Abstraktus:Pagrindinis šio tyrimo tikslas – taikant diferencinę analizę, įvertinti trijų Fusarium oxysporum jautrių arba atsparių datulių palmių veislių alkoholinių ekstraktų bendro fenolių kiekio įvairų biologinį aktyvumą. sp Albidinis. Čia antioksidacinių ir bioaktyvių savybių turintys stilbeno produktai buvo įrodyti atsparioje Taabdount (TAAR) veislėje. Be to, TAAR atsparios datulių palmių veislės metanolinėje frakcijoje yra reikšmingas produktas, nustatytas LCMS/MS ir 1H, 13C BMR, priklausantis hidroksistilbenų šeimai, pasižymintis antioksidacinėmis savybėmis, slopinantis grybų tirozinazės aktyvumą ir aktyvinantis. ir daro apsauginį poveikį hipochlorito sukeltai žalai žmogaus odos fibroblastų senėjimo ląstelių 20S proteasomoje. Apskritai, dabartiniai rezultatai rodo, kad hidroksitoluenas, esantis atsparioje Phoenix dactylifera L., turi būti ištirtas, siekiant suprasti, kaip stilbenas gali turėti senėjimą stabdantį poveikį.

Cistanche glikozidas taip pat gali padidinti SOD aktyvumą širdies ir kepenų audiniuose ir žymiai sumažinti lipofuscino ir MDA kiekį kiekviename audinyje, efektyviai pašalindamas įvairius reaktyvius deguonies radikalus (OH-, H2O₂ ir kt.) ir apsaugodamas nuo DNR pažeidimo. OH-radikalais. Cistanche feniletanoidiniai glikozidai pasižymi stipriu laisvųjų radikalų šalinimo gebėjimu, didesne redukcine galia nei vitaminas C, pagerina SOD aktyvumą spermos suspensijoje, mažina MDA kiekį ir turi tam tikrą apsauginį poveikį spermos membranos funkcijai. Cistanche polisacharidai gali sustiprinti SOD ir GSH-Px aktyvumą eksperimentiškai senstančių pelių eritrocituose ir plaučių audiniuose, kuriuos sukelia D-galaktozė, taip pat sumažinti MDA ir kolageno kiekį plaučiuose ir plazmoje bei padidinti elastino kiekį. geras sugeriantis poveikis DPPH, pailgina senstančių pelių hipoksijos laiką, pagerina SOD aktyvumą serume ir lėtina fiziologinę plaučių degeneraciją eksperimentiškai senstančiose pelėse Dėl ląstelių morfologinės degeneracijos, eksperimentai parodė, kad Cistanche pasižymi geru antioksidaciniu gebėjimu. ir gali būti vaistas, skirtas odos senėjimo ligų prevencijai ir gydymui. Tuo pačiu metu Cistanche esantis echinakozidas turi didelį gebėjimą sunaikinti DPPH laisvuosius radikalus ir geba pašalinti reaktyviąsias deguonies rūšis ir užkirsti kelią laisvųjų radikalų sukeltam kolageno skaidymui, taip pat turi gerą atkuriamąjį poveikį timino laisvųjų radikalų anijonų pažeidimams.

Spustelėkite rou cong rong pranašumus

【Daugiau informacijos:george.deng@wecistanche.com / WhatApp:86 13632399501】

Raktiniai žodžiai:Phoenix dactylifera L.; Fusarium oxysporum. sp Albidinis (FoA); antioksidacinė veikla; antitirozinazės aktyvumas; proteasomų aktyvinimas; LC-MS/MS analizė; stilbeno dariniai

1. Įvadas

Datulinė palmė (Phoenix dactylifera L.) – daugiametis vienaskiltis iš Arecaceae šeimos. Šis medis yra nepaprastai svarbus Pietų ir Pietryčių Maroko Sacharos gyventojų gyvenimui tiek ekonominiu, tiek socialiniu požiūriu. Bayoud liga, kurią sukelia dirvožemio grybelis Fusarium oxysporum f. sp Albidinis (FoA) [1], pastaraisiais metais žymiai sumažino Maroko datulių palmių derlių [2]. Apskaičiuota, kad FoA išnyko iš dviejų trečdalių Maroko fenicikolių paveldo, bet ir toliau sunaikina nuo 4,5 iki 12 procentų aukščiausios kokybės komercinių datulių palmių veislių [2]. Buvo įdėta daug pastangų siekiant kovoti su šia liga ir paaiškinti kai kuriuos datulių palmių apsaugos mechanizmus [3]. Pirmieji galimų datulinio palmių apsaugos mechanizmų tyrimai išryškino fenolinių junginių ir antioksidacinio pajėgumo vaidmenį toleruojant FoA [4,5]. Atsparių ir jautrių šaknų fenolio junginių veislių biocheminė analizė buvo pirmasis biocheminis tyrimas, išaiškinęs datulių palmių apsaugos mechanizmų naudą. Iš tiesų, literatūroje nurodoma, kad atsparių šaknų veislės yra turtingesnės 5-kofeoilšikimo rūgšties ir jos padėties izomerų nei jautrių šaknų veislės [5]. Šie junginiai veiksmingai parodė galimą priešgrybelinį poveikį in vitro prieš FoA [6].

Didelis natūralių antioksidantų gebėjimas sunaikinti laisvuosius radikalus yra tai, kas lemia didėjantį jų populiarumą maisto ir medicinos studijose [7–10].

Pavyzdžiui, reaktyviosios deguonies rūšys yra apsunkinantys ląstelių pažeidimo ir senėjimo procesų veiksniai [11], todėl yra susiję su daugeliu ligų. Dėl to antioksidantų molekulės gali padėti žmonių sveikatai, nes užkerta kelią degeneracinėms ligoms ir lėtina senėjimo pasekmes [12]. Šiame tyrime mus domina antioksidantų gebėjimas skatinti 20S-proteasomos aktyvaciją ir apsaugoti nuo oksidacinės pažaidos. Proteasoma iš tikrųjų prisideda prie ląstelių homeostazės palaikymo, leisdama ląstelei išvalyti pažeistus baltymus ir kontroliuojamą trumpalaikių baltymų naikinimą [13]. Todėl proteasomos aktyvinimas antioksidantais gali būti nauja kovos su senėjimu strategija [14]. Be to, šiuo darbu siekiama ištirti FoA atsparių šaknų, kaip aktyvių biologinių junginių, fenolio kiekio potencialą.

2. Medžiagos ir metodai

2.1. Augalo pavyzdys

Tyrimas buvo atliktas kiekvienam mėginiui su medžiaga iš 1 0 suaugusių datulių palmių veislių (Phoenix dactylifera L.), išaugintų iš užterštų arba neužterštų sklypų, esančių Palmaria Figuig, Pietryčių Maroke. Imlių veislių, tokių kaip charas Bouffegous infected (BI) arba neužkrėstos (BNI), pagrindinės šaknys (įskaitant jų šaknis, kurios kvėpuoja oru) yra nuo 0,5 iki 2 cm skersmens. Be to, buvo surinkta FoA atspari Taabdount (TAAR) veislė, o dviejų vaistinių augalų lapai buvo naudojami kaip profilaktinis gydymas nuo FoA. Be to, tame pačiame neužterštoje sklype taip pat buvo surinkti rozmarinai (R, Rosmarinus officinalis) ir granatai (G, Punica granatum L.) [15], išanalizuoti ir naudoti kaip kontrolė. Mėginiai buvo paimti per du metų laikotarpius – rugsėjį ir sausio pabaigoje (nuo 2013 m. iki 2015 m.) ir hermetiškai laikomi kambario temperatūroje. Kadangi pavyzdžiai buvo paimti iš palmerio, jie yra tinkamai sertifikuoti (identifikuoti ir klasifikuoti) Maroko žemės ūkio ministro [16].

2.2. Ištraukų ruošimas

Po kruopštaus plovimo vandeniu šaknys arba lapai buvo išdžiovinti pavėsyje, tada sumalami maišytuve. Kiekvienam mėginiui (BI, BNI, TAAR, R ir G) į 1 g sausos medžiagos buvo įpilta 10 ml metanolio ir palikta maišyti 4 valandas kambario temperatūroje. Tada jie buvo filtruojami ir išgarinami 37 ◦C temperatūroje sukamuoju garu. Sausas ekstraktas buvo patalpintas į metanolio tirpalą, kurio galutinė koncentracija buvo 10 mg/ml arba 50 mg/ml (vėliau panaudota biologiniam aktyvumui in vitro tirti). Biologinio aktyvumo tyrimams buvo atlikti trys nepriklausomi kiekvieno mėginio ekstraktai.

2.3. Biologinė veikla

2.3.1. Fenolio kiekis ir antioksidacinė veikla

Procedūra, aprašyta Nacoulma ir kt. buvo pritaikytas bendram fenolių kiekiui ir bendram flavonoidų kiekiui kiekviename ekstrakte įvertinti [17], galutinai pritaikant 200 µL tūrį, kad būtų galima naudoti mikroplokštelių skaitytuvą. Absorbcija, esant atitinkamai 760 nm ir 510 nm, buvo nustatyta pagal tuščiąjį metanolio mėginį. Standartinės galio rūgšties (0–300 mg/L) (y=0,0083x plius 0,9106, r2=0,978) ir kvercetino (0–100 mg/L) (y {{14) kalibravimo kreivės buvo naudojami atitinkamai }}.0008x plius 0,0597, r2=0.994).

Naudojant 1,1-difenil-2-pikrilhidrazilo laisvąjį radikalą, buvo ištirtas antioksidacinis aktyvumas (DPPH). Naudojant galutinį tūrių pritaikymą atitinkamai 300 µL ir 275 µL, kad būtų naudojamas mikroplokštelių skaitytuvas, buvo įvertintas ekstraktų gebėjimas sumažinti geležies (III) kiekį, kaip aprašyta Nacoulma ir kt. [17]. Palyginti su tuščiuoju metanolio mėginiu, absorbcija buvo išmatuota atitinkamai 517 nm ir 700 nm. Tada, naudojant šią lygtį, kiekvieno tirpalo laisvųjų radikalų šalinimo aktyvumas buvo įvertintas kaip slopinimo procentas:

Standartinė kalibravimo kreivė buvo gauta naudojant askorbo rūgštį ({{0}}–100 mg/L) kaip antioksidanto standartą (y=0.0014x plius 0.0875, r2=0.998).

2.3.2. FoAMyc helio augimo slopinimo tyrimas

Su nedideliu pakeitimu, metodas, aprašytas Neri ir kt. [18] buvo naudojamas nustatyti, kiek grynos cheminės medžiagos slopina FoA grybienos augimą. 7-Dienos senumo FoA kultūroje penki milimetrai grybienos diskų buvo dedami ant Petri lėkštelių su PDA terpe, papildyta aukščiau išvardytomis grynomis cheminėmis medžiagomis 50, 75 ir 100 µg/ml. Plokštelės buvo inkubuojamos 5 dienas 28 °C temperatūroje. FoA grybienos augimo slopinimui įvertinti buvo naudojamas vidutinis kolonijos skersmuo, išmatuotas dviem stačiais kampais. Kiekvieną gydymą sudarė trys bandymai, naudojant tris skirtingas FoA padermes: FoA 41818, FoA 41814 (BCCM, Belgija) ir FoA Local (Palemeraie of Figuig, Marokas), taip pat neigiama kontrolė naudojant terpę, kuri nebuvo pridėta.

2.3.3. Ląstelių gyvybingumas ir 20S proteasomų aktyvumas

Buvo naudojami įprasti žmogaus odos fibroblastai iš {{0}}metų vyro (NHDF) (Promocell, Heidelbergas, Vokietija), o ląstelės buvo patalpintos 100,{{3 }} ląstelių/ml RPMI 10 procentų, papildytų 10 procentų (m/t) FBS, 1 procentu (m/t) L-glutamino, 100 vienetų/ml penicilino ir 100 µg/mL streptomicino. Jie buvo laikomi baltose arba skaidriose 96-mikrošulinėlių plokštelėse 24 valandas 37 ◦C temperatūroje inkubatoriuje su drėgna 5 procentų CO2 aplinka. Proteasomų aktyvumo tyrimui, taip pat apsauginiam poveikiui hipochlorito sukeltam pažeidimui įvertinti, ląstelės buvo apdorotos tiriamosiomis medžiagomis (grynas junginys nuo 5 iki 50 µg/ml, teigiama 0,5 ir (arba) 1 µM kontrolė, ir metanolinius augalų ekstraktus nuo 15 iki 50 µg/mL) 24 val. su ne daugiau kaip 0,3 procento galutinės koncentracijos DMSO, vienu metu, be pakeitimų, atsižvelgiant į neigiamą kontrolę. Tiriant TAAR ekstrakto arba grynų junginių apsauginį poveikį proteasomų aktyvumui, vėliau fibroblastų ląstelės buvo veikiamos 50 µM OCl− 35 min. (pasirinktos kaip optimalios, be toksiškumo ląstelėms, 20S proteasomos būklės oksidantas-inhibitorius) [19]. Šie eksperimentiniai etapai buvo užbaigti pagal tiekėjo metodiką (Proteasome-Glo Chymotrypsin Like Cell-Based Assay, Promega Corporation, JAV): Pirma, lygiagretus ląstelių gyvybingumo eksperimentas, kuriame naudojami kristalai violetiniai kolorimetriniai arba MTT tyrimai, kurie buvo atlikti visiškai panašiomis sąlygomis. buvo naudojamas šiam ląstelių bioliuminescencijos tyrimui normalizuoti. Rodomi standartiniai nuokrypiai ir vidutinė fluorescencija trijų mėginių iš dviejų atskirų bandymų (n=6). Visi matavimai ir nepriklausomi eksperimentai (n=2) buvo atlikti du kartus.

2.3.4. Slopinamasis poveikis grybų be ląstelių tirozinazei

Norint ištirti poveikį fermentų aktyvumui, tiriamos medžiagos (grynieji antioksidantai arba metanoliniai augalų ekstraktai) buvo iš anksto inkubuojamos su fermentais fosfatiniame buferyje kambario temperatūroje. Trumpai tariant, 300 ml 5 mM L-DOPA tirpalo su 50 mM fosfatiniu buferiu (pH 6,5) su arba be įvairių koncentracijų tiriamųjų medžiagų buvo pridėta 96-šulinėlių mikroplokštelė kartu su 100 ml grybų tirozinazės vandeninio tirpalo (20 vienetų). 40 minučių tyrimo mišinys buvo inkubuojamas 25 ◦C temperatūroje. Po inkubacijos reakcijos mišinio dopachromo gamybos lygis buvo matuojamas spektrofotometriškai, esant 492 nm [20]. Standartinė kalibravimo kreivė buvo nubrėžta naudojant galo rūgštį (0–1000 µg/mL) (y=–0,087 × plius 0,45; r2=0,97). Kiekvienas nepriklausomas matavimas ir eksperimentas (n=2) buvo atlikti du kartus.

2.4. Analizės, išskyrimas ir struktūros išaiškinimo procedūros

Sumalta šaknis (20 g) ekstrahuota 200 ml metanolio, maišoma 24 valandas kambario temperatūroje, filtruojama, centrifuguojama 10,000 × g 15 min., o po to sukamuoju prietaisu išgarinama 35 ◦C temperatūroje. vakuuminis garinimo aparatas. Neapdorotas ekstraktas buvo praskiestas 20 ml distiliuoto vandens, pakartotinai ekstrahuotas 2 × 20 ml etilo acetato, o po to sukoncentruotas naudojant rotacinę vakuuminio garinimo sistemą 35 °C temperatūroje. Pagrindinis produktas buvo išgrynintas preparatine HPLC, naudojant Waters C18 kolonėlę (SymmetryPrep 150 × 19 mm, 7 µm dalelių dydis) su tomis pačiomis aukščiau nurodytomis LC gradiento sąlygomis ir 5 ml/min srauto greičiu. Aukščiausia temperatūra kambario temperatūroje buvo tarp 38,8 ir 40,8 min., surinkta tarp 39,2 ir 40,2 min. visas surinkimo tūris buvo liofilizuotas, kad gautų 27 mg junginio. Tada MS ir BMR 1H ir 13C jį identifikavo.

Analizės buvo atliktos naudojant greitos skiriamosios gebos LC 1200 serijos sistemą, naudojant diodų matricos detektorių (DAD), naudojamą UV spektrams stebėti esant 320 nm (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, JAV). Junginys buvo atskirtas Beckman C18 kolonėlėje (ULTRASPHERE 250 mm × 4,6 mm, 5 µm dalelių dydis), naudojant 47 min gradientą 10 mM amonio acetato/0,2 proc. skruzdžių rūgšties vandenyje (v/v), pH 2,9 ({{) 13}}tirpiklis A) ir 30/70 acetonitrilo/metanolio mišinys (=tirpiklis B). Srauto greitis buvo 0,8 ml/min., o tirpiklis B buvo padidintas nuo 5 iki 35 procentų per 45 minutes ir iš naujo subalansuotas 2 minutes. Serijoje su DAD ESI-QTOF 6520 serija (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, JAV) buvo naudojama didelės raiškos MS ir tikslinei tandeminei MS (MS / MS) analizei. Spektrai buvo paimti neigiamu ir didelės raiškos (4 GHz) gavimo režimu.

1H BMR ir 13C BMR spektrai buvo užfiksuoti Bruker Avance 300 spektrometru, veikiančiu 300 MHz dažniu. Laisvieji indukcijos skilimai buvo apdoroti naudojant MestreNova 5.3.2 NMR rinkinį iš MestreLab Research SL.

2.5. Statistinė analizė

Visi nepriklausomi eksperimentai buvo atlikti trimis egzemplioriais. Visi duomenys buvo pateikti kaip vidutinės vertės ± SD. Naudojant GraphPad Prism programos 6 versiją, rezultatai buvo analizuojami naudojant neparametrinį Kruskal-Wallis testą kartu su Dunn daugkartinio palyginimo testu. p-reikšmės 0,05 ir mažesnės yra laikomos reikšmingomis.

3. Rezultatai ir aptarimas

3.1. Bendras fenolio ir flavonoidų kiekis metanolio ekstraktuose

Nustatyta, kad dėl savo redoksinių savybių augalų fenoliniai junginiai turi įvairų biologinį poveikį, įskaitant antioksidacinį aktyvumą [21]. 1 lentelėje parodytas bendras fenolio kiekis metanolio šaknų ekstraktuose (500 µg/mL) ghagras Bouffegous užkrėstų (BI) ir neužkrėstų (BNI) FoA arba atsparių Taabdount (TAAR) veislių. Jų koncentracija svyravo nuo 171 ± 14 iki 253 ± 47 mg galo rūgšties ekv./g. Didžiausias šių junginių kiekis rastas BNI veislėje, o mažiausia koncentracija – BI metanolio šaknų ekstrakte. Flavonoidų skaičius tuose pačiuose ekstraktuose (1 lentelė) svyravo nuo 240 ± 25 iki 406 ± 66 mg kvercetino ekv./g, ir vėlgi didžiausias kiekis buvo priskirtas BNI veislei. Tarp neužkrėstų (BNI) veislių ir užkrėstų (BI) arba atsparių (TAAR) veislių FoA prarandama maždaug 1/3 viso polifenolių ir flavonoidų kiekio. Todėl verta patikrinti, kaip junginių praradimas, apibūdinamas kaip esminis augalo antioksidaciniam pajėgumui, gali paveikti mus dominančią biologinę veiklą.

3.2. Metanolio ekstraktų antioksidacinis potencialas

DPPH radikalų šalinimo aktyvumas yra metodas, plačiai naudojamas augalų ekstraktų antioksidaciniam aktyvumui patikrinti [22]. Šis bandymas nustato, ar ekstraktuose esančios antioksidacinės cheminės medžiagos gali sunaikinti stabilias radikalų rūšis DPPH. Eksperimentiniai duomenys (1 pav.) atskleidžia, kad visi metanoliniai ekstraktai (100 arba 500 µg/mL) gali sunaikinti laisvuosius radikalus, kurių didžiausias DPPH pašalinimo aktyvumas, pastebėtas TAAR šaknyse (87,0). procentas DPPH slopinimo). Atrodo, kad antioksidacinis aktyvumas nepriklauso nuo bendro polifenolinių ar flavonoidinių junginių kiekio. Tačiau geresnis TAAR šaknų metanolinių ekstraktų aktyvumas gali būti dėl to, kad ekstrakte yra daugiau vandenilį dovanojančių komponentų.

Redukcinė galia vertinama pagal metanolio ekstrakto gebėjimą paversti Fe (III) į Fe (II). Šis gebėjimas redukuoti Fe (III) gali būti siejamas su fenolio junginiuose esančių hidroksilo grupių skaičiumi ir padėtimi bei jų gebėjimu atiduoti vandenilį [23]. 2 lentelėje parodytas mūsų augalų mėginių metanolinių ekstraktų redukcinis aktyvumas, palyginti su askorbo rūgštimi kaip standartine. TAAR šaknų metanoliniai ekstraktai turi daug redukcijos (95 ± 1 mg askorbo rūgšties ekv./g), o mažiausias kiekis buvo gautas BNI šaknų ekstraktuose (27 ± 2 mg askorbo rūgšties ekv./g).

Gautiems rezultatams koreliuoti atlikta regresinė analizė (koreliacijos koeficientas (R)). Nustatyta reikšminga tiesinė koreliacija tarp bendro fenolio ir flavonoidų kiekio (R {0}}.849, p < 0.05) ir tarp DPPH ir redukcinės galios tyrimo (R=0). 816, p < 0,05), tačiau tarp fenolio ar flavonoidų kiekio metanolio ekstraktuose ir jų antioksidacinio aktyvumo nebuvo. Galiausiai, visi metanolio ekstraktai pasižymėjo reikšmingu antioksidaciniu aktyvumu prieš DPPH radikalų šalinimo aktyvumą ir mažinančios galios tyrimą, tačiau atrodo, kad ši antioksidacinė veikla nesusijusi su bendru fenolio ar flavonoidų kiekiu. Todėl šios išvados rodo, kad tam tikros rūšies cheminė medžiaga, o ne fenolio ar flavonoidinių junginių kiekis, randamas įvairiuose mūsų ekstraktuose, greičiausiai yra atsakingas už peržiūrimų augalų ekstraktų antioksidacinį aktyvumą. Kai kurie anksčiau aprašyti fenoliniai komponentai, kurie yra labai aktyvūs asmenys, taip pat gali turėti įtakos augalų ekstraktų antioksidaciniam aktyvumui: Nepriklausomai nuo jų koncentracijos, brandintame raudonajame vyne esantys fenoliniai junginiai gali pasižymėti įvairiomis antiradikalinėmis savybėmis, susijusiomis su jų struktūriniais aspektais. 24].

TAAR FoA atspari veislė pasižymi didžiausiu antioksidaciniu aktyvumu tarp skirtingų datulių palmių veislių. Remiantis literatūra, šių konkrečių datulių palmių atsparumo išsivystymas gali būti siejamas su skirtingų padėties kofeoilšikimo rūgšties izomerų kiekio padidėjimu [5].

3.3. Grybų tirozinazės aktyvumas

Grybų tirozinazės difenolazės aktyvumas katalizuoja dviejų dopachinono darinių oksidaciją, dėl kurios susidaro melanino sintezė. 3 lentelėje pateikti rezultatai rodo, kad TAAR, BI ir BNI metanoliniuose ekstraktuose esantys junginiai gali trukdyti l-DOPA hidroksilinimui slopinant grybų tirozinazės aktyvumą. Be to, šie rezultatai rodo, kad TAAR metanolinis ekstraktas grybų tirozinazės aktyvumui statistiškai yra aktyvesnis nei BI (p < 0.05) ir BNI (p < 0,05). Taigi, atrodo, kad palmių datulių šaknų ekstraktų gebėjimas slopinti tirozinazės aktyvumą atitinka tą pačią tendenciją, kaip ir antioksidacinių savybių.

Tirozinazės pirmiausia yra susijusios su odos, akių ir plaukų pigmentacija. Iš tiesų, tirozinazės yra melanogenezės fermentai, dalyvaujantys pirmuosiuose melanino biosintezės etapuose, o melaninas yra susijęs su apsauga nuo ultravioletinių (UV), saulės ar gama spindulių, sumažėjusiu ląstelių jautrumu ir ląstelių sienelių atsparumu hidroliziniams fermentams [20]. Ir atvirkščiai, per didelė melanino gamyba gali turėti įtakos odos anomalijų ar rimtesnių ligų, tokių kaip vėžys (pvz., Melanoma), o dopachinono perteklius gali sukelti neurodegeneracinę ligą (pvz., Parkinsono ligą) [20, 25]. Be to, buvo pranešta, kad melanogenezė gamina vandenilio peroksidą ir kitus ROS, todėl žmogaus melanocitai patiria didelį oksidacinį stresą [26]. Keletas natūralių antioksidantų junginių (fenoliai, flavonoidai ir kiti), gauti iš augalų, slopino tirozinazės fenolazės aktyvumą [27,28]. Atrodo, kad TAAR ekstrakte yra junginio (-ių), kuris (-iai) gali slopinti odos senėjimą ir melanogenezę.

3.4. Metanolinių datulių palmių ekstraktų proteasominė veikla

Buvo pranešta, kad padidėjęs 20S proteasomos kiekis padidina toleranciją oksidaciniam stresui [13]. Todėl buvo tiriamas proteasomų aktyvumo reguliavimas BI, BNI ir TAAR veislių šaknų ekstraktais. Išmatuotas 20S proteasomos aktyvumas yra susijęs su chimotripsino tipo (CT-L) aktyvumu NHDF senėjimo ląstelėse (žr. Medžiagos ir metodai). Kaip parodyta 2A paveiksle, ląstelės, apdorotos 50 µg/ml metanolio ekstraktų 24 valandas, reikšmingai suaktyvino BI ir TAAR ekstraktų CT-L ir slopino BNI, nesukeldamos daugiau nei 30 procentų toksiškumo ląstelėms. TAAR šaknų ekstraktas parodė patrauklų proteasomų aktyvavimą, palyginti su 1 µM lipoinės rūgšties (Ct plus ) (atitinkamai 212 proc. ir 248 proc.). Proteasoma yra cilindrinis proteinazės kompleksas, turintis keturių sukrautų žiedų šerdį, atsakingą už nenormaliai suskaidytų (26S) proteasomų ir oksidaciniu būdu (20S proteolitinio šerdies komplekso) pažeistų baltymų pašalinimą (Ciechanover, 1998). Kaip parodyta Hwango darbe [29], proteasomų disfunkcija gali prisidėti prie žmogaus odos senėjimo. Iš tiesų, buvo įrodyta, kad senėjimo ir dauginimosi senstančios ląstelės sumažino proteasomų aktyvumą ir proteasomų subvienetų baltymų kiekį. Tai, kad šiose ląstelėse dažniau kaupiasi ir oksiduoti, ir (arba) pažeisti ląstelių baltymai, rodo, kad ubikvitino ir proteasomos baltymų skilimo kelias yra susijęs su vidiniais senėjimo procesais. 2B ir C paveikslai rodo TAAR metanolinio ekstrakto gebėjimą apsaugoti NHDF senas ląsteles nuo 20S proteasomų aktyvumo slopinimo OCl-oksidantu. Iš tiesų, OCl- oksidantas 50 procentų slopina kontrolinių ląstelių (Ct) proteasomų aktyvumą, o didžiausias 20S proteasomų aktyvatorius (lipoinė rūgštis, esant 1 µM, Ct plius), turintis daugiau nei 50 procentų slopinimo aktyvumo, nesugeba panaikinti slopinimo. 20S proteasomos aktyvumo OCl−, tuo tarpu visos kitos tirtos koncentracijos (15, 50 ir 75 µg/mL) TAAR metanolinio ekstrakto, atrodo, panaikina šį slopinimą (nuo 0 iki 19 procentų slopinimo). Šie rezultatai rodo, kad TAAR šaknų ekstraktuose gali būti molekulių, kurios gali sulėtinti odos senėjimą ne tik padidindamos proteasomų aktyvumą, bet ir neutralizuodami oksiduojančių medžiagų slopinamąjį poveikį. Tarp šių molekulių greičiausiai yra kafeoilšimiko rūgšties, taip pat kitų junginių. Be to, buvo atliktos LC-DAD-MS (MS) ir BMR analizės, siekiant nustatyti pagrindinius ekstraktų junginius, ir jie aptariami kitame skyriuje.

3.5. Spektrometrinės analizės

3.5.1. Metanolinių ekstraktų LC-DAD-MS analizė

Lyginamasis datulių palmių šaknų tyrimas neatskleidė kokybinių skirtumų, bet vietoj to tam tikru mastu buvo pastebėti pusiau kiekybiniai skirtumai (DAD ir MS chromatogramose) tarp veislių (3A, D pav.). Iš tiesų, dabartiniai rezultatai neleidžia susieti datulinių palmių atsparumo skirtingų kafeoilo šikimo rūgšties izomerų padėties padidėjimui, nes atspari veislė (TAAR) rodo mažiausią santykinį šių junginių gausą (3C pav.). Visi trys kafeoilo šikimo rūgšties (m/z=335.0768 su 1,2 ppm paklaida) padėties izomerai buvo identifikuoti pagal jų MS/MS spektrus (S6 pav.) su fragmentu ties m/z 179,0340, atitinkantis kavos rūgšties fragmentą A (C9H7O4) ir fragmentą, kurio m/z yra 135,0443, atitinkantį kavos rūgšties (C8H7O2) dekarboksilinimą. Nepaisant to, kitas junginys, neatitinkantis kafeoilo šikimiko rūgščių (3C pav.) ir kurio sulaikymo laikas yra 29 min., kai m/z=259.0607 (arba 373.0543 TFA aduktui), yra aiškiai atskirtas tarp skirtingų veislių. (3D pav.). Šio junginio kaupimosi jautrių ir atsparių veislių šaknyse skirtumas (0,135 proc.), kurio santykis yra apie 1:35 (nuo m/z=259.06, MS duomenys), gali paaiškinti svarbią biologinę šios šaknies metanolio ekstrakto veikla.

【Daugiau informacijos:george.deng@wecistanche.com / WhatApp:86 13632399501】