Dabartinė neuroprotekcijos būklė sergant įgimta širdies liga 2 dalis

Tada mikroskopiniai vaizdai buvo apskaičiuojami naudojant „ImageJ“ programinę įrangą (Nacionaliniai sveikatos institutai, Bethesda, MD, JAV). Hsp60 signalas buvo padaugintas iš "x".

Hsp60 yra svarbi baltymo molekulė, kuri atlieka svarbų biologinį vaidmenį žmogaus organizme. Pastarųjų metų tyrimai parodė, kad Hsp60 buvimas yra glaudžiai susijęs su žmogaus atmintimi.

Hsp60 yra molekulinis chaperono baltymas, kuris daugiausia dalyvauja baltymų lankstymo, išsiskleidimo, stabilizavimo ir skaidymo procese. Šie procesai yra labai svarbūs normaliai medžiagų apykaitai ir žmogaus organizmo ląstelių veiklai. Tuo pačiu metu Hsp60 taip pat turi antioksidacinį, priešuždegiminį ir imunomoduliacinį poveikį bei atlieka svarbų vaidmenį palaikant žmonių sveikatą ir imuninės sistemos pusiausvyrą.

Tyrimai parodė, kad Hsp60 vaidina lemiamą vaidmenį formuojant ir palaikant atmintį. Mokymosi ir atminties proceso metu smegenų ląstelės gamina daug Hsp60 molekulių. Šios molekulės gali apsaugoti ląsteles nuo išorinės aplinkos trukdžių ir žalos, kad būtų užtikrintas sklandus mokymosi ir atminties progresas. Be to, Hsp60 taip pat gali paveikti žmogaus mąstymą ir elgesį, pakeisdamas smegenų ląstelių signalo perdavimą ir neuronų vystymąsi, taip pat teigiamai veikia pažinimą ir atsparumą stresui.

Nors Hsp60 vaidmuo parodė teigiamą poveikį žmogaus organizmui, žmonės taip pat turi suprasti, kad tiek Hsp60 perteklius, tiek trūkumas gali turėti neigiamą poveikį žmonių sveikatai. Todėl turėtume aktyviai tyrinėti ir tirti Hsp60 mechanizmą įvairiomis fiziologinėmis ir patologinėmis žmogaus kūno sąlygomis, kad geriau suprastume Hsp60 padėtį ir vaidmenį žmogaus sveikatai. Matyti, kad turime gerinti atmintį, o Cistanche deserticola gali žymiai pagerinti atmintį, nes Cistanche deserticola turi antioksidacinį, priešuždegiminį ir senėjimą stabdantį poveikį, kuris gali padėti sumažinti oksidaciją ir uždegimines reakcijas smegenyse ir taip apsaugoti nervų sistemos sveikata. Be to, Cistanche deserticola taip pat gali skatinti nervų ląstelių augimą ir taisymą, taip pagerindama neuroninių tinklų ryšį ir funkciją. Šie poveikiai gali padėti pagerinti atmintį, mokymosi gebėjimus ir mąstymo greitį, taip pat gali užkirsti kelią pažinimo sutrikimų ir neurodegeneracinių ligų vystymuisi.

Spustelėkite Žinoti, kad pagerintumėte trumpalaikę atmintį

"x" reikšmė buvo nustatyta taip: atėmus "x" sulankstytą Hsp60 signalą iš mitochondrijų DNR signalo kontrolinėje grupėje, mitochondrijų DNR reikšmė buvo mažesnė arba lygi nuliui. Histono H2B signalas buvo padaugintas iš "y".

"Y" reikšmė buvo nustatyta taip: atėmus "y" sulankstytą histono-H2B signalą iš branduolio-DNR signalo kontrolinėje grupėje, branduolio-DNR reikšmė buvo mažesnė nei lygi nuliui. Jei dėl daugybos fono signalas tampa didelis, padauginto vaizdo kontrastą galima reguliuoti tomis pačiomis sąlygomis visuose mėginiuose.

Vėlesnei analizei buvo naudojamas dsDNR dažymo vaizdas, atėmus pakoreguotą padauginto Hsp60 ir histono H2B vaizdą. Naudojant „Adjust-Threshold“ funkciją, šie vaizdai buvo dvejetainiai. Mes pasirinkome dsDNR punktus, kurių dydis svyruoja nuo 2 iki 2 0 µm2 (apvalumas 0,1–1,0), ir jie buvo suskaičiuoti naudojant funkciją „Analyze-Analyze Particles“.

2.3. Elektroninė mikroskopija

Vieną dieną prieš transfekciją HeLa ląstelės buvo padengtos 600 ląstelių/µL tankiu. Dominančių genų ekspresija buvo nutildyta HeLa ląstelėse naudojant Stealth RNAi siRNA (Thermo Fisher Scientific) Lipofectamine RNAiMAX transfekcijos reagente (ThermoFisher Scientific) pagal gamintojo nurodymus (kai galutinė RNR koncentracija yra 10 nM).

Praėjus keturioms dienoms po siRNR numušimo, ląstelės buvo fiksuojamos. Ląstelių kultūros mėginiai buvo fiksuoti 2% PFA ir 2% glutaraldehidu 0.1 M fosfatiniame buferyje, pH 7,4, esant 37 ◦C, tada patalpinti į 4 ◦C šaldytuve 30 min. Mėginiai buvo fiksuoti 2 % glutaraldehido tirpale 0,1 M fosfatiniame buferyje per naktį 4 ◦C temperatūroje. Mėginiai tris kartus plaunami 0,1 M fosfatiniu buferiu 30 min. ir 1 valandą fiksuojami 2 % osmiumtetroksidu 0,1 M fosfatiniame buferyje 4 ◦C temperatūroje.

Mėginiai buvo dehidratuoti etanolio tirpalai, perkelti į dervą (Quetol{0}}, Nisshin EM Co., Tokijas, Japonija) ir polimerizuoti 60 ◦C temperatūroje 48 valandas. Polimerizuotos dervos buvo supjaustytos į itin plonas 70-nm pjūvius deimantiniu peiliu, naudojant ultramikrotomą (Ultracut UCT, Leica Microsystems, Wetzlar, Vokietija) ir tada sumontuotos ant varinių grotelių.

Sekcijos buvo nudažytos 2% uranilo acetatu kambario temperatūroje 15 minučių ir plaunamos distiliuotu vandeniu, po to antrinis dažymas švino dažymo tirpalu (Sigma-Aldrich, Tokijas, Japonija) kambario temperatūroje 3 minutes.

Tinkleliai buvo stebimi per perdavimo elektronų mikroskopą (JEM{0}}Plus, JEOL Ltd.., Tokijas, Japonija), esant 80 kV (zebrafish smegenys) arba 100 kV (ląstelė) pagreičio įtampai, ir vaizdai buvo įrašyti naudojant įkrovimo prijungto įrenginio (CCD) kamerą (EM-14830RUBY2, JEOL Ltd.) .

2.4. Imunoelektroninė mikroskopija

Aukso diskų mėginiai buvo užšaldyti skystame propane –175 ◦C temperatūroje. Po to, kai mėginiai buvo užšaldyti, jie buvo užšaldomi 1% tanino rūgšties etanolyje ir 2% distiliuoto vandens –80 ◦C temperatūroje 24 valandas.

Tada mėginiai buvo laikomi –20 ◦ C temperatūroje 4 valandas, po to 1 valandą inkubuojami 4 ◦ C temperatūroje. Tada mėginiai buvo dehidratuoti bevandeniame etanolyje 3 kartus 30 min. kiekvieną kartą, po to infiltruojama 50:50 etanolio dervos mišiniu (LR balta: London Resin Co. Ltd., Berkshire, UK) 4 ◦C temperatūroje 1 val. Mėginiai buvo perkelti į šviežią 100% dervą ir inkubuojami 4 ◦ C temperatūroje 30 minučių, o šis procesas buvo pakartotas tris kartus.

Mėginiai buvo perkelti į šviežią 100% dervą ir polimerizuoti esant 50 ◦ CO/N. Polimerizuotos dervos buvo itin plonos 90 nm pjūviais su deimantiniu peiliu, naudojant ultramikrotomą (Ultracut UCT; Leica), o sekcijos buvo dedamos ant nikelio grotelių. Tinkleliai buvo inkubuojami su anti-dsDNR antikūnu (35I9 DNR) (1/800, Abcam, Cat# ab27156, RRID: AB_470907) 1 % BSA/PBS, esant 4 ◦CO/N, po to tris kartus skalaujama 1 % BSA/PBS po 1 min.

Vėliau jie buvo inkubuojami su šiais įprastiniais antikūnais, konjuguotais su {{0}} nm aukso dalelėmis (ožkos anti-pelės IgG polikloninis kūnas), 2 valandas kambario temperatūroje. Po skalavimo PBS, grotelės buvo dedamos į 2% glutaraldehido 0, 1 M kakodilato buferį.

Po to tinkleliai buvo išdžiovinti ir 15 min. dažomi 2% uranilo acetatu ir 3 min. kambario temperatūroje švino dėmių tirpalu (Sigma-Aldrich). Tinkleliai buvo stebimi per perdavimo elektronų mikroskopą (JEM-1400). plius; JEOLLtd.) esant 100 kV pagreičio įtampai. Skaitmeniniai vaizdai buvo gauti naudojant CCD kamerą (EM-14830RUBY2, JEOL Ltd.).

3. Rezultatai

3.1. Sumažėjęs TFAM arba GBA sukelia negimdinės mitochondrijų DNR padidėjimą

Pirma, mes parodėme mitochondrijų kilmės citoplazminės DNR aptikimo pavyzdį HeLa ląstelėse, kuriose TFAM baltymas buvo numuštas siRNR (1A pav.). TFAM yra pagrindinis mitochondrijų transkripcijos faktorius ir taip pat veikia mitochondrijų DNR replikacijoje ir atstatyme [20]. .

Pranešama, kad šio geno sekos polimorfizmai yra susiję su Parkinsono liga [21, 22]. Po 3 dienų TFAM baltymų numušimo HeLa ląstelių citoplazmoje buvo aptikta daug dvigrandžių DNR taškų.

Histonai yra teigiami branduolinės kilmės DNR žymenys citoplazmoje, o neigiami žymenys – mitochondrijų DNR ir mitochondrijų kilmės DNR citoplazmoje [23]. Šie taškai nebuvo lokalizuoti kartu su histonais, o tai rodo, kad jie nebuvo iš branduolinės kilmės DNR. Be to, kai kurie iš šių citoplazminių, negimdinių DNR taškų nebuvo lokalizuoti kartu su Hsp60, mitochondrijų matricos žymekliu, o tai rodo, kad jie buvo už mitochondrijų ribų (1B, C pav.).

Elektroninė mikroskopija taip pat parodė, kad negimdinė DNR nutekėjo iš mitochondrijų (2A, B pav.). Apibendrinant galima pasakyti, kad negimdinių DNR taškų padidėjimas citoplazmoje dėl TFAM numušimo atsirado dėl mitochondrijų DNR nutekėjimo iš mitochondrijų. Antra, parodėme dar vieną iš mitochondrijų gautos citoplazminės DNR aptikimo pavyzdį HeLa ląstelėse, kuriose GBA baltymas buvo numuštas siRNR. (1A pav.).

GBA yra Gošė ligos sukėlėjas, tačiau heterozigotinė GBA mutacija taip pat yra Parkinsono ligos rizikos veiksnys [24]. Po 3 dienų GBA baltymų numušimo HeLa ląstelių citoplazmoje buvo aptikta daug dvigrandžių DNR taškų. Kai kurie DNR taškai buvo lokalizuoti kartu su histonais, o tai rodo, kad jie buvo iš branduolinės kilmės DNR.

Kiti DNR taškai nebuvo lokalizuoti kartu su histonais, o tai rodo, kad jie buvo ne iš branduolio gauta DNR, o iš mitochondrijų gauta DNR (1D pav.). Apibendrinant galima pasakyti, kad negimdinių DNR taškų padidėjimą citoplazmoje dėl GBA numušimo bent iš dalies lėmė mitochondrijų DNR nutekėjimas iš mitochondrijų.

For more information:1950477648nn@gmail.com