴)

Imunoblotingas

Dvidešimt mikrogramų baltymų ekstraktų iš hipokampo buvo atskirti 10 procentų natrio dodecilsulfato-poliakrilamido gelio elektroforeze (SDS-PAGE), po to elektroforetiniu būdu perkeliant ant polivinilideno difluorido (PVDF) membranos. Membrana buvo užblokuota naudojant 5 procentų nugriebtą pieną 1 valandą kambario temperatūroje ir inkubuojama su atitinkamais antikūnais 1 procento nugriebtame piene per naktį 4 laipsnių temperatūroje, po to 1 valandą inkubuojama su antriniu antikūnu. Pirminiai antikūnai buvo triušių monokloniniai antikūnai, nukreipti prieš Akt (1: 2000), pAktSer473 (1: 2000), glikogeno sintazės kinazę 3 (GSK3) (1: 2000), pGSK3 Ser9 (1: 500), Bcl (-2). 1: 1000), ir -aktinas (1: 2000), gautas iš Cell Signaling Technology (MA, JAV). Antrinis peroksidaze konjuguotas ožkų antikūnas prieš triušius (1: 5000) buvo gautas iš Santa Cruz (CA, JAV). Juostos buvo vizualizuotos naudojant sustiprintą chemiliuminescenciją (Amersham, Buckinghamshire, JK), naudojant gelio vaizdavimo analizės sistemą. Kiekvienos juostos intensyvumas buvo matuojamas naudojant „Syngene“ programinę įrangą („Synoptics“, Kembridžas, JK).

Statistinė analizė

Duomenys pateikiami kaip vidurkis±standartinė vidurkio paklaida (SEM). Statistinė analizė buvo atlikta naudojant dvipusį Stjudento t-testą, kai buvo lyginamos dvi grupės, ir taikant vienpusę ANOVA su daugkartiniais Tukey palyginimais post hoc testais, kai buvo lyginamos daugiau nei dvi grupės. Analizė atlikta naudojant SPSS programinę įrangą (17 versija.0; SPSS Inc., Chicago, IL, JAV). p<0.05 was="" considered="" statistically="">

REZULTATAI

Echinakozido poveikis kaino rūgšties sukeltiems priepuoliams ir hipokampo glutamato kiekio padidėjimui

Įvertinti neuroprotekcinį poveikįechinakozidasprieš kaino rūgšties sukeltą eksitotoksiškumą, žiurkės buvo iš anksto apdorotosechinakozidas(5, 10 ir 50 mg/kg, švirkščiant į pilvaplėvės ertmę) 30 min. prieš kaino rūgšties (15 mg/kg) injekciją į pilvaplėvės ertmę. Kaiino rūgšties (15 mg/kg) injekcija į pilvaplėvės ertmę sukėlė traukulius, kurių latentinis laikas ir balai atitinkamai buvo 92,5±5,3 min ir 4,9±0,1 (1A, B pav.). Reikšmingas priepuolių delsos padidėjimas[F(2, 43)=40.2, p.<0.01; fig.="" 1a]="" and="" a="" significant="" decrease="" in="" seizure="" score="" [f(2,="" 40)="21.5,"><0.001; fig.="" 1b]="" were="" observed="" in="" echinacoside="" (10="" or="" 50="" mg/kg)-pretreated="" rats.="" however,="" echinacoside="" at="" 5="" mg/kg="" had="" no="" significant="" effect="" on="" seizure="" latency="" and="" score="" (p="">0.05; Fig. 1A, B). Atsižvelgiant į stiprų traukulių aktyvumo susilpnėjimą, kuris buvo pastebėtas vartojant 10 arba 50 mg/kg echinakozido, šios dvi echinakozido dozės buvo naudojamos vėlesniuose eksperimentuose, siekiant įvertinti mechanizmus, kuriais grindžiamas echinakozido gebėjimas slopinti kaino rūgšties sukeltus traukulius. 1C paveiksle parodyta, kad kaino rūgštimi gydytų žiurkių hipokampo glutamato koncentracijos padidėjimas buvo pastebėtas po 4 valandų, palyginti su dimetilsulfoksidu gydyta grupe (kontrolė; p<0.001). however,="" decreased="" hippocampal="" glutamate="" levels="" were="" obtained="" in="" the="" echinacoside="" group="" (10="" or="" 50="" mg/kg)="" [f(3,="" 16)="6.1,"><0.01; fig.="">

Echinakozido poveikis kaino rūgšties sukeltam neuronų pažeidimui hipokampo CA3 srityje

Neuronų pažeidimo laipsnis buvo įvertintas praėjus 3 dienoms po kaino rūgšties injekcijos per neutralią raudoną dažymą arba Fluoro-Jade B, kad būtų galima aptikti atitinkamai išlikusius ir degeneruojančius neuronus. Neutralus raudonas dažymas atskleidė akivaizdų neuronų praradimą CA3 žiurkėms, kurioms buvo sušvirkšta kaino rūgštis, palyginti su dimetilsulfoksidu gydytomis žiurkėmis (kontrolė; p.<0.001; figs.="" 2a,="" c).="" however,="">echinakozidasišankstinis gydymas (10 arba 50 mg/kg) veiksmingai sumažino kaino rūgšties sukeltą neuronų praradimą CA3 [F(2, 13)=11.6, p.<0.001; figs.="" 2a,="" c].="" similarly,="">echinakozidas- gydytiems gyvūnams po kaino rūgšties injekcijos sumažėjo Fluoro-Jade B FL fluorescencija hipokampo CA3 srityse (p<0.001), compared="" with="" the="" strong="" damage="" observed="" in="" kainic="" acid-injected="" rats="" [f(2,="" 24)="6.9,"><0.001; figs.="" 2b,="" d].="" in="" addition,="" transmission="" electron="" microscopy="" shows="" that="" neuronal="" injury="" in="" ca3="" was="" not="" obvious="" in="" the="" dimethylsulfoxide-treated="" (control)="" group.="" however,="" in="" the="" kainic="" acid-treated="" group,="" nerve="" cells="" had="" ultrastructural="" changes.="" nerve="" cells="" exhibited="" autophagosome="" formations,="" deformed="" nuclei="" with="" the="" condensed,="" and="" disruptive="" cell="" plasma="" membrane.="" in="" contrast,="" the="" neuronal="" injury="" in="" the="" echinacoside-pretreated="" group="" was="" apparently="" attenuated="" compared="" with="" the="" kainic="" acid-injected="" rats="" (fig.="">

Echinakozido poveikis kaino rūgšties sukeltai mikroglijų aktyvacijai ir uždegiminių ligų genų ekspresijai

Citokinai hipokampe Kaino rūgšties sukeltų traukulių ir hipokampo neuronų mirties modelyje hipokampe padidėja mikroglijų aktyvacija ir priešuždegiminių citokinų gamyba.36,37) Siekiant ištirti, arechinakozidaspaveikė uždegiminį atsaką kaino rūgšties sušvirkštų žiurkių hipokampe, mikroglijų aktyvacija buvo analizuojama naudojant anti-OX42 antikūną. Dimetilsulfoksidu gydytų žiurkių (kontrolinė grupė) mikroglijų ląstelių kūnai CA3 regionuose buvo maži, o jų procesai buvo ilgi ir ploni (4A pav.). Tačiau KA sušvirkštų žiurkių CA3 srityje aktyvuotų mikroglijų ląstelių skaičius žymiai padidėjo, mikroglijų ląstelių kūnai buvo padidėję (p<0.01; figs.="" 4a,="" b),="" and="" their="" cellular="" processes="" became="" shorter="" and="" thicker=""><0.001; figs.="" 4a,="" c).="" in="" the="" animals="" pretreated="" with="">echinakozidas(10 arba 50 mg/kg) iš anksto gydytų žiurkių aktyvuotų mikroglijų ląstelių skaičius žymiai sumažėjo, o mikroglijų ląstelių kūnai buvo ploni [F(2, 13)=6.2, p.<0.01; fig.="" 4b]="" and="" their="" cytoplasmic="" processes="" were="" ramified="" [f(2,="" 28)="47.5,"><0.001; fig.="" 4c].="" in="" addition,="" the="" expression="" levels="" of="" interleukin-1β,="" interleukin-6,="" and="" tumor="" necrosis="" factor-α="" mrna="" in="" the="" hippocampus="" were="" apparently="" elevated="" at="" 1="" d="" after="" kainic="" acid="" injection,="" compared="" to="" dimethylsulfoxideinjected="" animals="" (control)=""><0.001). however,="" decreased="" mrna="" levels="" for="" these="" pro-inflammatory="" cytokines="" were="" obtained="" in="" the="" echinacoside="" group="" [interleukin-1β,="" f(3,="" 18)="154.7,"><0.001; interleukin-6,="" f(3,="" 17)="17.9,"><0.001; tumor="" necrosis="" factor-α,="" f(3,="" 16)="31.1,"><0.001; figs.="">

Echinakozido poveikis kaino rūgšties sukeltam hipokampo fosfo-akt, fosfo-glikogeno sintazės kinazės 3 ir Bcl kiekio sumažėjimui-2

Hipokampe buvo ištirtas fosforilinto Akt (pAkt) (Ser473), fosforilinto GSK3 (pGSK3 ) (Ser9) ir Bcl-2 kiekis (6 pav.). Žymiai sumažėjo pAkt, pGSK-3 ir Bcl-2 ekspresija hipokampe kaino rūgštimi gydytoms žiurkėms po 4 valandų, palyginti su dimetilsulfoksidu gydytomis žiurkėmis (kontrolė) (p.<0.001). however,="" pretreatment="" with="">echinakozidas(10 arba 50 mg/kg) reikšmingai padidino pAkt, pGSK3 ir Bcl-2 kiekius, palyginti su gydymu vien kaino rūgštimi [pAkt, F(3, 19)=69.5, p.<0.001; pgsk3β,="" f(3,="" 17)="60.3,"><0.001; bcl-2,="" f(3,="" 18)="26.1,"><0.001; figs.="">

DISKUSIJA

Įrodymai parodė, kad glutamatas vaidina lemiamą vaidmenį epilepsijos patofiziologijoje.^17,18) Glutamaterginė epilepsijos hipotezė rodo, kad epileptogeninis procesas yra susijęs su padidėjusia glutamato koncentracija smegenyse ir šio neurotransmiterio koncentracijos sumažėjimas gali sukelti antiepilepsinį poveikį.^38–40) Mūsų laboratorijos tyrimas parodė taiechinakozidasgali sumažinti glutamato išsiskyrimą iš nervų galūnių ir pasiūlė, kad echinakozidas gali turėti antiepilepsinį poveikį.17) Šis pasiūlymas buvo patvirtintas dabartiniame tyrime, naudojant kaino rūgšties sušvirkštos žiurkės modelį. Kaino rūgštis, glutamato darinys, plačiai naudojama epilepsijai sukelti atliekant tyrimus su gyvūnais, nes jos neuropatologinės ir biocheminės savybės yra panašios į žmonių.^23,24)

Intraperitoninė kaino rūgšties injekcija žiurkėms sukelia traukulius ir neuronų pažeidimus, ypač hipokampo CA3 regionuose.^41–43) Be to, šie patologiniai kaino rūgšties pokyčiai yra susiję su didžiuliu glutamato išsiskyrimu.^41,44,45) Sutikdami su šiais duomenimis, pastebėjome, kad intraperitoninis kaino rūgšties (15 mg/kg) vartojimas sukėlė traukulių elgesį, padidino glutamato kiekį hipokampe ir sukėlė piramidinių ląstelių praradimą hipokampo CA3 srityje. Šie kaino rūgšties sukelti patologiniai pakitimai buvo susilpninti atliekant intraperitoninį išankstinį gydymąechinakozidas(10 arba 50 mg/kg). Be to, hipokampo CA3 nervų ląstelių pažeidimas, įvertintas ultrastruktūriniu kaitaliu su transmisijos elektronų mikroskopija, buvo sumažintasechinakozidaskaino rūgšties žiurkėse. Be to, po kaino rūgšties vartojimo CA3 ląstelėse buvo pastebėtas padidėjęs autofagosomų skaičius. Išankstinis apdorojimas echinakozidu slopino padidėjusį autofagosomų susidarymą. Ankstesni tyrimai parodė, kad autofagijos aktyvacija yra susijusi su kaino rūgšties sukelta neuronų mirtimi, o autofagijos proceso slopinimas atrodo neuroprotekcinis.^46,47) Nors mechanizmas, kuriuo grindžiamas antiepilepsinis poveikisechinakozidasReikia tolesnio tyrimo, echinakozido neuroprotekcinis poveikis kaino rūgšties gyvūnų modelyje galėjo atsirasti dėl antiepilepsinio aktyvumo slopinant glutamato eksitotoksiškumą ir autofagijos aktyvavimą.

Neurouždegimas labai prisideda prie uždelsto smegenų pažeidimo po ūmaus sužalojimo ir daro neigiamą poveikį neurologiniams rezultatams.²⁷) Uždegiminės reakcijos, tokios kaip mikroglijos aktyvacija ir uždegiminių citokinų gamyba, buvo aprašytos žmogaus epilepsijoje ir eksperimentiniuose epilepsijos modeliuose.^36,48) Be to, šių priešuždegiminių citokinų išsiskyrimas iš aktyvuotų mikroglijų ląstelių skatina kaino rūgšties sukeltą neuronų pažeidimą hipokampe.^36,37) Mes parodėme, kad nors kaino rūgštis padidino priešuždegiminių citokinų (interleukino-1, interleukino-6 ir naviko nekrozės faktoriaus) mikroglijų aktyvavimą ir genų ekspresiją hipokampe, šį poveikį slopinoechinakozidasišankstinis apdorojimas. Todėl siūlome taiechinakozidasslopindamas uždegiminius procesus, gali prisidėti prie jo antiepilepsinio ir neuroprotekcinio poveikio kaino rūgšties gyvūnų modelyje. Kaip jau buvo pastebėta mūsų ankstesniuose tyrimuose, kai kurie vaistai ir natūralūs produktai taip pat turi antiepilepsinį poveikį ir neuroprotekciją nuo kaino rūgšties sukeltų traukulių, nes jie turi priešuždegiminį poveikį.^31,33,35)

Yra žinoma, kad kaino rūgštis aktyvuoja daugybę baltymų kinazės signalizacijos kaskadų, kurios vaidina svarbų vaidmenį neuroprotekcijoje. Tarp tų, kurie, atrodo, ypač aktyviai dalyvauja, yra Akt.^49,50,) Akt tarpininkauja savo neuroprotekciniam poveikiui aktyvuodama įvairius substratus, įskaitant GSK-3 ir Bcl-2. Akt fosforilina GSK-3 ties Ser9, todėl jis inaktyvuojamas ir sustiprinamas neuronų ląstelių išgyvenimas51), nes aktyvi GSK-3 forma suaktyvina mitochondrijų mirties kelią.^52,53) Bcl-2 yra pagrindinis anti-apoptotinių Bcl-2 šeimos narys ir atlieka pagrindinį vaidmenį slopinant mitochondrijų sukeltą apoptozinę ląstelių mirtį. Pavyzdžiui, Bcl-2 gali apsaugoti mitochondrijų membranos vientisumą ir blokuoti citochromo C išsiskyrimą iš mitochondrijų, todėl ląstelės išgyvena ir slopinama apoptozė.⁵⁴) Taip pat buvo pranešta, kad pernelyg didelė Bcl{0}} ekspresija apsaugo neuronus nuo eksitotoksinių įžeidimų in vitro ir in vivo. 54,55) Šiame tyrime buvo pastebėtas sumažėjęs Akt (Ser473) ir GSK3 (Ser9) fosforilinimas, taip pat Bcl-2 ekspresija žiurkių hipokampe po kaino rūgšties poveikio, o tai atitinka ankstesnius tyrimus.^56,57) Be to, išankstinis apdorojimas echinakozidu išgelbėjo kaino rūgšties sukeltą pAkt ir pGSK3, taip pat Bcl -2 ekspresijos sumažėjimą. Taigi, neuroprotekcinis poveikisechinakozidaskaiino rūgšties gyvūnų modelyje gali būti iš dalies tarpininkaujama užkertant kelią Akt/GSK-3 /Bcl-2 kelio reguliavimui, taip padidinant neuronų išgyvenimą.

Echinakozidasyra potencialus naujas terapinis kandidatas. Tai yra, nesechinakozidasgali patekti į smegenis ir turi daug naudos.⁵⁸) Daugybė tyrimų tai įrodėechinakozidassumažina smegenų pažeidimą ir palengvina variklio ar atminties sutrikimą keliuose eksperimentiniuose modeliuose in vivo.^12,14,15,59) Nors mechanizmai, kuriais grindžiamas neuroprotekcinis poveikisechinakozidassmegenyse reikalingas išaiškinimas, slopinamas neurouždegimas, antioksidacija, deguonies laisvųjų radikalų pašalinimas ir padidėjusi neurogenezė.^14–16) Be šių galimų mechanizmų, mūsų ankstesnis¹⁷) ir dabartiniai rezultatai rodo, kad glutamato sukelto per didelio sužadinimo slopinimas gali iš dalies prisidėti prie neuroprotekcinio ir antiepilepsinio poveikio.echinakozidassmegenyse. Tai patvirtina faktas, kad kaino rūgšties sukeltas priepuolių aktyvumas, neurouždegimas ir smegenų pažeidimas yra susiję su pernelyg dideliu glutamato išsiskyrimu ir glutamato receptorių aktyvavimu.^44,45) Be to, buvo įrodyta, kad kai kurie kliniškai naudojami vaistai nuo epilepsijos susilpnina kaino rūgšties sukeltą traukulių aktyvumą60, 61) ir mažina glutamato išsiskyrimą žmogaus ir žiurkės smegenų audiniuose.^62,63) Šios išvados parodė, kad sumažėjęs glutamato kiekis yra svarbus farmakoterapiniam vaistų nuo epilepsijos poveikiui.

Apibendrinant, mūsų rezultatai tai rodoechinakozidas, slopindamas uždegiminius procesus, mažindamas glutamato sukeltą per didelį sužadinimą, taip pat didindamas Akt/GSK-3 aktyvaciją ir Bcl-2 ekspresiją, turi reikšmingą antiepilepsinį ir neuroprotekcinį poveikį žiurkėms, kurioms buvo sušvirkšta kaino rūgštis. Nors vaidmuoechinakozidasepilepsija sergančius pacientus reikia toliau vertinti, mūsų išvados rodo, kad tai gali būti vertingas epilepsijos gydymo metodas.

Padėkos

Autoriai norėtų padėkoti p. Yen-Sheng Wu iš Tzong Jwo Jang elektroninio mikroskopo laboratorijos, Fu Jen katalikiškojo universiteto Medicinos koledžo. Šį darbą parėmė Mokslo ir technologijų ministerija (MOST 103-2320-B-030-001 MY3).

Interesų konfliktas

Autoriai pareiškia, kad nėra interesų konflikto.